Voorspellende immuunmodellering van vaste tumoren

Samenvatting

Het gebruik van een RNA-gebaseerde benadering om kwantitatieve immuunprofielen van vaste tumorweefsels te bepalen en klinische cohorten te benutten voor immuun-oncologische biomarkerontdekking wordt beschreven door middel van een moleculaire en informaticaprotocollen.

Samenvatting

Immunotherapieën tonen belofte bij de behandeling van oncologische patiënten, maar complexe heterogeniteit van de tumormicroomgeving maakt het voorspellen van de respons op de behandeling uitdagend. Het vermogen om de relatieve populaties van immuuncellen in en rond het tumorweefsel op te lossen, is aangetoond dat het klinisch relevant is voor het begrijpen van de respons, maar wordt beperkt door traditionele technieken zoals flow cytometrie en immunohistochemie ( IHC), vanwege de grote hoeveelheid weefsel die nodig is, gebrek aan nauwkeurige cel type markers, en vele technische en logistieke hindernissen. Een test (bijvoorbeeld de ImmunoPrism Immune Profiling Assay) overwint deze uitdagingen door het opvangen van zowel kleine hoeveelheden RNA en sterk gedegradeerd RNA, gemeenschappelijke kenmerken van RNA geëxtraheerd uit klinisch gearchiveerd solide tumorweefsel. De test wordt geopend via een reagent kit en cloud-based informatica die een end-to-end kwantitatieve, high-throughput immuno-profiling oplossing biedt voor Illumina sequencing platforms. Onderzoekers beginnen met zo weinig als twee secties van formaline-vaste paraffine-embedded (FFPE) weefsel of 20-40 ng van de totale RNA (afhankelijk van de kwaliteit van het monster), en het protocol genereert een immuunprofiel rapport kwantificeren acht immuunceltypes en tien immuun ontsnappen genen, het vastleggen van een compleet beeld van de tumor micro-omgeving. Er is geen aanvullende bio-informaticaanalyse nodig om gebruik te maken van de resulterende gegevens. Met de juiste steekproefcohorten kan het protocol ook worden gebruikt om statistisch significante biomarkers te identificeren binnen een patiëntenpopulatie van belang.

Inleiding

Kwantificering van tumor-infiltrerende lymfocyten (IL's) en andere immuungerelateerde moleculen in formaline-fixed en paraffine embedded (FFPE) solid tumor human tissue samples has demonstrateed value in clinical research^1,2,3. Gemeenschappelijke technieken zoals flow cytometrie en eencellige ribonucleic acid (RNA) sequencing zijn nuttig voor vers weefsel en bloed^4,maar zijn ongeschikt voor analyse van FFPE materialen als gevolg van het onvermogen om levensvatbare celsuspenss te creëren. De huidige methoden die zijn gebruikt om deze cellen in FFPE-weefsel te kwantificeren, lijden aan grote uitdagingen. Immunohistochemie (IHC) en andere soortgelijke imaging workflows vereisen specifieke antilichamen om cel-oppervlakte eiwitten te detecteren, die moeilijk te standaardiseren kunnen zijn tussen laboratoria om reproduceerbare kwantificering mogelijk te maken⁵. Platforms zoals het nCounter-systeem vertrouwen op de expressie van afzonderlijke genen om belangrijke immuuncellen te definiëren^6,waardoor de gevoeligheid en specificiteit van detectie worden beperkt. Meer generieke RNA sequencing methoden, in combinatie met standalone software tools, zijn beschikbaar, maar vereisen aanzienlijke optimalisatie en validatie voorafgaand aan het gebruik^{7,8,9,10,11,12}. Recente vooruitgang in het combineren van laser capture microdissectie (LCM) met RNA sequencing voor FFPE weefsel heeft aangetoond belofte; er is echter een meer krachtige, turnkey-oplossing nodig voor translationele studies die gericht zijn op het identificeren van robuuste biomarkers^13,14. Methoden om multidimensionale biomarkers te genereren, zoals Predictive Immune Modeling, die patiëntencohorten definiëren, waaronder therapieresponders, subtypen van kanker of overlevingsresultaten met een hoge voorspellende nauwkeurigheid en statistische significantie, worden steeds belangrijker in het tijdperk van precisiegeneeskunde en immunotherapie^15,16.

Om aan deze behoefte tegemoet te komen, werd een immuunprofileringstest ontwikkeld om gevoelige en specifieke kwantificering van immuuncellen in vast tumor FFPE-weefsel mogelijk te maken met behulp van gestandaardiseerde RNA-sequencing reagentia en cloudgebaseerde informatica. Naast de opvang van gedegradeerd RNA uit FFPE-weefsel, is het protocol in staat om RNA te huisvesten dat is afgeleid van het beperken van weefselmonsters zoals kernnaaldbiopten, naaldpiraten en micro- of macro-ontleed weefsel. RNA-gegevens van elk monster worden vergeleken met een database van genexpressiemodellen van immuuncellen, genaamd immune Health Expression Models, om immuuncellen te kwantificeren als een percentage van de totale cellen die in het monster aanwezig zijn. Kortom, deze modellen werden gebouwd met behulp van machine-learning methoden om unieke multigene expressie patronen te identificeren uit whole-transcriptome gegevens gegenereerd uit gezuiverde immuuncelpopulaties (geïsoleerd met behulp van canonieke cel-oppervlak markers)^17,18. De multidimensionale Health Expression Modellen die aan de technologie ten grondslag liggen, stelt de test in staat om elke immuuncel te kwantificeren als een procent van de totale cellen die aanwezig zijn in het heterogene mengsel. Dit stelt de onderzoeker in staat om inter- en intra-sample immuuncelvergelijkingen te genereren, waarvan is aangetoond dat ze klinische waarde^{hebben 19,20}. Andere toepassingen zijn kwantificering van de immuunrespons voor en na de behandeling, zoals beschreven in de representatieve resultaten. De test rapporten over meerdere kenmerken van immuun contexture van de tumor en tumor micro-omgeving met inbegrip van de absolute percentages van acht immuunceltypes (afgeleid van genexpressie modellen): CD4⁺ T cellen, CD8⁺ T cellen, CD56⁺ Natural Killer cellen, CD19⁺ B cellen, CD14⁺ monocyten, Tregs, M1 macrofagen, en M2 macrofagen. Bovendien rapporteert de test de uitdrukking (in transcripties per miljoen, of TPM) van tien immuunvluchtgenen: PD-1, PD-L1, CTLA4, OX40, TIM-3, BTLA, ICOS, CD47, IDO1 en ARG1.

De reagent kit wordt gebruikt om bibliotheken van hoge kwaliteit klaar te maken voor sequencing op een Illumina-platform volgens een hybride op capture gebaseerde bibliotheekbereidingsmethode, zoals weergegeven in figuur 1. Als een onderzoeker geen Illumina sequencing-platform in zijn laboratorium heeft, kunnen hij zijn monsters voor sequencing indienen bij een kernlaboratorium. Eenmaal gegenereerd, sequencing gegevens wordt geüpload naar de Prism Portal voor geautomatiseerde analyse, en een uitgebreid, kwantitatief profiel voor elk individueel monster, in de vorm van het Immune Report(Figuur 2A), wordt teruggestuurd naar de gebruiker. Gebruikers kunnen ook voorbeeldgroepen definiëren in de Prism Portal om een Biomarker Report(figuur 2B)te genereren, waarbij statistisch significante biomarkers worden gemarkeerd die twee patiëntcohorten onderscheiden. Belangrijk is dat de gegevens die door de reagentkit worden gegenereerd, alleen voor onderzoek zijn gebruikt en mogelijk niet voor diagnostische doeleinden worden gebruikt.

Figuur 1: Overzicht van de workflow. In dit protocol wordt RNA eerst omgezet in cDNA. Sequencing adapters zijn geligated, en adapter-ligated cDNA wordt versterkt en gebarcoded door PCR om een pre-capture bibliotheek te creëren. Biotinylated sondes worden vervolgens gehybridiseerd naar specifieke cDNA-doelen die vervolgens worden vastgelegd met behulp van streptavidin kralen. Niet-gebonden, niet-gerichte cDNA wordt verwijderd door wassen. Een definitieve PCR-verrijking levert een post-capture bibliotheek op die klaar is voor sequencing. *Totaal RNA moet afkomstig zijn van menselijke monsters; kan intact of gedegradeerd (FFPE) RNA. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figuur 2: Representatieve immuunrapporten. De workflow genereert twee rapporten, een individueel immuunrapport(A)voor elk verwerkt monster en een biomarkerrapport(B)voor gedefinieerde patiëntcohorten. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Het protocol vereist ongeveer 16 uur voorbereidingstijd (van totaal RNA tot bibliotheken die klaar zijn voor sequencing); Er zijn echter een aantal optionele stoppunten, zoals vermeld in het protocol. De test maakt gebruik van de rijke, dynamische aard van transcriptomics om verder te gaan dan legacy single-analyte biomarkers naar multidimensionale genexpressiemodellen, waardoor uitgebreide biologische karakterisering van weefselmonsters met gestandaardiseerde reagentia en gebruiksvriendelijke softwaretools. Het stelt onderzoekers in staat om een hedendaagse technologie te gebruiken in hun eigen laboratorium, door gebruik te maken van machine learning en een database van Health Expression Models om nauwkeurigere, kwantitatieve immuunprofielen van kostbare klinische monsters af te leiden en te ontdekken multidimensionale RNA biomarkers met volledige statistische analyse.

Protocol

De menselijke weefselmonsters die in de hier getoonde representatieve resultaten worden gebruikt, zijn gekocht bij een gerenommeerde entiteit (TriStar Technology Group) en hebben de toestemming van de donor meegedeeld die academisch en commercieel onderzoek mogelijk maakt, evenals goedkeuring van een bevoegde ethische Commissie.

Deel I: Voorbereiding van de bibliotheek vooraf vastleggen

1. RNA Kwantificering en kwalificatie

1. Kwantificeer RNA met behulp van een fluormetrische test om de juiste input voor de test te bepalen. Beoordeel de kwaliteit van het input RNA met behulp van elektroforese om het RNA Integrity Number (RIN) en het percentage fragmenten >200 nucleotiden (DV₂₀₀₎waarden te bepalen.
   1. Voor intacte (RIN > 7) of gedeeltelijk gedegradeerde RNA-monsters (RIN = 2 tot 7) volgt u de bibliotheekvoorbereidingsstappen voor hoogwaardig/intact RNA, te beginnen met stap 2.1. De kwaliteit van het RNA is belangrijk voor het selecteren van de juiste fragmentatietijd in Thermal Cycler Program #1 (Aanvullende tabel 2).
   2. Voor sterk gedegradeerde monsters (bijvoorbeeld RIN = 1 tot 2 of FFPE) bepaal je de DV_200-waarde. Deze monsters vereisen geen fragmentatie en volgen de instructies voor gedegradeerd RNA, te beginnen met stap 2.2.
2. Bereid de juiste hoeveelheid totaal RNA voor elk monster voor door 20 ng RNA (High-Quality/Intact RNA met RIN > 2) of 40 ng RNA (Gedegradeerd/FFPE RNA met DV₂₀₀ > 20%) te verdunnen tot 5 μL in nuclease-vrij water. Het verwerken van samples met DV₂₀₀ < 20% wordt niet aanbevolen. Voor de controle-RNA-monsters die bij de kit zijn geleverd, moet u 1 μL van het juiste RNA verdunnen in 4 μL nuclease-vrij water. Controlemonsters volgen dezelfde verwerking als beschreven voor RNA-materialen van hoge kwaliteit (intact) of Gedegradeerd (FFPE), zoals gelabeld. Zie Aanvullende tabel 1 voor alle reagentia die in de kit zijn opgenomen.

2. RNA Fragmentatie en Priming

1. Volg stap 2.1.1 voor RNA van hoge kwaliteit/intact met RIN > 2.
   1. Voor rna van hoge kwaliteit, monteer de fragmentatie en priming reactie op ijs in een nuclease-vrije PCR buis volgens tabel 1.
      1. Meng grondig door pipetteren op en neer meerdere malen. Draai vervolgens kort de monsters in een microcentrifuge
         OPMERKING: Voor alle centrifugespins in het protocol wordt een snelheid van ≥ 1.000 x g voor ten minste 3 s aanbevolen.
      2. Plaats de monsters in een thermische cycler en gebruik Programma #1 (Aanvullende tabel 2).
      3. Breng de buizen onmiddellijk over naar ijs en ga over naar First Strand cDNA Synthesis for High Quality RNA (Stap 3.1). Voor de gelijktijdige voorbereiding van zowel Hoge Kwaliteit als FFPE RNA, begin de voorbereiding van het FFPE RNA (Stap 2.2) tijdens de Fragmentatie Incubatie.

Fragmentatie en Priming Mix	Volume (μL)
Intact of gedeeltelijk gedegradeerd RNA (20 ng)	5
Eerste bundel synthese reactiebuffer	4
Willekeurige primers	1
Totaal volume	10

Tabel 1: Fragmentatie en priming reactie voor hoogwaardig RNA. Componenten van de fragmentatie en priming reactie voor hoogwaardige RNA moeten worden geassembleerd en gemengd op ijs volgens de getoonde volumes. Een master mix van First Strand Synthesis Reaction Buffer en Random Primers kan worden gemaakt en toegevoegd aan de RNA monsters.

2. Volg stap 2.2.1 voor Gedegradeerd/FFPE RNA met DV₂₀₀ > 20%.
   1. Voor sterk gedegradeerd (FFPE) RNA dat geen fragmentatie vereist, monteer de priming reactie zoals beschreven in tabel 2. Voor intact RNA, vergeet niet om stap 2.1 te volgen.
      1. Meng grondig door pipetteren op en neer meerdere malen. Draai vervolgens kort de monsters in een microcentrifuge.
      2. Plaats de monsters in een thermische cycler en gebruik Programma #2 (Aanvullende tabel 2).
      3. Breng de buizen over naar ijs en ga over naar First Strand cDNA Synthesis for Highly Degraded (FFPE) RNA (Stap 3.2).

Priming Reactie	Volume (μL)
FFPE RNA (40 ng)	5
Willekeurige primers	1
Totaal volume	6

Tabel 2: Willekeurige priming reactie voor sterk gedegradeerd RNA. Componenten van de primingreactie voor sterk gedegradeerd RNA moeten op ijs worden gemonteerd in een nuclease-vrije PCR-buis.

3. Eerste streng cDNA Synthese

1. Volg stap 3.1.1 voor RNA van hoge kwaliteit/intact met RIN > 2.
   1. Voor intact RNA (hoge kwaliteit), monteer de Eerste Reactie van de Synthese van de Bundel op ijs in een nuclease-vrije buis PCR volgens Lijst 3.
      1. Het houden van de reacties op ijs, grondig mengen door pipetteren op en neer meerdere malen. Draai de monsters kort in een microcentrifuge en ga direct verder naar Eerste strengsynthese incubatie (Stap 4).

Eerste strengsynthese	Volume (μL)
Gefragmenteerd en geprimed RNA (Stap 2.1.3)	10
Eerste strand synthese specificiteit Reagens	8
Eerste streng synthese enzymmix	2
Totaal volume	20

Tabel 3: Eerste reactie van de synthese van strengen voor RNA van hoge kwaliteit. Componenten van de fragmentatie en priming reactie voor hoge kwaliteit RNA moeten worden geassembleerd en gemengd op ijs volgens de gegeven volumes. Een master mix van First Strand Synthesis Specificiteit Reagent en First Strand Synthesis Enzyme Mix kan worden gemaakt en toegevoegd aan de gefragmenteerde en geprimed RNA monsters.

2. Volg stap 3.2.1 voor Gedegradeerd/FFPE RNA met DV₂₀₀ > 20%.
   1. Voor sterk gedegradeerd RNA (FFPE), monteren van de eerste strand synthese reactie op ijs in een nuclease-vrije PCR buis volgens tabel 4.
      1. Het houden van de reacties op ijs, grondig mengen door pipetteren op en neer meerdere malen. Draai de monsters kort in een microcentrifuge en ga direct verder naar Eerste strengsynthese incubatie (Stap 4).

Eerste strengsynthese	Volume (μL)
Geprimed RNA (Stap 2.2.3)	6
Eerste bundel synthese reactiebuffer	4
Eerste strand specificiteit reagent	8
Eerste streng synthese enzymmix	2
Totaal volume	20

Tabel 4: Eerste reactie van de synthese van strengen voor sterk gedegradeerd RNA. Componenten van de fragmentatie en priming reactie voor sterk gedegradeerd RNA moeten worden geassembleerd en gemengd op ijs volgens de getoonde volumes. Een master mix van First Strand Synthesis Reaction Buffer, First Strand Synthesis Specificity Reagent, en First Strand Synthesis Enzyme Mix kan worden gemaakt en toegevoegd aan de geprimed RNA monsters.

4. Eerste strandsynthese incubatie

1. Houd de buizen op ijs, meng grondig door pipetteren op en neer meerdere malen. Draai de monsters kort in een microcentrifuge. Bebroed de monsters in een voorverwarmde thermische cycler volgende Programma #3 (Aanvullende tabel 2).

5. Tweede onderdeel cDNA Synthese

1. Bereid de tweede streng cDNA synthesereactie op ijs door de in tabel 5genoemde componenten samen te stellen, inclusief het eerste onderdeelreactieproduct uit stap 4.1.

Tweede onderdeel synthese reactie	Volume (μL)
Eerste strandsyntheseproduct (stap 4.1)	20
Tweede onderdeel synthese reactiebuffer	8
Tweede streng synthese enzymmix	4
Nuclease-vrij water	48
Totaal volume	80

Tabel 5: Tweede onderdeel Synthese reactie. Componenten van de tweede streng cDNA synthese reactie moeten worden geassembleerd en gemengd op ijs volgens de getoonde volumes. Een master mix van de Second Strand Synthesis Reaction Buffer, Second Strand Synthesis Enzyme Mix en Nuclease-vrij water kunnen worden gemaakt en toegevoegd aan het Eerste Onderdeel Synthese Product.

2. Houd de buizen op ijs, meng grondig door pipetteren op en neer meerdere malen. Incubeer in een thermische cycler volgende Programma #4 (Aanvullende tabel 2).

6. cDNA Cleanup Met behulp van SPRI (Solid Phase Reversible Immobilisatie) Kralen

1. Laat de SPRI Beads minstens 30 minuten voor gebruik op kamertemperatuur worden en draai vervolgens de SPRI Beads ongeveer 30 s om opnieuw op te schorten.
2. Voeg 144 μL opnieuw gesuspendeerde kralen toe aan de tweede strengsynthesereactie (~80 μL). Meng goed door ppetteren op en neer ten minste 10 keer en incubate voor 5 min bij kamertemperatuur.
3. Draai de buizen kort in een microcentrifuge en plaats de buizen op een magnetisch rek om kralen van het supernatant te scheiden. Nadat de oplossing duidelijk is, zorgvuldig verwijderen en gooi de supernatant. Wees voorzichtig niet te storen de kralen, die DNA bevatten.
4. Voeg 180 μL vers bereide 80% ethanol toe aan de buizen terwijl u op het magnetische rek zit. Incubeer bij kamertemperatuur voor 30 s, en verwijder en gooi vervolgens voorzichtig de supernatant weg.
5. Herhaal stap 6.4 eenmaal voor een totaal van 2 waspassen.
6. Verwijder de resterende ethanol volledig. Laat de buizen op het magnetisch rek en de lucht drogen de kralen voor ongeveer 3 minuten met het deksel open, of tot zichtbaar droog. Droog de kralen niet te drogen, omdat dit kan leiden tot een lager herstel van DNA.
7. Haal de buizen van de magneet en voeg 53 μL 0,1x TE Buffer (inbegrepen in reagent kit, zie Aanvullende Tabel 1) aan de kralen. Pipetteer minstens 10 keer op en neer om goed te mengen. Incubeer gedurende 2 min bij kamertemperatuur.
8. Plaats de buizen op een magnetisch rek, waardoor kralen volledig gescheiden van de supernatant. Breng 50 μL van de supernatant over naar het reinigen van nuclease-vrije PCR-buizen. Let erop dat u de kralen niet verstoort. Dit is een optionele stopplaats in het protocol, cDNA-monsters kunnen worden opgeslagen bij -20 °C.

7. Einde reparatie van cDNA-bibliotheek

1. Monteer de eindreparatiereactie op ijs door de in tabel 6 vermelde componenten in te stellen op het tweede onderdeelsyntheseproduct uit stap 6.8.

Reactie van eindreparatie	Volume (μL)
Tweede onderdeelsyntheseproduct (stap 6.8)	50
Reactiebuffer voor reparatie beëindigen	7
Einde Reparatie Enzym Mix	3
Totaal volume	60

Tabel 6: Reactie reparatie beëindigen. Onderdelen van de eindreparatiereactie moeten op ijs worden gemonteerd en gemengd op basis van de getoonde volumes. Een master mix van de End Repair Reaction Buffer en de End Repair Enzyme Mix kan worden gemaakt en toegevoegd aan de Tweede Streng Synthese Product.

2. Stel een pipet in op 50 μL en pipet het hele volume minstens 10 keer op en neer om grondig te mengen. Kort centrifugeom alle vloeistof van de zijkanten van de buizen te verzamelen. Het is belangrijk om goed te mengen. De aanwezigheid van een kleine hoeveelheid bellen zal de prestaties niet verstoren.
3. Bebroed de monsters in een thermische cycler volgende Programma #5 (Aanvullende tabel 2).

8. Adapterligatie

1. Verdun de adapter vóór het instellen van de ligatiereactie in de ijskoude adapterverdunningsbuffer zoals aangegeven in tabel 7,vermenigvuldigen d.m.v. het vereiste aantal monsters, plus 10% extra. Houd de verdunde adapter op ijs.

Ligatie Verdunning	Volume (μL)
Adapter	0.5
Verdunningsbuffer voor adapters	2
Totaal volume	2.5

Tabel 7: Verdunning van de adapter. De adapter moet op ijs worden verdund met een verdunningsbuffer voor adapters op basis van de getoonde volumes.

2. Monteer de ligatiereactie op ijs door de componenten zoals beschreven in tabel 8, in de vermelde volgorde, toe te voegen aan het eindprep-reactieproduct uit stap 7.3. Merk op dat de Ligation Master Mix en Ligatie Enhancer kan worden gemengd van tevoren. Dit mengsel is stabiel gedurende ten minste 8 uur bij 4 °C. Meng de Ligation Master Mix, Ligation Enhancer en Adaptor niet voor gebruik in de Adaptor Ligation Step.

Ligatie Reactie	Volume (μL)
Einde prepped DNA (Stap 7.3)	60
Verdunde adapter (stap 8.1)	2.5
Ligatie Enhancer	1
Ligatie Master Mix	30
Totaal volume	93.5

Tabel 8: Ligatiereactie. Componenten van de adaptorligatiereactie moeten op ijs worden gemonteerd op basis van de in de aangegeven volgorde getoonde hoeveelheden. Een master mix van Ligation Enhancer en Ligation Master Mix kan worden gemaakt en toegevoegd aan het End Prepped DNA met Diluted Adaptor. Meng de verdunde adapter en de Ligation Master Mix of Ligatie Enhancer niet voordat u het met het End Prepped DNA mengt.

3. Stel een pipet in op 80 μL en pipet het hele volume minstens 10 keer op en neer om grondig te mengen. Voer een snelle draai uit om alle vloeistof van de zijkanten van de buizen te verzamelen. De Ligation Master Mix is erg stroperig. Zorg ervoor dat de ligatiereactie voldoende wordt gemengd, aangezien onvolledige vermenging zal leiden tot een verminderde ligatie-efficiëntie. De aanwezigheid van een kleine hoeveelheid bellen zal de prestaties niet verstoren.
4. Incubeer volgende programma #6 (Aanvullende tabel 2), en verwijder vervolgens het ligatiemengsel uit de thermische cyclusr en voeg 3 μL Adaptor Processing Enzyme toe, wat resulteert in een totaal volume van 96,5 μL.
5. Pipetteer meerdere malen op en neer om goed te mengen, en vervolgens uitbroeden na Programma #7 (Aanvullende tabel 2) alvorens onmiddellijk over te gaan tot zuivering van ligatie reactie.

9. Zuivering van ligatiereactie Met Behulp van SPRI Neads

1. Laat SPRI Beads minstens 30 minuten voor gebruik op kamertemperatuur worden en draai vervolgens spri-kralen voor ongeveer 30 s om opnieuw op te schorten.
2. Voeg 87 μL opnieuw gesuspendeerde SPRI-kralen toe en meng goed door minstens 10 keer op en neer te stampen. Incubeer 10 min bij kamertemperatuur.
3. Draai de buizen kort in een microcentrifuge en plaats de buizen op een magnetisch rek om kralen van het supernatant te scheiden. Nadat de oplossing duidelijk is (~ 5 min), verwijder en gooi de supernatant zorgvuldig weg. Gooi de kralen niet weg.
4. Voeg 180 μL vers bereide 80% ethanol toe aan de buizen terwijl u op het magnetische rek zit. Incubeer bij kamertemperatuur voor 30 s, en verwijder en gooi vervolgens voorzichtig de supernatant weg. Herhaal stap 9.4 eenmaal voor een totaal van 2 waspassen.
5. Verwijder de resterende ethanol volledig. Laat de buizen op het magnetisch rek en de lucht drogen de kralen voor ongeveer 3 minuten met het deksel open, of tot zichtbaar droog. Droog de kralen niet te drogen, omdat dit kan leiden tot een lager herstel van DNA.
6. Haal de buizen van de magneet en voeg 17 μL 0,1x TE-buffer toe aan de kralen. Pipetteer minstens 10 keer op en neer om goed te mengen. Incubeer gedurende 2 min bij kamertemperatuur en plaats de buizen vervolgens op een magnetisch rek, waardoor kralen volledig van het supernatant kunnen scheiden.
7. Breng 15 μL van de supernatant over naar het reinigen van nuclease-vrije PCR-buizen. Let erop dat u de kralen niet verstoort. Dit is een optioneel stoppunt in het protocol, het adaptor-ligated DNA kan worden opgeslagen bij -20 °C.

10. PCR Verrijking van Adaptor Ligated DNA

1. Stel de PCR-reactie in zoals beschreven in tabel 9. Een Master Mix met de Pre-Capture PCR Master Mix en de Universal Primer kan worden gemaakt en toegevoegd aan het Adaptor geligat DNA. Voor multiplexed sequencing, gebruik maken van unieke index primers voor elke reactie en toe te voegen aan elk monster afzonderlijk.

VERRIJKING PCR	Volume (μL)
Adaptor geligat DNA (Stap 10.1)	15
Pcr-mastermix vooraf vastleggen	25
Universele PCR Primer	5
Index (X) Primer	5
Totaal volume	50

Tabel 9: PCR-verrijking van adaptor geligat DNA. Componenten van de PCR-verrijking van de door de adapter geligade DNA-reactie moeten worden geassembleerd en op ijs worden gemengd op basis van de getoonde volumes. Een master mix van de Pre-Capture PCR Master Mix en de Universal PCR Primer kan worden gemaakt en toegevoegd aan de adapter geligat DNA. Voor multiplexed sequencing, elk monster moet worden gegeven een unieke Index Primer.

2. Meng goed door voorzichtig pipetteren op en neer 10 keer. Draai de buizen kort in een microcentrifuge en plaats in een thermische fietser en voer PCR-versterking uit met behulp van Program #8 (Aanvullende tabel 2).

11. Zuivering van de PCR-reactie met Behulp van SPRI-kralen

1. Laat SPRI Beads minstens 30 minuten voor gebruik op kamertemperatuur worden en draai vervolgens spri-kralen voor ongeveer 30 s om opnieuw op te schorten.
2. Voeg 45 μL opnieuw gesuspendeerde kralen toe aan elke PCR-reactie (~50 μL). Meng goed door ppetteren op en neer ten minste 10 keer, alvorens uit te broeden voor 5 minuten bij kamertemperatuur.
3. Draai de buizen kort in een microcentrifuge en plaats de buizen op een magnetisch rek om kralen van het supernatant te scheiden. Nadat de oplossing duidelijk is (~ 5 min), verwijder en gooi de supernatant zorgvuldig weg. Let erop dat u de kralen die DNA bevatten niet verstoort.
4. Voeg 180 μL vers bereide 80% ethanol toe aan de buizen in het magnetische rek. Incubeer bij kamertemperatuur voor 30 s, en verwijder en gooi vervolgens voorzichtig de supernatant weg. Herhaal stap 11.4 eenmaal voor een totaal van 2 waspassen.
5. Verwijder de resterende ethanol volledig. Laat de buizen op het magnetisch rek en de lucht drogen de kralen voor ongeveer 3 minuten met het deksel open, of tot zichtbaar droog. Droog de kralen niet te drogen, omdat dit kan leiden tot een lager herstel van DNA.
6. Haal de buizen van de magneet en voeg 23 μL 0,1x TE Buffer toe aan de kralen. Pipetteer minstens 10 keer op en neer om goed te mengen. Incubeer gedurende 2 min bij kamertemperatuur.
7. Plaats de buizen op een magnetisch rek, waardoor kralen volledig gescheiden van de supernatant. Breng 20 μL van de supernatant over naar het reinigen van nuclease-vrije PCR-buizen. Let erop dat u de kralen niet verstoort. Dit is een optioneel stoppunt in het protocol, Pre-Capture Libraries kunnen worden opgeslagen bij -20 °C.

12. Pre-capture Library valideren en kwantificeren

1. Meet de concentratie van de pre-capture bibliotheek met behulp van een fluormeter en hoge gevoeligheid testkit. Een minimale opbrengst van 200 ng is vereist om door te gaan naar deel II: Hybridisatie en Capture.
   1. Voer 1 μL bibliotheek uit op een digitaal elektroforesesysteem. Verdun indien nodig het monster om overbelasting van de High Sensitivity Chip te voorkomen, volgens de protocolaanbevelingen van de fabrikant.
   2. Controleer of het elektropherogram een smalle verdeling vertoont met een piekgrootte van ongeveer 250-400 bp (zie representatieve resultaten, figuur 3 en figuur 4).
   3. Als een piek van 128 bp (adapter-dimer) zichtbaar is in de Bioanalyzer-sporen, en de intensiteit van het signaal ≥ de intensiteit van 250-400 bp bibliotheeksignaal is (zie representatieve resultaten, figuur 5), en vervolgens het monstervolume (van stap 11.7) naar 50 μL met 0,1x TE Buffer is en de SPRI-beadzuivering (stap 11) naar boven brengt. Dit is een optioneel stoppunt in het protocol, Pre-capture bibliotheken kunnen worden opgeslagen bij -20 °C voordat u overgaat naar deel II: ImmunoPrism Hybridization and Capture.

Deel II: Hybridisatie en capture

13. Combineer het blokkeren van Oligos, Cot-1 DNA, Pre-capture Library DNA, en Dry

1. Meng de in stap 11 opgestelde barcodebibliotheek en gekwantificeerd in stap 12, met Cot-1 DNA en Blokkeer Oligos in een nuclease-vrije PCR-buis of 1,5 mL microtube, zoals blijkt uit tabel 10.

Reagens	Hoeveelheid/volume
Bibliotheek met streepjescode van stap 10.10	200 ng
Wieg-1 DNA	2 μg
Oligos blokkeren	2 μL

Tabel 10: Hybridisatie Voorbereiding en afdrogen. Onderdelen die moeten worden gecombineerd voor het afdrogen van bibliotheken ter voorbereiding van hybridisatie, moeten worden geassembleerd op basis van de getoonde hoeveelheden.

2. Droog de inhoud van de buis met behulp van een vacuümconcentrator ingesteld op 30-45 °C. Dit is een optioneel stoppunt in het protocol. Na het drogen mogen buizen 's nachts worden opgeslagen bij kamertemperatuur (15-25 °C) of langer bij -20 °C.

14. Hybridiseren DNA Capture Probes met de bibliotheek

1. Ontdooi 2x Bead Wash Buffer and Hybridization Buffer, Hybridization Buffer Enhancer, ImmunoPrism Probe Panel, 10x Wash Buffer 1, 10x Wash Buffer 2, 10x Wash Buffer 3 en 10x Stringent Wash Buffer bij kamertemperatuur. Voor gebruik, inspecteer de Hybridisatiebuffer op kristallisatie van zouten. Als er kristallen aanwezig zijn, verwarm de buis op 65 °C, met tussenpozen schudden, totdat de buffer volledig is oplosbaar.
2. Maak bij kamertemperatuur de Hybridization Master Mix in een buis. Vermenigvuldig de volumes met het aantal monsters en voeg 10% extra toe, volgende tabel 11.

Hybridisatie Master Mix	Volume (μL)
Hybridisatiebuffer	8.5
Hybridisatie buffer versterker	2.7
ImmunoPrism Probe Panel	5
Nuclease-vrij water	0.8
Totaal volume	17

Tabel 11: Hybridization Master Mix. Componenten van Hybridization Master Mix moeten worden geassembleerd en gemengd bij kamertemperatuur op basis van de getoonde volumes.

3. Vortex of pipette erop en neer om goed te mengen. Voeg vervolgens 17 μL van de Hybridization Master Mix toe aan elke buis met gedroogd DNA. Sluit de buizen af en incubeer 5 min bij kamertemperatuur.
4. Vortex de monsters, ervoor te zorgen dat ze volledig worden gemengd, en draai de monsters kort in een microcentrifuge. Breng indien van toepassing elk monster over van een microbuis van 1,5 mL naar een nuclease-vrije PCR-buis.
5. Plaats de monsters in een thermische cycler en voer Programma #9(Aanvullende tabel 2).
   1. Bereid tijdens de incubatie de wasbuffers (Stap 15) en streptavidin-kralen (stap 16) voor, waardoor voldoende tijd is om buffers voor te verwarmen en de streptavidin-kralen te equilibreren.

15. Bereid wasbuffers voor

LET OP: Wasbuffers worden geleverd als 2x (Bead Wash Buffer) of 10x (alle andere wasbuffers) geconcentreerde oplossingen.

1. Verdun tijdens de incubatievan hybridisatie de 2x Bead Wash Buffer en de 10x Wash Buffers om 1x werkende oplossingen te creëren, vermenigvuldig het vereiste aantal monsters en voeg 10% extra toe, volgende tabel 12. Als 10x wasbuffer 1 troebel is, verwarm tu de fles dan in een waterbad van 65 °C of een verwarmingsblok om deeltjes opnieuw op te schorten. Bevroren 1x Wasbuffers moeten na ontdooien worden gemengd.

Buffers wassen	Geconcentreerde buffer (μL)	Nuclease-vrij water (μL)	Totaal (μL)
Kraal wasbuffer	150	150	300
Buffer wassen 1	25	225	250
Buffer wassen 2	15	135	150
Buffer wassen 3	15	135	150
Strenge wasbuffer	30	270	300

Tabel 12: Bufferverdunning wassen. De concentratiewasbuffers moeten worden verdund met nuclease-vrij water bij kamertemperatuur, afhankelijk van de getoonde volumes.

2. Aliquot de 1x Wash Buffers in nuclease-vrije PCR buizen en plaats bij de juiste temperaturen zoals aangegeven in tabel 13. Zorg ervoor dat u voldoende overschrijding voor pipetteren. Gebruik voor verwarmde buffers een thermische cycler ingesteld op 65 °C met het deksel ingesteld op 70 °C.

Buffers wassen	Houdtemperatuur	Volume/buis (μL)	Aantal buizen/monster
Kraal wasbuffer	RT (15-25 °C)	100	3
Buffer wassen 1	65 °C	100	1
Buffer wassen 1	RT (15-25 °C)	150	1
Buffer wassen 2	RT (15-25 °C)	150	1
Buffer wassen 3	RT (15-25 °C)	150	1
Strenge wasbuffer	65 °C	150	2

Tabel 13: Verdunde wasbuffers. De verdunde wasbuffers moeten in afzonderlijke buizen worden genoteerd op basis van de volumes en het aantal buizen per getoond monster. Wasbuffers moeten voor gebruik op de aangegeven temperatuur worden gehouden.

3. Bereid de Bead Resuspension Mix op kamertemperatuur zoals aangegeven in tabel 14,vermenigvuldigen met het vereiste aantal monsters en het toevoegen van 10% extra.

Kraal Resuspension Mix	Volume (μL)
Hybridisatiebuffer	8.5
Hybridisatie buffer versterker	2.7
Nuclease-vrij water	5.8
Totaal volume	17

Tabel 14: Bead Resuspension Mix. Componenten van Bead Resuspension Mix moeten worden geassembleerd en gemengd bij kamertemperatuur op basis van de getoonde volumes.

16. Bereid de Streptavidin Kralen

1. Equilibrate streptavidin kralen op kamertemperatuur voor ten minste 30 minuten voor gebruik. Meng de kralen grondig door vortexing voor 15 s en aliquot 50 μL kralen per vangst in een nuclease-vrije PCR buis.
2. Voeg 100 μL 1x Bead Wash Buffer (bereid in stap 15.1) toe aan elke buis. Voorzichtig pipet op en neer 10 keer te mengen. Plaats de buis op een magnetisch rek, waardoor kralen volledig gescheiden van de supernatant.
3. Verwijder en gooi de heldere supernatant weg. Let erop dat u de kralen niet verstoort.
4. Voer de volgende wasuit.
   1. Haal uit het magnetische rek. Voeg 100 μL 1x Bead Wash Buffer toe aan elke buis met kralen en pipet er vervolgens 10 keer op en neer om te mengen.
   2. Plaats de buis in het magnetische rek, waardoor kralen volledig gescheiden van de supernatant.
   3. Verwijder en gooi de heldere supernatant zorgvuldig weg.
5. Herhaal stap 16.4 eenmaal voor een totaal van twee wasbeurten.
6. Haal uit het magnetische rek. Voeg 17 μL Bead Resuspension Mix toe vanaf stap 15.3 aan elke buis. Pipetteer meerdere malen op en neer om grondig te mengen. Zorg ervoor dat kralen niet aan de zijkanten van de buizen worden geplakt. Indien nodig, kort draai de buizen om de kralen te verzamelen aan de onderkant.

17. Bind hybridized Target aan de Streptavidin Beads

1. Nadat de 4 uur durende incubatietijd is voltooid, verwijdert u de monsters uit de thermische fietser en stelt u de thermische fietser in op 65 °C met het verwarmde deksel ingesteld op 70 °C.
2. Breng met behulp van een meerkanaals pipet 17 μL volledig gehomogeniseerde kralen naar de monsters. Meng grondig door 10 keer op en neer te stampen.
3. Bind het DNA aan de kralen door de buizen in de thermische cycler te plaatsen volgens Programma #10 (Aanvullende tabel 2). Tijdens de incubatie, kort verwijderen van de strip buizen om de 10-12 min en zachtjes vortex voor 3 s om ervoor te zorgen dat de kralen blijven in suspensie. Als alternatief, mix door pipetteren op en neer meerdere malen. Ga onmiddellijk te werk naar Wash Streptavidin Beads (Stap 18).

18. Was Streptavidin kralen om ongebonden DNA te verwijderen

1. Gebruik de 1x Wasbuffers van Stap 15.2 en bewaar verwarmde buffers in de thermische cycler tijdens wasbeurten.
2. Voeg 100 μL voorverwarmde 1x Wasbuffer 1 toe aan de buizen vanaf stap 17.3. Meng grondig door 10 keer op en neer te stampen. Plaats de buizen op een magnetisch rek, waardoor kralen volledig gescheiden van de supernatant.
3. Pipetteer en gooi de supernatant, die ongebonden DNA bevat. Haal uit het magnetische rek.
4. Voer de volgende 65 °C was.
   1. Voeg 150 μL voorverwarmde 1x Stringent Wash Buffer toe.
   2. Meng grondig door pipetteren op en neer ten minste 10 keer. Vermijd bubbels tijdens het beaaiden. Zorg ervoor dat kralen volledig opnieuw zijn opgehangen in alle buizen.
   3. Incubeer in de thermische cycler bij 65 °C gedurende 5 min.
   4. Plaats de buizen op een magnetisch rek, waardoor kralen volledig gescheiden van de supernatant. Pipetteer en gooi de supernatant, die ongebonden DNA bevat. Haal uit het magnetische rek.
   5. Herhaal stap 18.4 voor een totaal van twee Stringent Washes.
5. Voer de eerste wasbeurt op kamertemperatuur uit.
   1. Voeg 150 μL kamertemperatuur 1x Wasbuffer 1 toe.
   2. Pipetteer 10 tot 20 keer op en neer om de kralen volledig opnieuw op te schorten.
   3. Sluit de buizen af en incubeer gedurende 2 min, afwisselend tussen zacht vortexen gedurende 30 s en 30 seconden rusten. Zorg ervoor dat kralen in alle putten volledig opnieuw worden opgehangen in alle buizen gedurende de gehele incubatie.
   4. Centrifugeer de buizen kort.
   5. Plaats de buizen op een magnetisch rek, waardoor kralen volledig gescheiden van de supernatant. Pipetteer en gooi de supernatant weg.
   6. Sluit de buizen af en centrifugeer kort. Keer terug naar het magnetische rek en gebruik een 10 μl pipet om eventuele resterende wasbuffer te verwijderen.
6. Voer de tweede kamertemperatuur wasbeurt uit.
   1. Voeg 150 μL kamertemperatuur 1x Wasbuffer 2 toe.
   2. Pipetteer 10 tot 20 keer op en neer om de kralen volledig opnieuw op te schorten.
   3. Sluit de buizen af en incubeer gedurende 2 min, afwisselend tussen zacht vortexen gedurende 30 s en 30 seconden rusten. Zorg ervoor dat kralen in alle putten volledig opnieuw worden opgehangen in alle buizen gedurende de gehele incubatie.
   4. Centrifugeer de buizen kort.
   5. Breng het volledige volume kralen opnieuw hangen in Wash Buffer 2 over om nuclease-vrije PCR-buizen schoon te maken. Belangrijk: Het overbrengen van de kralen naar verse buizen is belangrijk om off-target besmetting te voorkomen.
   6. Plaats de buizen op een magnetisch rek, waardoor kralen volledig gescheiden van de supernatant. Pipetteer en gooi de supernatant weg.
   7. Sluit de buizen af en centrifugeer kort. Keer terug naar het magnetische rek en gebruik een 10 μl pipet om eventuele resterende wasbuffer te verwijderen.
7. Voer de derde kamertemperatuur wasbeurt uit.
   1. Voeg 150 μL kamertemperatuur 1x Wasbuffer 3 toe.
   2. Pipetteer 10 tot 20 keer op en neer om de kralen volledig opnieuw op te schorten.
   3. Sluit de buizen af en incubeer gedurende 2 min, afwisselend tussen zacht vortexen gedurende 30 s en 30 seconden rusten. Zorg ervoor dat kralen in alle putten volledig opnieuw worden opgehangen in alle buizen gedurende de gehele incubatie.
   4. Centrifugeer de buizen kort.
   5. Plaats de buizen op een magnetisch rek, waardoor kralen volledig gescheiden van de supernatant. Pipetteer en gooi de supernatant weg.
   6. Sluit de buizen af en centrifugeer kort. Keer terug naar het magnetische rek en gebruik een 10 μL pipet om eventuele resterende wasbuffer te verwijderen.
   7. Haal uit het magnetische rek en voeg 20 μL nuclease-vrij water toe aan de kralen.
   8. Pipetteer 10 keer op en neer om ervoor te zorgen dat de kralen die aan de zijkant van de buizen vastzitten, opnieuw zijn opgehangen.
8. Belangrijk: Gooi de kralen niet weg. Gebruik de volledige 20 μL opnieuw gesuspendeerde kralen met gevangen DNA in stap 19.

19. Uitvoeren van definitieve, post-capture PCR Verrijking

1. Bereid de Post-Capture PCR Master Mix volgens de volgende tabel, vermenigvuldigen met het vereiste aantal monsters en het toevoegen van 10% extra, volgens tabel 15.

Mixcomponent pcr-master-mix na vastleggen	Volume (μL)
Pcr MasterMix na vastleggen	25
Post-Capture PCR Primer Mix	1.25
Nuclease-vrij water	3.75
Totaal volume	30

Tabel 15: Post-Capture PCR Master Mix. Componenten van Post-Capture PCR Master Mix moeten worden geassembleerd en gemengd op ijs volgens de getoonde volumes.

2. Voeg 30 μL van de Post-Capture PCR Master Mix toe aan elk monster voor een eindreactievolume van 50 μL. Meng grondig door 10 keer op en neer te stampen.
3. Plaats de PCR-buizen in de thermische cycler en incubeer volgende programma #11 (Aanvullende tabel 2).

20. Zuiveren Post-capture PCR Fragmenten

1. Laat SPRI Beads minstens 30 minuten voor gebruik op kamertemperatuur worden en draai vervolgens spri-kralen voor ongeveer 30 s om opnieuw op te schorten.
2. Voeg 75 μL opnieuw opgehangen kralen toe aan elke pcr-verrijkte opname (50 μL). Meng goed door pipetteren op en neer ten minste 10 keer. De streptavidin kralen zal niet interfereren met de SPRI kraal zuivering. Incubeer gedurende 5 min bij kamertemperatuur.
3. Draai de buizen kort in een microcentrifuge en plaats de buizen op een magnetisch rek om kralen van het supernatant te scheiden. Nadat de oplossing duidelijk is, zorgvuldig verwijderen en gooi de supernatant. Wees voorzichtig niet te storen de kralen, die DNA bevatten.
4. Voeg 180 μL vers bereide 80% ethanol toe aan de buis terwijl u in het magnetische rek zit. Incubeer bij kamertemperatuur voor 30 s, en verwijder en gooi vervolgens voorzichtig de supernatant weg.
5. Herhaal stap 20.4 eenmaal voor een totaal van 2 waspassen.
6. Verwijder de resterende ethanol volledig. Laat de buis op het magnetische rek en de lucht droog 3 minuten met het deksel open, of tot zichtbaar droog. Droog de kralen niet te droog. Dit kan leiden tot een lager herstel van DNA.
7. Verwijder de buis van de magneet. Elute het DNA van de kralen door het toevoegen van 22 μL van 0,1x TE Buffer. Meng goed door pipetteren op en neer meerdere malen. Incubeer gedurende 2 min bij kamertemperatuur. Plaats de buis op het magnetische rek tot de oplossing duidelijk is.
8. Verwijder 20 μL van de supernatant en breng over op een schone nuclease-vrije PCR-buis, oppassen dat u de kralen niet stoort. Dit is een optioneel stoppunt in het protocol, bibliotheken kunnen worden opgeslagen bij -20 °C.

21. Bibliotheek valideren en kwantificeren

1. Meet de concentratie van de vastgelegde bibliotheek met behulp van een fluormeter en High Sensitivity Assay Kit.
2. Meet de gemiddelde fragmentlengte van de vastgelegde bibliotheek met behulp van een digitale elektroforese DNA-chip met hoge gevoeligheid en bereken de gemiddelde fragmentgrootte voor elke bibliotheek met behulp van de systeemsoftware. De gemiddelde fragmentgrootte moet ongeveer 250-400 basiswaarde (zie representatieve resultaten, figuur 6 en figuur 7) bedragen. Dit is een optioneel stoppunt in het protocol, voltooide bibliotheken kunnen worden opgeslagen bij -20 °C.

22. Sequencing op een sequencing platform

1. Voor sequencing, bibliotheken verdunnen tot 2 nM en volg de richtlijnen van de fabrikant voor het laden en bedienen van de sequencer. Sequentie bibliotheken tot een minimale diepte van 15 miljoen single end leest van ten minste 50 bp in lengte.

23. Analyse van sequencing-gegevens om immuunprofielen te genereren en biomarkers te ontdekken met de Prism Portal, een cloudgebaseerde informaticatool

1. Maak een Prism-account aan door een bezoek te brengen aan https://prism.cofactorgenomics.com/
2. Eenmaal ingelogd, klikt u op Nieuw project verzenden op de bovenste werkbalk van een pagina in Prism om de gedemultiplexeerde FASTQ-sequencing-bestanden te uploaden of bestanden te uploaden die zijn opgeslagen op BaseSpace met het Prism-account.
3. Vul het formulier Nieuw project in, inclusief de projectnaam, en monsters per groep of cohort. De groepering van monsters en de bijbehorende groeperingsnamen zijn nodig om het Biomarker Discovery Report te genereren. Houd er rekening mee dat minimaal 3 monsters per groep nodig zijn om het Biomarker Discovery Report te genereren. Klik op de knop Toepassing starten om het formulier in te dienen. een bevestigingspagina wordt weergegeven als dit lukt.
4. Klik tijdens het inloggen op Resultaten weergeven op de bovenste werkbalk of op een pagina van Prism. Prism stelt een gebruiker in staat om de status van ingediende projecten te zien en voorbeeld- en biomarkerrapporten per project te bekijken. Er zal een tabel van projecten die de gebruiker heeft gemaakt op Prism. De tabel bevat drie kolommen voor de status, naam en de datum van indiening.
   OPMERKING: De status van elk project kan zijn:
   • "Hardlopen", waar de projectanalyse momenteel wordt uitgevoerd, of
   • "Succes", waarbij de projectanalyse is voltooid en rapporten beschikbaar zijn.
5. Als een project is voltooid analyse (aangegeven door een "Succes" status), bekijk de afzonderlijke voorbeeldrapporten en een Biomarker Discovery Report. Houd er rekening mee dat het Biomarker Discovery Report alleen beschikbaar is als het project het vereiste minimum van drie monsters per groep bevat.
   1. Om toegang te krijgen tot deze rapporten, keert u terug naar de tabel met projecten en klikt u op de naam van het project. Op deze projectpagina wordt een tabel met een rij voor elk voorbeeld in het project weergegeven. Klik op de koppeling in elke rij, onder de kolom Rapport, om toegang te krijgen tot het afzonderlijke rapport van elk voorbeeld. Klik direct onder de tabel op de koppeling voor het Biomarker Discovery Report. Als er geen koppelingen op deze pagina staan, heeft uw project de analyse niet voltooid.

Resultaten

Er zijn een aantal controlepunten in het protocol waarmee een gebruiker de kwaliteit en kwantiteit van gegenereerde materialen kan evalueren. Na stap 12, beschreven in het protocol, wordt een elektropherogram gegenereerd zoals weergegeven in figuur 3, representatief voor een typische pre-capture bibliotheek voor een intact RNA-monster (RIN = 7.8).

Figuur 3: Typische Pre-capture Library Bioanalyzer trace voor een intact RNA-monster. Pre-capture bibliotheken verschijnen als een brede piek rond 250-400 basisparen (bp) in grootte. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Er moet voor worden gezorgd dat overversterking wordt voorkomen, zoals aangegeven in de tweede piek rond 1.000 bp in figuur 4, een representatief elektropherogram van een pre-capture bibliotheek gegenereerd uit een FFPE RNA-monster (DV₂₀₀ = 46). Als deze piek klein is ten opzichte van de hoofdpiek (ongeveer 250-400 basisparen (bp), zoals afgebeeld), zal deze niet interfereren met downstream stappen of analyse. Als de tweede piek groot is ten opzichte van de 250-400 bp piek, kan de pre-capture bibliotheek opnieuw worden gemaakt met minder PCR-cycli om overversterking te verminderen.

Figuur 4: Typische Pre-capture Library Bioanalyzer trace voor een FFPE RNA monster. De tweede piek rond 1.000 bp is indicatief voor overversterking. Als deze piek is klein ten opzichte van de belangrijkste piek rond 250-400 bp (zoals afgebeeld), zal het niet interfereren met downstream stappen of analyse. Als de tweede piek groot is ten opzichte van de 250-400 bp piek, kan de pre-capture bibliotheek opnieuw worden gemaakt met minder PCR-cycli om overversterking te verminderen. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Zoals beschreven in stap 12.1.3, moet de aanwezigheid van adapters dimers worden geëvalueerd om te bepalen of extra opruiming nodig is. De elektropherogrammen in figuur 5 zijn representatief voor onaanvaardbaar (figuur 5A, DV₂₀₀ = 33) en aanvaardbaar(figuur 5B, DV₂₀₀ = 46) niveaus van adapterdimer, verschijnen als de scherpe piek rond 128 bp.

Figuur 5: Pre-capture bibliotheek Bioanalyzer sporen. De adapterdimer verschijnt als een scherpe piek rond 128 bp. (A) Overmatige adapters dimers zijn aanwezig in dit elektropherogram. (B) Aanvaardbare adapter dimer niveaus zijn afgebeeld in dit spoor. Beide sporen tonen bewijs van milde overversterking, maar dit mag niet interfereren met de ImmunoPrism Assay. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Bij de voltooiing van het protocol, voorafgaand aan de sequencing, worden de definitieve bibliotheken opnieuw geëvalueerd met behulp van digitale elektroforese. Bibliotheken gemaakt van FFPE RNA hebben de neiging om een kleinere gemiddelde grootte distributie dan bibliotheken gemaakt van intact RNA. Voor intacte RNA-monsters moet het resulterende spoor lijken op figuur 6 (RIN = 9.5). Voor gedegradeerd of FFPE RNA moet het resulterende spoor er vergelijkbaar uitzien met figuur 7 (DV₂₀₀ = 36).

Figuur 6: Typische Final Library Bioanalyzer trace voor een intact RNA monster. Definitieve bibliotheken worden weergegeven als een brede piek rond 250-400 basisparen (bp) in grootte. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figuur 7: Typische Final Library Bioanalyzer trace voor een FFPE RNA monster. Bibliotheken gemaakt van FFPE RNA hebben de neiging om een kleinere gemiddelde grootte distributie dan bibliotheken gemaakt van intact RNA. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Zoals beschreven, kunnen de resultaten die met dit protocol worden gegenereerd, op twee belangrijke manieren worden toegepast, zoals aangegeven in figuur 8.

Figuur 8: Twee use cases van het protocol. De resultaten gegenereerd door deze immuunprofilering se test worden toegepast in twee belangrijke translationele toepassingen. (A) De eerste use case begint bij menselijk vast tumorweefsel (inclusief FFPE-archieven) en genereert een individueel immuunprofiel voor het monster. (B) Eenmaal gegenereerd voor een cohort van menselijke monsters, worden de gegevens gecombineerd met behulp van de Prism Portal om een multidimensionale biomarker en bijbehorend Biomarker Report te genereren. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Om elk van deze use cases aan te tonen, zijn representatieve gegevens uit een kleine translationele studie opgenomen²¹. De monsters die in deze studie worden gebruikt zijn een reeks exemplaren van 7 patiënten gediagnosticeerd en behandeld voor niet-kleincellige longkanker (NSCLC). De monsters zijn patiënt-matched solide tumorweefsel van pre en post behandeling biopten. Ten eerste werden individuele monsters geanalyseerd om een immuunprofiel te genereren, zoals het voorbeeldrapport in figuur 9.

Figuur 9: Voorbeeld van individueel immuunrapport voor een NSCLC-monster. De Prism Portal-pijplijn genereert een grafisch rapport voor elk verwerkt monster, waarbij een representatief rapport wordt gegenereerd voor een nsclc-vast tumormonster dat hier wordt weergegeven. (A) De voorzijde van het rapport toont grafisch de afbraak van immuuncellen aanwezig in het RNA monster gewonnen uit het FFPE weefsel. (B) De keerzijde van het rapport omvat een tabel met immuuncellen (in absolute percentages) en escape genexpressie (in transcripties per miljoen, of TPM), evenals een prestatieverklaring voor de test. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

De immuunprofielen voor- en nabehandeling kunnen worden gebruikt om te begrijpen hoe een therapie (chemotherapie of bestraling, in deze studie) de tumormicroomgeving heeft gewijzigd. Een voorbeeld wordt weergegeven in figuur 10, waar de veranderingen in procenten voor elke immuuncel en het totale immuunsysteem worden getoond pre- en na chemotherapie, voor een enkele patiënt.

Figuur 10: Voorbeeld resultaten voor en na de behandeling. Individuele immuuncel en totale immuuninhoud gegevens gegenereerd uit pre- en post-behandeling monsters van een enkele NSCLC patiënt worden getoond. In dit voorbeeld kreeg de patiënt een chemotherapieregime als behandeling. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Patiënten kunnen worden gegroepeerd op criteria zoals klinische uitkomsten of fenotypes ter vergelijking. In figuur 11werden de monsters in de NSCLC-studie bijvoorbeeld vergeleken op basis van de tijd van de ziekteprogressie na de behandeling. Een subgroep van de patiënten vertoonde ziekterecidief in >18 maanden, en een andere subgroep vorderde sneller, in ≤18 maanden. De mediane deltawaarde (verschil tussen waarden voor en na de behandeling) wordt voor elk monster vergeleken om vermeende biomarkers van ziekteprogressie te identificeren.

Figuur 11: Voorbeeld Vergelijking van klinische uitkomsten. Kwantitatieve veranderingen tussen de immuuncelpercentages in overeenkomende NSCLC-monsters voor en na de behandeling werden berekend en gerapporteerd als de "delta"-waarde. Die gemarkeerd in geel vertonen duidelijke signaalveranderingen tussen de overlevingsstatus. Blauwe balken vertegenwoordigen mediane deltawaarden voor >18 maanden tot ziekteprogressie, oranje balken vertegenwoordigen mediane deltawaarden gedurende ≤18 maanden tot de progressie van de ziekte. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Ten slotte kunnen vergelijkbare voorbeeldgroepen worden gebruikt om specifiek te kijken naar prebehandelingsmonsters om voorspellende biomarkers te identificeren met behulp van de Prism Portal om een Biomarker Report te genereren. Hetzelfde klinische fenotype (progressie van de ziekte) als hierboven beschreven definieert de monstergroepen. In dit voorbeeld werden twee immuunontsnappingsgenen geïdentificeerd als statistisch significante differentiators van de steekproefgroepen (CD47 en OX40, weergegeven in het onderste paneel van figuur 12A). In dit voorbeeld, omdat de individuele genbiomarkers robuust zijn met duidelijke statistische significantie, voegt de multidimensionale biomarker geen significante voorspellende waarde toe (ImmunoPrism, zoals gelabeld in de bovenste staafdiagram van figuur 12B). De volledige tabel met gegevens, inclusief resultaten voor alle 18 analyten voor de test, wordt samengevat aan de achterzijde van het rapport, inclusief statistische analyse en een korte samenvatting van methoden.

Figuur 12: Voorbeeld biomarkerrapport voor NSCLC-monsters. De Biomarker Discovery-pijplijn levert een visueel rapport van individuele biomarkers en een multidimensionale biomarker voor machine learning, met gedetailleerde statistieken. (A) Voor deze studie identificeerde de pijpleiding twee individuele biomarkers (CD47 en OX40) als statistisch significant voor het definiëren van ziekteprogressie met een drempel van 18 maanden. (B) Details over de methode en de volledige resultaten zijn opgenomen aan de achterzijde van het verslag. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Aanvullende tabel 1: Reagent Kit Materialen. Een lijst van materialen die in de ImmunoPrism Kit worden vermeld, samen met de deelnummers die in het protocol van de fabrikant verwezen. Alle andere benodigde apparatuur en materialen zijn opgenomen in de Tabel met materialen. Bezoek https://cofactorgenomics.com/product/immunoprism-kit/ voor Veiligheidsgegevensbladen (SDS). Klik hier om dit bestand te bekijken (Klik met de rechtermuisknop om te downloaden).

Aanvullende tabel 2: Thermal Cycler Programma's. De aanbevolen cycler programma's waarnaar wordt verwezen in het protocol worden samengevat voor het gemak van programmeren. Klik hier om dit bestand te bekijken (Klik met de rechtermuisknop om te downloaden).

Aanvullende tabel 3: Sequencing Index Guide. De indexprimers in de reagentkit worden vermeld; een unieke primer wordt toegevoegd aan elke reactie voor post-sequencing demultiplexing. Aanbevolen multiplexingcombinaties op laag niveau zijn ook aanwezig. Klik hier om dit bestand te bekijken (Klik met de rechtermuisknop om te downloaden).

Discussie

Het protocol vereist 20 ng intact of 40 ng hoogst gedegradeerd (FFPE) RNA. Het RNA-monster moet vrij zijn van DNA, zouten (bijvoorbeeld Mg²⁺of guanidiniumzouten), divalente kationchechedelende stoffen (bijvoorbeeld EDTA, EGTA, citraat) of organische stoffen (bijvoorbeeld fenol en ethanol). Het wordt niet aanbevolen om verder te gaan met RNA-monsters die een DV₂₀₀ <20% hebben. Het gebruik van het rna in-kitcontrole wordt sterk aanbevolen, omdat deze besturingselementen een middel bieden om de prestaties gedurende het hele protocol te evalueren, van bibliotheekvoorbereiding tot analyse.

Het protocol is ontworpen om te worden uitgevoerd met behulp van 0,2 mL PCR stripbuizen. Indien gewenst kan het protocol ook worden uitgevoerd met behulp van de putten in een 96-well PCR-plaat. Gebruik gewoon de putten van een 96-well PCR plaat in plaats van alle verwijzingen naar PCR buizen of stripbuizen. Gebruik PCR platen met duidelijke putten alleen, want het is van cruciaal belang om visueel te bevestigen volledige resuspension van kralen tijdens kraal zuiveringen en wassen stappen.

Houd reagentia gedurende het protocol bevroren of op ijs, tenzij anders aangegeven. Gebruik geen reagentia totdat ze volledig ontdooid zijn. Zorg ervoor dat u alle reagentia grondig mengt voor gebruik.

Houd enzymen op -20 °C tot ze na gebruik klaar zijn voor gebruik en keer na gebruik terug naar -20 °C. Gebruik alleen nuclease-vrij water van moleculaire kwaliteit; het wordt afgeraden om met DEPC behandeld water te gebruiken. Bij het beaien om te mengen, zachtjes aanzuigen en afzien van ten minste 50% van het totale volume totdat de oplossingen goed gemengd zijn. Pipette meng alle master mixen met enzymen. Het gebruik van vortex om de enzymen te mengen kan leiden tot denaturatie en hun prestaties in gevaar brengen. Gebruik tijdens de kraalzuiveringen vers gemaakte 80% ethanoloplossingen van moleculaire ethanol. Het gebruik van ethanoloplossingen die niet vers zijn, kan leiden tot lagere opbrengsten. Vermijd over het drogen van de kralen, omdat dit kan verminderen elutie efficiëntie (kralen kijken gebarsten als over gedroogd).

Zoals beschreven in stap 10, worden unieke indexprimers toegevoegd aan elke reactie. Op basis van de sequenties van deze indexen, voor laagmultiplexing, zijn bepaalde indexcombinaties optimaal. De sequenties van deze indices zijn nodig voor het demultiplexeren van de gegevens na de sequencing. De sequenties en aanbevolen multiplexing combinaties zijn opgenomen in aanvullende tabel 3. In dezelfde stap is het belangrijk op te merken dat het aantal aanbevolen PCR-cycli varieert afhankelijk van de kwaliteit van het gebruikte RNA en dat enige optimalisatie nodig kan zijn om overversterking van PCR te voorkomen. Voor het ImmunoPrism Intact Control RNA en ander hoogwaardig RNA start optimalisatie met 10 PCR cycli. Voor het ImmunoPrism FFPE Control RNA en andere sterk gedegradeerde/FFPE RNA start optimalisatie met 15 PCR cycli. Het produceren van een testbibliotheek met behulp van RNA representatief voor het materiaal dat moet worden geanalyseerd om PCR-cycli te optimaliseren wordt aanbevolen. Het minimumaantal PCR-cycli dat consistent voldoende pre-capture bibliotheekopbrengsten oplevert (>200 ng) moet worden gebruikt. Een secundaire piek rond 1000 bp op het Bioanalyzer-spoor is indicatief voor overversterking (figuur 4). Overversterking moet worden geminimaliseerd, maar de aanwezigheid van een kleine secundaire piek zal de resultaten van de test niet verstoren.

Om monsterverlies te minimaliseren en te voorkomen dat u van buizen wisselt, kan stap 13 worden uitgevoerd in PCR-buizen, stripbuizen of een 96-well PCR-plaat in plaats van 1,5 mL-microbuisjes, als uw vacuümconcentrator dit toelaat. De rotor kan op veel concentrators worden verwijderd. Hierdoor passen de stripbuizen of platen in het vacuüm. De vacuümconcentratie kan dan worden uitgevoerd met behulp van de waterige uitdroging instelling zonder centrifugering. Raadpleeg de handleiding voor uw vacuümconcentrator voor instructies. Als de monsters worden gedroogd in stripbuizen of een 96-put plaat, kan de hybridisatiestap in hetzelfde vat worden uitgevoerd.

Tijdens stap 17 moet u elke 10-12 min vortexen om de efficiëntie van de kraalafte vast te leggen. Houd de doppen van de warme stripbuizen voorzichtig vast bij het mengen om te voorkomen dat buizen opengaan.

De in stap 18 beschreven wasbeurten zijn van cruciaal belang om hoge niet-specifieke verontreiniging te voorkomen en moeten op de voet worden gevolgd. Zorg ervoor dat u de kralen bij elke wasbeurt volledig opnieuw opschort, de wasbuffers volledig verwijdert en tijdens de wasbuffer 2-wasbuffer 2 de monsters naar een verse stripbuis brengt (stap 18.6.5). Zorg ervoor dat de streptavidin kralen volledig opnieuw worden opgehangen en blijven in suspensie tijdens de gehele incubatie. Spatten op de buisdoppen heeft geen negatieve invloed op de opname. Tijdens de wasbeurten van de kamertemperatuur kan een microplate vortexmixer worden gebruikt om de monsters gedurende het geheel van de incubatietijd van twee minuten te vortexen voor een gemakkelijkere resuspensie. Laat de streptavidin kralen niet uitdrogen. Indien nodig, uitte broedtijd in de buffers om te voorkomen dat het drogen van de kralen. Als u meer dan één stripbuis gebruikt, werkt u met één stripbuis tegelijk voor elke wasbeurt, terwijl de andere stripbuizen in de thermocycler zitten. Dit kan helpen voorkomen dat over het drogen van de kralen of haasten, wat resulteert in een slechte resuspension of andere sub-optimale technieken. Voor gebruikers voor het eerst wordt het niet aanbevolen om meer dan 8 bibliotheekreacties tegelijk te verwerken.

De huidige immuunprofileringstechnieken leveren een continuüm van informatie - van duizenden gegevenspunten die significante interpretatie (RNA-sequencing) vereisen tot een individueel, discreet datapunt (single-plex IHC). Het hier beschreven protocol vertegenwoordigt een benadering die zich ergens in het midden bevindt, met een gerichte reikwijdte die een hoge gevoeligheid mogelijk maakt, maar slechts een subset van klinisch relevante transcriptomische gegevens vastlegt. Vanwege de aard van bulk RNA extractie, dit protocol biedt geen informatie over de ruimtelijke relaties tussen immuuncellen en de tumor micro-omgeving, echter, resultaten kunnen worden aangevuld met imaging technologieën om deze informatie toe te voegen. Er zijn een groot aantal toepassingen voor de gegevens gegenereerd door dit protocol, want er is veel te leren over de biologie van kanker als een ziekte, en de therapieën worden ontwikkeld om het te behandelen. Zoals blijkt uit de representatieve resultaten, is het individuele immuunrapport nuttig om te begrijpen hoe het immuunsysteemprofiel van een patiënt kan veranderen in reactie op gebeurtenissen zoals ziekteprogressie of behandeling. Hoewel de hier gepresenteerde resultaten enkele voorbeelduse cases bieden, zijn ook andere toepassingen, waaronder het onderzoeken van het werkingsmechanisme van een therapie en het identificeren van vermeende biomarkers van klinische resultaten zoals progressievrij en algehele overleving, Praktische. Bij het gebruik van dit protocol voor biomarker detectie toepassingen, is het belangrijk om goede studie ontwerp te oefenen om ervoor te zorgen homogene populaties worden geanalyseerd, voldoende monsters worden opgenomen voor statistische kracht, en bronnen van bias worden overwogen. Vanwege de gerichte, gestroomlijnde aard van de test, is het haalbaar om een pad naar klinische validatie en downstream toepassing van deze biomarkers voorstellen eenmaal ontdekt.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
0.2 mL PCR 8 tube strip	USA Scientific	1402-2700	USA Scientific 0.2 mL PCR 8-tube strip
200 Proof Ethanol	MilliporeSigma	EX0276-1	Bereid 80% door te mengen met nuclease-vrij water op de dag van het experiment
96-well thermal cyclers	BioRad	1861096
Solid-phase Reversible Immobilization (SPRI) Beads	Beckman-Coulter	A63882	Agencourt AMPure XP – PCR-zuiveringskralen
Digitale elektroforesechips en kit	Agilent Technologies	5067-4626	Agilent High Sensitivity DNA chips en kit
Digitaal elektroforesesysteem	Agilent Technologies	G2939AA	Agilent 2100 Electrophoresis Bioanalyzer
Streptavidinekralen	ThermoFisher Scientific	65306	Dynabeads M-270 Streptavidin
ImmunoPrism Kit – 24 reacties	Cofactor Genomics	CFGK-302	Cofactor ImmunoPrism Immune Profiling Kit – 24 reacties
Human Cot-1 DNA	ThermoFisher Scientific	15279011	Invitrogen-merk
Magnetisch scheidingsrek	Alpaqua/Invitrogen	A001322/12331D	96-well Magnetic Ring Stand
Microcentrifuge	Eppendorf	22620701
Microcentrifugebuisjes	USA Scientific	1415-2600	USA Scientific 1.5 mL low-adhesion microcentrifugebuisje
NextSeq550	Illumina	SY-415-1002	Elke Illumina-sequencer kan worden gebruikt voor dit protocol
Nuclease-vrij water	ThermoFisher Scientific	AM9937
Prism Extraction Kit	Cofactor Genomics	CFGK-401	Cofactor Prism FFPE Extraction Kit – 24 samples
Gezonde RNA	-	-	Gezonde van menselijke weefselmonsters
Fluorometer	ThermoFisher Scientific	Q33226	Qubit 4 System
Fluorometrische Assaybuisjes	Axygen	PCR-05-C	0.5mL Thin Wall PCR Tubes with Flat Caps
Hoge gevoeligheid fluorometrisch reagent kit	Life Technologies	Q32854	Qubit dsDNA HS Assay Kit
Vacuumconcentrator	Eppendorf	22820001	VacufugePlus
Vortexmixer	VWR	10153-838
Waterbad of verwarmingsblok	VWR/USA Scientific	NA/2510-1102	VWR waterbad/USA Scientific verwarmingsblok