Methodenartikel

Multiplexed single cell mRNA sequentieanalyse van embryonale cellen van de muis

DOI:

10.3791/60647

⸱

7 januari 2020

 ,  , 
1Department of Developmental Biology, University of Pittsburgh School of Medicine

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hier presenteerden we een multiplexed single cell mRNA sequencing methode om het profiel van genexpressie in de muis embryonale weefsels. De op droplet gebaseerde enkelvoudige cel mRNA-sequencing (scRNA-SEQ) methode in combinatie met multiplexing strategieën kan afzonderlijke cellen van meerdere monsters tegelijkertijd profiel, wat de kosten van de reagens aanzienlijk verlaagt en experimentele batch-effecten minimaliseert.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Enkelvoudige cel mRNA-sequencing heeft in de afgelopen jaren aanzienlijke vooruitgang geboekt en is uitgegroeid tot een belangrijk instrument op het gebied van ontwikkelingsbiologie. Het is met succes gebruikt om zeldzame celpopulaties te identificeren, nieuwe marker genen te ontdekken en ruimtelijke en temporele ontwikkelings informatie te decoderen. De methode met één cel is ook geëvolueerd van de microfluïdische gebaseerde Fluidigm C1-technologie naar de droplet-gebaseerde oplossingen in de laatste twee tot drie jaar. Hier gebruikten we het hart als een voorbeeld om te laten zien hoe de muis embryonale weefselcellen te profiel met behulp van de druppel gebaseerde scRNA-SEQ methode. Daarnaast hebben we twee strategieën geïntegreerd in de workflow voor het profiel van meerdere samples in één experiment. Met behulp van een van de geïntegreerde methoden, hebben we gelijktijdig meer dan 9.000 cellen geprofileerd uit acht hart monsters. Deze methoden zullen waardevol zijn voor het ontwikkelingsbiologie veld door een kosteneffectieve manier te bieden om afzonderlijke cellen tegelijkertijd te Profiel van verschillende genetische achtergronden, ontwikkelingsstadia of anatomische locaties.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Het transcriptionele profiel van elke afzonderlijke cel varieert tussen de celpopulaties tijdens de embryonale ontwikkeling. Hoewel enkelvoudige moleculaire in-situ hybridisatie kan worden gebruikt om de uitdrukking van een klein aantal genen1te visualiseren, biedt een enkelvoudige cel mRNA-sequencing (Scrna-SEQ) een onpartijdige benadering om genoom-brede expressie patronen van genen in afzonderlijke cellen te illustreren. Nadat het voor het eerst werd gepubliceerd in 20092, is scrna-SEQ toegepast om meerdere weefsels te bestuderen in meerdere ontwikkelingsstadia in de laatste jaren3,4,5. Ook, omdat de Human Cell Atlas onlangs zijn ontwikkelingsgerichte projecten heeft gelanceerd, worden er in de nabije toekomst meer enkelvoudige celgegevens van menselijke embryonale weefsels naar verwachting gegenereerd.

Het hart als het eerste orgel om te ontwikkelen speelt een cruciale rol in de embryonale ontwikkeling. Het hart bestaat uit meerdere celtypen en de ontwikkeling van elk celtype is strak gereguleerd, tijdelijk en ruimtelijk. In de afgelopen jaren, de oorsprong en celafstamming van cardiale cellen in vroege ontwikkelingsstadia zijn gekenmerkt6, die bieden een enorme nuttige navigatie tool voor het begrijpen van aangeboren hart-en vaatziekten pathogenese, evenals voor het ontwikkelen van meer technologisch geavanceerde methoden te stimuleren hartspier regeneratie7.

De scrna-SEQ heeft de laatste jaren8,9,10een snelle expansie ondergaan. Met de nieuw ontwikkelde methodes is het ontwerp en de analyse van eencellige experimenten meer haalbaar geworden11,12,13,14. De hier gepresenteerde methode is een commerciële procedure gebaseerd op de druppel oplossingen (Zie tabel met materialen)15,16. Deze methode is voorzien van het vastleggen van cellen en sets van unieke met kralen in een olie-water emulsie druppel onder controle van een microfluïdisch controller systeem. De snelheid van het laden van cellen in de druppels is extreem laag, zodat de meerderheid van de druppel emulsies slechts één cel17bevatten. Het ingenieuze ontwerp van de procedure komt van scheiding van één cel tot druppel emulsies die gelijktijdig met barcoding plaatsvinden, waardoor de parallelle analyse van afzonderlijke cellen met behulp van RNA-SEQ op een heterogene populatie mogelijk is.

De integratie van multiplexing strategieën is een van de belangrijke toevoegingen aan de traditionele single cell workflow13,14. Deze toevoeging is zeer nuttig bij het verwijderen van celdubbeltjes, het reduceren van experimentele kosten en het elimineren van batch-effecten18,19. Een lipide-gebaseerde barcoding strategie en een antilichaam gebaseerde barcoding strategie (Zie tabel van de materialen) zijn de twee meest gebruikte multiplexing methoden. Specifieke streepjescodes worden gebruikt om elk monster in beide methoden te labelen, en de gelabelde voorbeelden worden vervolgens gemengd voor het vastleggen van één cel, het voorbereiden van bibliotheken en sequentiëren. Daarna kunnen de verzamelde sequentie gegevens worden gescheiden door de barcode sequenties te analyseren (Figuur 1)19. Er bestaan echter aanzienlijke verschillen tussen de twee methoden. De lipide-gebaseerde barcoding strategie is gebaseerd op lipide-gemodificeerde oligonucleotiden, die niet is gebleken dat een voorkeuren voor het celtype. Terwijl de op antilichamen gebaseerde barcoderende strategie alleen de cellen kan detecteren die de antigeen-eiwitten19,20uitdrukken. Bovendien duurt het ongeveer 10 minuten om de lipiden te vlekken, maar 40 min om de antilichamen te vlekken (Figuur 1). Bovendien zijn de lipide-gemodificeerde oligonucleotiden goedkoper dan antilichamen-geconjugeerde oligonucleotiden, maar niet commercieel beschikbaar op het moment van schrijven van dit artikel. Tot slot, de lipide-gebaseerde strategie kan multiplex 96 monsters in één experiment, maar de antilichaam gebaseerde strategie kan momenteel alleen multiplex 12 monsters.

Het aanbevolen celnummer voor multiplex in een enkel experiment moet lager zijn dan 2,5 x 104, anders zal het leiden tot een hoog percentage van celdubbeltjes en potentiële omgevings-mRNA besmetting. Door middel van de multiplexing strategieën, de kosten van het vastleggen van één cel, cDNA generatie en bibliotheek voorbereiding voor meerdere monsters worden gereduceerd tot de kosten van één steekproef, maar de sequentiëren kosten blijft hetzelfde.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De dier procedure is in overeenstemming met de Universiteit van Pittsburgh institutioneel Dierenzorg-en gebruiks Comité (IACUC).

1. embryonale hart dissectie van de muis en voorbereiding van de suspensie voor één cel

Opmerking: deze stap kan een paar uur duren, afhankelijk van het aantal embryo's dat moet worden ontleden.

  1. Om E 18.5 embryonale harten te verwerven, euthaneëren een zwangere CD1 muis door CO2 administratie. Gebruik een scheermesje om het ongewenste haar in de buikstreek te verwijderen en Desinfecteer de huid met 70% ethanol.
  2. Snijd de huid van de buik met een gesteriliseerde schaar en ontleden de embryo's zorgvuldig en zet ze snel in koudfosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) op ijs.
  3. Isoleer harten van elk individueel embryo zorgvuldig in een 10 cm schaal gevuld met koude PBS onder een stereoscopische Microscoop met behulp van een tang en een schaar.
    Let op: Houd de vier kamers intact door de Long met hart samen te snijden en niet direct het hart te vangen/te trekken met chirurgische instrumenten.
  4. Transfer ~ 10 harten in een nieuwe 10 cm schotel gevuld met koude PBS en micro-dissect de harten in linker Atrium, rechter Atrium, linker ventrikel, en rechter ventrikel.
    Opmerking: dit wordt verondersteld meer dan 1 x 106 cellen uit elk monster te leveren. We raden aan om te beginnen met ten minste 1 x 105 cellen per sample.
  5. Breng elk van de 4 kamer weefsels over naar een buis van 1,5 mL en hak ze met een schaar in stukjes. Centrifugeer bij 300 x g gedurende 3 minuten om de weefsels te verzamelen.
  6. Na het opzuigen van de supernatant, voeg 1 mL 0,25% trypsine/EDTA toe aan elke buis en inincuberen in een water bad van 37 °C gedurende 10 min. Pipetteer en laat 7-8 keer zachtjes met een P1000 pipet.
  7. Als de embryonale fase ouder is dan E 11.5, voeg dan 1 mL van 10 mg/mL Collagenase A/B-mengsel toe en incuberen bij 37 °C gedurende 10-20 min. pipetteren zachtjes omhoog en omlaag totdat de meeste cellen zijn losgekoppeld.
  8. Breng de cellen over naar een buis van 15 mL en voeg de gebalanceerde zoutoplossing van 8 mL Hank (HBSS) toe om de enzymen te verdunnen. Draai de cellen op 300 x g gedurende 5 min. onderbreek de cellen in 1 ml PBS en breng ze over naar een buis van 1,5 ml. Filtreer de cellen door een celzeef van 40 μm.
  9. Neem 15 μL volume van elk monster en meng met dezelfde hoeveelheid van 0,04% trypan blauw. Laad dit op een cel tellings kamer en Tel de cellen in een celteller.
    Opmerking: voor het genereren van hoge kwaliteit resultaten, de levensvatbaarheid van de cel wordt aanbevolen hoger dan 95%.

2. eencellige multiplexing-barcode

Opmerking: deze stap duurt ten minste 40 minuten die varieert op basis van het aantal verwerkte monsters. Een clean Bench Area behandeld met RNase decontaminatie oplossing is vereist voor pre-amplificatie stappen (stap 2,11 naar 3,11), en een aparte schone Bench gebied is vereist voor de post-amplificatie stappen (de stappen na 3,11).

  1. Op lipide gebaseerde barcoderende procedure (facultatieve procedure 1)
    1. Houd, op basis van de celconcentratie, minder dan 5 x 105 cellen per monster. Zorg ervoor dat de celsuspensie vrij is van puin en celaggregaten.
    2. Bereid 2 μM anker/barcode stockoplossing en 2 μM co-Anchor stockoplossing voor elk monster (tabel 1).
      Opmerking: het anker en co-anker werden vriendelijk begaafd door Dr. Zev J. Gartner Lab. Voor het synthetiseren van deze lipide-gemodificeerde oligonucleotiden, DNA-sequenties werden geconjugeerd met vetzuren op een solide ondersteuning en gezuiverd door omgekeerde fase High-Performance vloeibare chromatografie (HPLC)18,19.
    3. Was de cellen tweemaal met PBS en verzamel de cellen bij 300 x g gedurende 5 min. cellen in 180 ΜL PBS onderbreken.
    4. Voeg 20 μL anker/barcode stockoplossing toe en Pipetteer zachtjes op en neer om te mengen. Incuberen op ijs gedurende 5 min.
    5. Voeg 20 μL co-anker voorraadoplossing toe en Pipetteer zachtjes op en neer om te mengen en inbroed vervolgens op ijs voor nog eens 5 minuten.
    6. Voeg 1 mL koude PBS toe met 1% BSA en centrifugeer bij 300 x g gedurende 5 minuten bij 4 °c. Was minstens 2 keer met ijskoud 1% BSA in PBS.
    7. Combineer alle monsters samen en filtreer door 40 μm celstrainers. Tel de cellen en houd de celsuspensie op ijs om te gebruiken in rubriek 3.
  2. Procedure voor de barcodering op basis van antilichamen (facultatieve procedure 2)
    1. Centrifugeer 1 x 106-2 x 106 cellen voor elk monster (vanaf stap 1,8) bij 300 x g gedurende 5 minuten en onderbreek ze in 100 μL van de kleurings buffer (tabel 1) in 1,5 ml lage BIND buizen.
    2. Voeg 10 μL FC-blokkerende reagens toe en inincuberen gedurende 10 minuten bij 4 °C.
    3. Bereid antilichamen (Zie tabel van de materialen) door centrifugeren bij 14.000 x g gedurende 10 min bij 2-8 °c.
    4. Voeg 1 μg van elk oligo-geconjugeerd antilichaam toe aan 50 μL celkleurings buffer om antilichaamkleurings oplossing20te maken. Voeg één antilichaamkleurings oplossing toe aan elke monsterbuis. Inincuberen gedurende 30 minuten bij 4 °C.
    5. Spoel cellen 3 keer met 1 mL PBS, draai gedurende 5 minuten bij 350 x g bij 4 °c.
    6. Pool alle monsters op gewenste verhoudingen in 1 mL kleurings buffer, draai gedurende 5 minuten bij 350 x g bij 4 °c.
    7. Respendeer cellen in PBS met een geschikte concentratie (tot 1.500 cellen/μL) en filtreer cellen door een celzeef van 40 μm. Ga onmiddellijk verder met de volgende stap.

3. droplet generatie en mRNA reverse transcriptie

Opmerking: deze stap duurt ongeveer 90 minuten voor één Multiplexed reactie.

  1. Evenwicht van de gelparels (Zie tabel van de materialen) tot kamertemperatuur gedurende 30 min. Neem reagentia van gelbeads-in-emulsie (GEMs) Kit (Zie tabel met materialen) en bewaar ze op de aangegeven temperatuur.
  2. Monteer de chip B in een chip houder (Zie tabel met materialen).
  3. Verdeel 75 μL van 50% glycerol-oplossing in de ongebruikte putjes in rij 1; 40 μL in rij 2; 280 μL in rij 3. Voeg geen glycerol toe in een herstel putje op de bovenste rij van de chip.
  4. Bereid de Master mix op ijs volgens tabel 1. Voeg het juiste volume celsuspensie en Nuclease-vrij water toe aan Master Mix volgens een Cell Suspension volume Calculator tabel17 en Pipetteer de mix zachtjes. Verdeel 75 μL van het celmengsel in het onderste midden van het monster goed in rij 1 zonder de invoering van bubbels.
  5. Vortex de gel kralen voor 30 s met behulp van een Vortex adapter en doseer langzaam 40 μL gel kralen in het onderste midden van de gelkraal goed in rij 2 zonder bubbels te introduceren.
    Opmerking: het is van cruciaal belang om te wachten tot 30 s tussen het toevoegen van cellen en gel kralen om bevochtiging te voorkomen.
  6. Voor de partitioneringsolie goed in rij 3, verdeel 280 μL van de scheidings olie door de zijwand van de put.
    Opmerking: het laden van minder dan 270 μL partitioneringsolie zal leiden tot abnormale edelstenen generatie.
  7. Bevestig de pakking op de chip, druk niet op de pakking en houd deze horizontaal om te voorkomen dat de pakking wordt bevochtigen.
  8. Laad de geassembleerde chip met de pakking in de chromium-controller en voer het Chromium-single cell B-programma uit (Zie tabel met materialen), ga onmiddellijk verder met de volgende stap wanneer het programma is voltooid.
  9. Neem de chip uit en gooi de pakking weg. Vouw de deksel terug om putten bloot te leggen op 45 °, Controleer het vloeistofpeil om er zeker van te zijn dat er geen klompen aanwezig zijn.
  10. Zuig langzaam 100 μL edelstenen van de laagste punten van het herstel goed en controleer de uniformiteit van de edelstenen. Breng edelstenen in een nieuwe polymerase kettingreactie (PCR) Tube op ijs met de pipetpunten tegen de zijwand van de buis.
    Opmerking: als overtollige waterige laag wordt waargenomen, wordt voorgesteld om de monsters opnieuw te bereiden. Belangrijk, neem een foto van het mengsel wanneer de edelstenen nog in de pipetpunten. Deze foto kan zien of er een bevochtigings fout, gedeeltelijk geëmulgeerde edelstenen en reagens klompen zijn. De foto kan ook worden gebruikt als bewijs om terugbetaling te krijgen van het reagens bedrijf met vervangende reagentia en chips.
  11. Plaats de buis in een thermische cycler en voer de omgekeerde transcriptie procedure uit (tabel 2).
    Opmerking: stop hier of ga verder met de volgende stap. Het PCR-product kan maximaal een week bij-20 °C worden bewaard.

4. cDNA-versterking

Opmerking: deze stap duurt ongeveer 150 min.

  1. Eén cel reverse transcriptie opschonen boeken
    1. Haal de cDNA-versterkings reagentia uit de GEMs-Kit (Zie tabel met materialen) en bewaar ze op de aangegeven temperatuur.
    2. Voeg aan het monster bij kamertemperatuur 125 μL van de herstelagent toe om een bifasisch mengsel te verkrijgen. Er dient geen ondoorzichtige vloeistof te worden waargenomen en pipetteren of grondig van het mengsel te vermijden.
    3. Na het wachten op 60 s, Verwijder langzaam 125 μL herstel middel van de bodem van de buis.
    4. Vortex de magnetische kralen (Zie tabel van de materialen) grondig voor 30 s en onmiddellijk gebruiken om kralen Cleanup mengsel te bereiden (tabel 1). Reagentia moeten opeenvolgend worden toegevoegd zoals vermeld.
    5. Vortex de kralen Cleanup mengsel en voeg 200 μL aan het monster. Pipetteer het mengsel 10 keer en inbroed het gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur.
    6. Voeg de reagentia sequentieel toe zoals vermeld in tabel 1 om de elutie-oplossing voor te bereiden en de cDNA als volgt te eldelen.
      1. Plaats de monsters op de magneet (hoge positie) (Zie tabel met materialen) totdat de oplossing wordt gewist en verwijder vervolgens het supernatant.
      2. Voeg 200 μL 80% ethanol toe aan de pellet. Wacht 30 sec. en verwijder de ethanol.
      3. Herhaal stap 4.1.6.2 voor nog eens 2 keer. Centrifugeer kort en plaats op de magneet (lage positie). Verwijder de resterende ethanol en lucht drogen voorzichtig minder dan 2 minuten.
        Opmerking: niet overschrijden lucht drogen afgelopen 2 min, anders zal de elutie-efficiëntie afnemen.
      4. Verwijder het monster uit de magneet. Voeg 35,5 μL elutie oplossing en Pipet toe om 15 keer te mengen. Inincuberen 2 min bij kamertemperatuur.
      5. Plaats het monster op de magneet (hoge positie) totdat de oplossing wordt gewist. Breng 35 μL van het monster over naar een nieuwe buis strook.
        Opmerking: deze zuiverings procedure wordt ook gebruikt in de stappen 4.2.1.6, 4.2.2.3, 5,8, 6.1.10 en 6.2.6. Let op de concentratie van magnetische kralen en het volume van de EB-buffer/ultrapuur water dat wordt gebruikt om de monsters bij elke stap te Elderen.
    7. Kwantificeer de grootte, concentratie en integriteit van geëlueerd cDNA met behulp van een geautomatiseerd elektroforese instrument21 (Zie tabel van de materialen) (Figuur 2).
  2. Versterking van cDNA
    1. cDNA Amplification met behulp van de lipide-gebaseerde barcoding strategie (optionele procedure 1)
      1. Bereid amplificatie reactiemengsel (tabel 1) op ijs.
      2. Voeg het versterkings reactiemengsel toe aan 35 μL cDNA-monsters (vanaf stap 4.1.6.7). Pipetteer het mengsel en centrifugeer kort. Inincuberen van het mengsel in een thermische cycler volgens de cDNA-versterkings procedure (tabel 2).
      3. Voeg na grondig grondig 120 μl Select reagens en 100 μL ultrapuur water toe aan 100 μL monster om een 0,6 x concentratie van het geselecteerde reagens te verkrijgen (Zie tabel met materialen). Pipetteer het mengsel 15 keer.
      4. Incuberen gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur en plaats het monster vervolgens op de magneet totdat de oplossingen duidelijk worden.
        Opmerking: endogene cDNA in de kralen breuk en multiplexing met cDNA is in de supernatant.
      5. Breng de supernatant in een 1,5 ml lage BIND buis voor multiplexing met cDNA Bibliotheek constructie bij stap 6,1.
      6. Reinig de endogene cDNA door de stappen in 4.1.6 te volgen en te elzen met 40 μL EB-buffer.
      7. Voer 1 μL gezuiverd cDNA-monster uit op een geautomatiseerd elektroforese-instrument (Zie tabel met materialen) om het cDNA te analyseren/kwantificeren.
      8. Aliquot 10 μL cDNA in een nieuwe PCR-buis voor de endogene bibliotheek constructie.
        Opmerking: stop hier of ga verder met de volgende stap. Het resterende monster kan maximaal 4 weken in-20 °C worden bewaard om indien nodig extra bibliotheken te genereren.
    2. cDNA-versterking in de barcoderende strategie op basis van antilichamen (facultatieve procedure 2)
      1. Voeg 2 pmol HTO-en ADT-additieve primer en 15 μL cDNA-primers toe aan 50 μL amplificatie reactiemengsel (tabel 1) en voer cDNA-versterking uit met de cDNA-versterkings procedure (tabel 2).
      2. Gebruik 0,6 x Selecteer reagens om endogene cDNA (kralen Fractie) en multiplexing barcode cDNA (in supernatant) te scheiden. Vergeet niet om de supernatant op te slaan om de barcoding Library-constructie uit te voeren in stap 6,2.
      3. Reinig en elueer de endogene transcriptie cDNA door de stappen in 4.1.6 te volgen, voer kwaliteitscontrole (QC) van de bibliotheken uit en aliquot 10 μL in een nieuwe PCR-buis voor de endogene bibliotheek constructie.

5. endogene transcriptie bibliotheek voorbereiding

Opmerking: deze stap duurt ongeveer 120 min.

  1. Houd genexpression Library-bouw reagentia uit de bibliotheekset (Zie tabel met materialen) op respectievelijk de aangegeven temperatuur.
  2. Bereid het fragmentatie mengsel (tabel 1) op ijs, pipet om kort te mengen en te centrifugeren.
  3. Voeg 25 μL EB-buffer toe aan het gezuiverde cDNA-monster (van stap 4.2.1.8 of 4.2.2.3) en voeg het nieuwe 15 μL-fragmentatie mengsel toe aan het monster, Pipetteer het mengsel 15 keer op ijs en centrifugeer kort.
  4. Breng het monster over in een voorgekoelde thermische cycler en start het PCR-programma voor fragmentatie, eind reparatie en A-afvloeiing (tabel 2).
  5. Vortex het Select reagens om magnetische kralen te onderbreken en achtereenvolgens 0,6 x en 0,8 x Select reagentia te gebruiken om een dubbelzijdige maat selectie te maken volgens de gebruikershandleiding17,22. Gebruik 50 μL EB-buffer om het DNA te elzen.
  6. Bereid het ligatie mengsel van de adaptor (tabel 1), Pipetteer het mengsel grondig en centrifugeer kort.
  7. Voeg 50 μL adapter ligatie mengsel toe aan 50 μL monster, pipet meng opnieuw gedurende 15 keer en centrifugeer kort. Voer de ligatie van de adapter volgens het protocol in een thermische cycler (tabel 2).
  8. Gebruik 0,8 x Selecteer reagens om het ligatie product te zuiveren en het gezuiverde monster te elzen met 30 μL EB-buffer (zie stap 4.1.6).
  9. Bereid het PCR-mengsel van de monster index (tabel 1) en voeg 60 μL toe aan het gezuiverde monster. Voeg 10 μL monster index aan het monster toe, Pipetteer 5 keer op en neer en centrifugeer kort, inincuberen in een thermische cycler volgens het sample-index Protocol (tabel 2).
    Opmerking: stop hier of ga verder met de volgende stap. Als er meer dan één put wordt gebruikt, kiest u een specifieke voorbeeldindex (Zie tabel met materialen) voor elke put. Vergeet niet om de index-ID voor elke put op te nemen en ervoor te zorgen dat er geen overlapping in een multiplexed sequentiëren uitgevoerd.
  10. Gebruik achtereenvolgens 0,6 x en 0,8 x Selecteer reagentia om een dubbelzijdige grootte selectie te maken om 35 μL gezuiverde endogene cellulaire bibliotheek DNA17te verwerven.
  11. QC de endogene cellulaire bibliotheek voor sequencing (Figuur 2).

6. voorbereiding van multiplexing voorbeeld streepjescode cDNA-bibliotheken

Opmerking: deze stap duurt ten minste 120 min.

  1. Voorbeeld barcode bibliotheek generatie voor de lipide-gebaseerde multiplexing strategie (optionele procedure 1)
    1. Voeg 520 μL Select reagens en 360 μL isopropanol toe om barcode cDNA uit stap 4.2.1.5 te monster nemen om een 3.2 x Selecteer reagens concentratie te krijgen. Pipetteer het mengsel 10 keer en incuberen bij kamertemperatuur gedurende 5 minuten.
    2. Plaats de buis op een magnetisch rek en wacht tot de oplossing is helder. Gooi het supernatant dan weg.
    3. Gebruik 500 μL van 80% ethanol om kralen tweemaal op een magneet te wassen en 30 s na elke wasbeurt te wachten.
    4. Centrifugeer kort de kralen en plaats ze op een magneet. Verwijder de resterende ethanol met een P10 micropipet en laat de kralen 2 min.
    5. Verwijder de buis uit het magneet rek en rebreng kralen in 50 μL van de EB-buffer. Pipet op en neer om grondig te mengen. Incuberen bij kamertemperatuur gedurende 2 min.
    6. Keer de buis terug naar een magneet en wacht tot de oplossing is helder. Breng de supernatant (voorbeeld barcode cDNA) over naar een nieuwe PCR-buis. Wees voorzichtig om geen kralen over te brengen.
    7. Kwantificeer de concentratie van het monster barcode cDNA23.
    8. Bereid lipide barcode bibliotheek mengsel (tabel 1), toevoegen 3,5 ng van gezuiverde met cDNA (uit stap 6.1.6) en Nuclease-vrij water voor een totaal volume van 50 μl.
    9. Houd het in een thermische cycler na de op lipide gebaseerde barcode wisselaar PCR (tabel 2).
    10. Gebruik 1,6 x Selecteer reagens om het PCR-product te zuiveren en het DNA te elzen met 25 μL EB-buffer (zie stap 4.1.6).
    11. Kwantificeer de concentratie van de bibliotheek met behulp van een hoge gevoeligheid DNA-analysemethode24 van de initiële verdunning van 1:5 (Figuur 2).
  2. Voorbeeld van het genereren van barcode bibliotheek voor de multiplexing-strategie op basis van antilichamen (optionele procedure 2)
    1. Voeg extra 1,4 x reactievolume van Select reagens toe aan het supernatant met voorbeeld barcodes verkregen uit stap 4.2.2.3 om een 2x Selecteer reagens ratio te krijgen.
    2. Was de parels met 80% ethanol door de stappen in 4.1.6 te volgen en de met cDNA met ultrapuur water te elzen.
    3. Voer het selectie protocol met 2x Selecteer reagens voor een tweede keer uit en maak een Elueer met ultrapuur water.
    4. Bereid het mengsel van antilichaam streepjescode bibliotheek (tabel 1) en voeg 45 μL gezuiverde met cDNA uit de laatste stap toe.
    5. Inincuberen in een thermische cycler volgens de antilichaam barcode bibliotheek PCR (tabel 2)20.
    6. Gebruik 1,6 x Selecteer reagens om het PCR-product te zuiveren en het gezuiverde monster te elzen met 30 μL ultrapuur water (zie stap 4.1.6).

7. Sequentiëren van bibliotheken

Opmerking: meerdere sequentiëren platformen van de volgende generatie, zoals HiSeq 4000 en NovaSeq, kunnen worden gebruikt om de endogene transcript bibliotheken en de multiplexing barcode bibliotheken te sequenties.

  1. Gebruik een volgende generatie sequencing platform van keuze om de sequentie van de endogene transcript bibliotheken en multiplexing barcode bibliotheken.
  2. Verdun de bibliotheken volgens de aanbevelingen van een deskundige bij een sequentiëren bedrijf of sequentiëren faciliteit. Minimum 20.000 leesbewerkingen per cel wordt aanbevolen voor de endogene transcript bibliotheek en 3000 leesbewerkingen voor de barcode bibliotheken.

8. gegevensanalyse

Opmerking: de-multiplex de sequentiëren gegevens met behulp van de cloudgebaseerde resource BaseSpace of door het uitvoeren van het pakket bcl2fastq op een UNIX-server.

  1. Endogene transcriptome data-analyse
    1. Met de fastq-gegevens die zijn gegenereerd op basis van demultiplexing-software, voert u "mkfastq" uit op de in de handel verkrijgbare data-analyse pijplijn (Zie tabel met materialen) om elke edelstenen barcode verder te demultiplex.
    2. Voer "Count" uit om de uitlijning, filtering, barcode telling en UMI-telling uit te voeren.
    3. Voer desgewenst ' Aggr ' uit om meerdere volgorde stroken van één experiment samen te voegen.
    4. Gebruik "Cell browser" (Zie tabel met materialen) om gegevens te visualiseren, cluster cellen, Identificeer differentieel uitgedrukt genen, en het genereren van tsne of genexpressie heatmap plots.
    5. Gebruik desgewenst een goed onderhouden R-gebaseerd platform25 (zie tabel met materialen) om gegevens te normaliseren en te schalen, Identificeer differentiaal uitgedrukte genen en Genereer tsne/umap-plots en genexpressie Heatmaps (Figuur 3).
  2. Multiplexing gegevensanalyse van streepjescodes
    1. Analyse van de gegevens van de lipide-gebaseerde barcoding strategie
      1. Gebruik de in de handel verkrijgbare data-analyse pipeline of deMULTIplex R pakket (https://github.com/Chris-McGinnis-UCSF/multi-SEQ) om de voorbeeld barcode fastq-bestanden om te zetten in een voorbeeld van de barcode Umi Count matrix.
      2. Laad de barcode UMI Count matrix samen met endogene transcriptome gegevens naar een R-gebaseerd platform (Zie tabel met materialen) voor integratie analyse (Figuur 3).
    2. Analyse van de gegevens van de strategie voor barcodering op basis van antilichamen
      1. Gebruik ' count ' in de in de handel verkrijgbare pijplijn voor gegevensanalyse om de barcodes in kaart te geven door het CSV-bestand voor de bibliotheek en het hashtag-functie referentiebestand te verstrekken.
      2. Laad de uitvoer Unified feature-barcode matrix, die genexpressie tellingen bevat naast functie streepjescode tellingen voor elke cel streepjescode, naar een R-gebaseerd platform voor downstream analyse.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

In deze studie gebruikten we de muis embryonale hart als een voorbeeld om te exposeren hoe Multiplexed single cell mRNA sequencing werd uitgevoerd om de verschillende monsters uit afzonderlijke delen van een orgaan tegelijkertijd te verwerken. E 18.5 CD1 muis harten werden geïsoleerd en ontleed in linker Atrium (LA), rechter Atrium (RA), linker ventrikel (LV) en rechter ventrikel (RV). De atriale en ventriculaire cellen werden vervolgens onafhankelijk van elkaar met behulp van een op lipi...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

In deze studie hebben we een protocol getoond om transcriptionele profielen van één cel te analyseren. We hebben ook twee optionele methoden beschikbaar gesteld voor het multiplex van samples in de scRNA-SEQ-workflow. Beide methoden zijn haalbaar gebleken bij verschillende laboratoria en aangeboden oplossingen voor het uitvoeren van een kostenbesparend en batch-effect-vrije eencellige experiment18,26.

Er zijn een paar stappen die zorgv...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs hebben geen belangenconflicten te onthullen.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

We danken David M. Patterson en Christopher S. McGinnis van Dr. Zev J. Gartner Lab voor hun vriendelijke aanbod van de op lipide gebaseerde barcoderende reagentia en suggesties voor de experimentele stappen en data-analyse. Dit werk werd opgericht door de National Institutes of Health (HL13347202).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
10% Tween-20Bio-Rad1610781
10x Chip Holder10x Genomics120252 330019
10x Chromium Controller10x Genomics120223
10x Magnetic Separator10x Genomics120250 230003
10x Vortex Adapter10x Genomics330002, 120251
10x Vortex Clip10x Genomics120253 230002
4200 TapeStation SystemAgilentG2991AA
Agilent High Sensitivity DNA KitAgilent5067-4626University of Pittsburgh Health Sciences Sequencing Core
Barcode OligoIntegrated DNA TechnologiesSingle-stranded DNA25 nmol
Buffer EBQiagen19086
CD1 miceChales RiverStrain Code 022ordered pregnant mice
Centrifuge 5424RAppendorf2231000214
Chromium Chip B Single Cell Kit, 48 rxns10x Genomics1000073Store at ambient temperature
Chromium i7 Multiplex Kit, 96 rxns10x Genomics120262Store at -20 °C
Chromium Single Cell 3' GEM Kit v3,4 rxns10x Genomics1000094Store at -20 °C
Chromium Single Cell 3' Library Kit v310x Genomics1000095Store at -20 °C
Chromium Single Cell 3' v3 Gel Beads10x Genomics2000059Store at -80 °C
Collagenase ASigma/Millipore10103578001Store powder at 4 °C, store at -20 °C after it dissolves
Collagenase BSigma/Millipore11088807001Store powder at 4 °C, store at -20 °C after it dissolves
D1000 ScreenTapeAgilent5067-5582University of Pittsburgh Health Sciences Sequencing Core
DNA LoBind Tube Microcentrifuge Tube, 1.5 mLEppendorf022431021
DNA LoBind Tube Microcentrifuge Tube, 2.0 mLEppendorf022431048
Dynabeads MyOne SILANE10x Genomics2000048Store at 4 °C, used in Beads Cleanup Mix (Table 1)
DynaMag-2 MagnetTheromo Scientific12321D
Ethanol, Pure (200 Proof, anhydrous)SigmaE7023-500mL
Falcon 15mL High Clarity PP Centrifuge TubeCorning Cellgro14-959-70C
Falcon 50mL High Clarity PP Centrifuge TubeCorning Cellgro14-959-49A
Fetal Bovine Serum, qualified, United StatesFisher Scientific26140079Store at -20 °C
Finnpipette F1 Multichannel Pipettes, 10-100μlTheromo Scientific4661020N
Finnpipette F1 Multichannel Pipettes, 1-10μlTheromo Scientific4661000N
Flowmi Cell StrainerSigmaBAH136800040Porosity 40 μm, for 1000 uL Pipette Tips, pack of 50 each
Glycerin (Glycerol), 50% (v/v)Ricca Chemical Company3290-32
HBSS, no calcium, no magnesiumThermo Fisher Scientific14170112
Human TruStain FcX (Fc Receptor Blocking Solution)BioLegend422301Add 5 µl of Human TruStain FcX per million cells in 100 µl staining volume
Isopropanol (IPA)Fisher ScientificA464-4
Kapa HiFi HotStart ReadyMix (2X)Fisher ScientificNC0295239Store at -20 °C, used in Lipid-tagged barcode library mix (Table 1)
Lipid Barcode Primer (Multi-seq Primer)Integrated DNA TechnologiesSingle-stranded DNA100 nmol
Low TE Buffer (10 mM Tris-HCl pH 8.0, 0.1 mM EDTA)Thermo Fisher Scientific12090-015
MasterCycler ProEppendorf950W
Nuclease-Free Water (Ambion)Thermo Fisher ScientificAM9937
PCR Tubes 0.2 ml 8-tube stripsEppendorf951010022
Phosphate-Buffered Saline (PBS) 1X without calcium & magnesiumCorning Cellgro21-040-CV
Phosphate-Buffered Saline (PBS) with 10% Bovine Albumin (alternative to Thermo Fisher product)Sigma-AldrichSRE0036
Pipet 4-pack (0.1–2.5μL, 0.5-10μL, 10–100μL, 100–1,000μL variable-volume pipettesFisher Scientific05-403-151
Selection reagent (SPRIselect Reagent Kit)Beckman CoulterB23318 (60ml)
Template Switch Oligo10x Genomics3000228Store at -20 °C, used in Master Mix (Table 1)
The antibody based barcoding strategy is also known as Cell Hashing
The cell browser is Loup Cell Browser10x Genomicshttps://support.10xgenomics.com/single-cell-gene-expression/software/visualization/latest/what-is-loupe-cell-browser
The commercial available analysis pipline in step 8.1 is Cell Ranger10x Genomics

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Raj, A., Van Den Bogaard, P., Rifkin, S. A., Van Oudenaarden, A., Tyagi, S. Imaging individual mRNA molecules using multiple singly labeled probes. Nature Methods. 5 (10), 877(2008).
  2. Tang, F., et al. mRNA-Seq whole-transcriptome analysis of a single cell. Nature Methods. 6 (5), 377(2009).
  3. Li, G., Plonowska, K., Kuppusamy, R., Sturzu, A., Wu, S. M. Identification of cardiovascular lineage descendants at single-cell resolution. Development. 142 (5), 846-857 (2015).
  4. DeLaughter, D. M., et al. Single-cell resolution of temporal gene expression during heart development. Developmental Cell. 39 (4), 480-490 (2016).
  5. Li, G., et al. Single cell expression analysis reveals anatomical and cell cycle-dependent transcriptional shifts during heart development. Development. 146 (12), dev173476(2019).
  6. Meilhac, S. M., Buckingham, M. E. The deployment of cell lineages that form the mammalian heart. Nature Reviews Cardiology. 1, (2018).
  7. Liu, Z., et al. Single-cell transcriptomics reconstructs fate conversion from fibroblast to cardiomyocyte. Nature. 551 (7678), 100(2017).
  8. Lafzi, A., Moutinho, C., Picelli, S., Heyn, H. Tutorial: guidelines for the experimental design of single-cell RNA sequencing studies. Nature Protocols. 1, (2018).
  9. The Tabula Muris Consortium. Single-cell transcriptomics of 20 mouse organs creates a Tabula Muris. Nature. 562 (7727), 367(2018).
  10. Gawad, C., Koh, W., Quake, S. R. Single-cell genome sequencing: current state of the science. Nature Reviews Genetics. 17 (3), 175(2016).
  11. Grün, D., van Oudenaarden, A. Design and analysis of single-cell sequencing experiments. Cell. 163 (4), 799-810 (2015).
  12. Ziegenhain, C., et al. Comparative analysis of single-cell RNA sequencing methods. Molecular cell. 65 (4), 631-643 (2017).
  13. Hashimshony, T., et al. CEL-Seq2: sensitive highly-multiplexed single-cell RNA-Seq. Genome Biology. 17 (1), 77(2016).
  14. Islam, S., et al. Characterization of the single-cell transcriptional landscape by highly multiplex RNA-seq. Genome Research. 21 (7), 1160-1167 (2011).
  15. Macosko, E. Z., et al. Highly parallel genome-wide expression profiling of individual cells using nanoliter droplets. Cell. 161 (5), 1202-1214 (2015).
  16. Klein, A. M., et al. Droplet barcoding for single-cell transcriptomics applied to embryonic stem cells. Cell. 161 (5), 1187-1201 (2015).
  17. Library Prep -Single Cell Gene Expression -Official 10x Genomics Support. , 10x Genomics. https://support.10xgenomics.com/single-cell-gene-expression/library-prep (2018).
  18. McGinnis, C. S., et al. MULTI-seq: sample multiplexing for single-cell RNA sequencing using lipid-tagged indices. Nature Methods. 1, (2019).
  19. Stoeckius, M., et al. Cell hashing with barcoded antibodies enables multiplexing and doublet detection for single cell genomics. Genome Biology. 19 (1), 224(2018).
  20. Chan, M. M., et al. Molecular recording of mammalian embryogenesis. Nature. 570 (7759), 77-82 (2019).
  21. Agilent 4200 TapeStation System. , Agilent. https://www.agilent.com/cs/library/datasheets/public/5991-6029EN.pdf (2019).
  22. SPRIselect User Guide. , Beckman Coulter. https://research.fhcrc.org/content/dam/stripe/hahn/methods/mol_biol/SPRIselect%20User%20Guide.pdf (2012).
  23. Qubit 4 Fluorometer User Guide. , Thermo Fisher Scientific. https://assets.thermofisher.com/TFS-Assets/LSG/manuals/MAN0017209_Qubit_4_Fluorometer_UG.pdf (2018).
  24. Agilent High Sensitivity DNA Kit Guide. , Agilent. https://www.agilent.com/cs/library/usermanuals/public/High%20Sensitivity_DNA_KG.pdf (2016).
  25. Butler, A., Hoffman, P., Smibert, P., Papalexi, E., Satija, R. Integrating single-cell transcriptomic data across different conditions, technologies, and species. Nature Biotechnology. 36 (5), 411(2018).
  26. Weber, R. J., Liang, S. I., Selden, N. S., Desai, T. A., Gartner, Z. J. Efficient targeting of fatty-acid modified oligonucleotides to live cell membranes through stepwise assembly. Biomacromolecules. 15 (12), 4621-4626 (2014).
  27. Single Cell Protocols Cell Preparation Guide. , 10x Genomics. https://support.10xgenomics.com/single-cell-gene-expression/sample-prep (2017).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Single Cell mRNA SequencingMultiplexed scRNA SeqMouse Embryonic CellsDroplet Based MethodHeart Tissue ProfilingCellular Heterogeneity AnalysisGene Ontology PathwayCell Type AnnotationAnatomical Zone ComparisonBarcoded cDNA Library

Gerelateerde artikelen