Efficiënt transcriptionally Gecontroleerd Plasmid Expression System voor onderzoek van de stabiliteit van mRNA Transcripts in primaire Alveolar EpitheelCellen

Summary

Hier presenteren we een tool die kan worden gebruikt om de posttranscriptional modulatie van een transcript in primaire alveolar epitheelcellen te bestuderen met behulp van een induceerbaar expressiesysteem gekoppeld aan een pipet elektroporatietechniek.

Abstract

Het bestuderen van posttranscriptional regulatie is fundamenteel voor het begrijpen van de modulatie van een bepaalde boodschapper RNA (mRNA) en de impact ervan op cel homeostase en metabolisme. Inderdaad, schommelingen in transcript expressie zou kunnen wijzigen van de vertaling efficiëntie en uiteindelijk de cellulaire activiteit van een transcript. Verschillende experimentele benaderingen zijn ontwikkeld om de half-life van mRNA te onderzoeken, hoewel sommige van deze methoden beperkingen hebben die de juiste studie van posttranscriptional modulatie voorkomen. Een promotor inductiesysteem kan een gen van belang uitdrukken onder de controle van een synthetische tetracycline-gereguleerde promotor. Deze methode maakt de half-life schatting van een bepaalde mRNA onder een experimentele aandoening zonder storende cel homeostase. Een groot nadeel van deze methode is de noodzaak om cellen transfect, die het gebruik van deze techniek in geïsoleerde primaire cellen die zeer resistent zijn tegen conventionele transfection technieken beperkt. Alveolar epitheelcellen in de primaire cultuur zijn uitgebreid gebruikt om de cellulaire en moleculaire biologie van het alveolar epitheel te bestuderen. De unieke kenmerken en fenotype van primaire alveolarcellen maken het essentieel om de posttranscriptionalmodulaties van genen van belang in deze cellen te bestuderen. Daarom was ons doel om een nieuw instrument te ontwikkelen om de posttranscriptional modulaties van mRNAs van belang in alveolar epitheelcellen in primaire cultuur te onderzoeken. We ontwierpen een snel en efficiënt transieel transfection protocol om een transcriptiegestuurd plasmidexpressiesysteem in primaire alveolar epitheelcellen te plaatsen. Deze kloonstrategie, met behulp van een virale epitope om de constructie te taggen, zorgt voor de gemakkelijke discriminatie van constructexpressie uit die van endogene mRNAs. Met behulp van een gewijzigde ΔΔ kwantificeringscyclus (Cq) methode, kan de expressie van het transcript vervolgens worden gekwantificeerd op verschillende tijdstippen om de halfwaardetijd te meten. Onze gegevens tonen de efficiëntie van deze nieuwe aanpak bij het bestuderen van posttranscriptional regulatie in verschillende pathofysiologische omstandigheden in primaire alveolar epitheelcellen.

Introduction

Er zijn verschillende technieken ontwikkeld om de halflevensduur van mRNAs te bepalen. De pulse-chase verval techniek, die gebruik maakt van gelabelde mRNAs, zorgt voor de gelijktijdige evaluatie van een grote pool van mRNAs met minimale cellulaire verstoring. Deze benadering staat echter geen directe schatting toe van de halfringstijd van één enkel gentranscript en kan niet worden uitgevoerd om de posttranscriptional modulatie van een mRNA te bestuderen na stimulatie met groeifactoren, ROS, alarminen of^ontsteking1.

Het gebruik van transcriptieremmers, zoals actinomycine D en α-amanitine, is een relatief eenvoudige methode voor het meten van mRNA afbraakkinetiek in de tijd. Een belangrijk voordeel van deze aanpak ten opzichte van die van eerdere technieken(d.w.z. pulse-chase) is afhankelijk van de mogelijkheid om de halfduur van een bepaald transcript direct in te schatten en te vergelijken hoe verschillende behandelingen de afbraakkinetiek kunnen beïnvloeden. De aanzienlijke schadelijke impact van transcriptieremmers op de celfysiologie vormt echter een groot nadeel van de aanpak². Inderdaad, de remming van de hele cel transcriptome met deze geneesmiddelen heeft de negatieve bijwerking van verstoren de synthese van belangrijke elementen die betrokken zijn bij mRNA stabiliteit, zoals microRNAs (miRNAs), evenals de expressie en synthese van RNA-bindende eiwitten, die belangrijk zijn voor mRNA afbraak en stabiliteit. De ernstige verstoring van gentranscriptie door deze geneesmiddelen zou daarom de degradatiekrommen van transcripties artefactually kunnen wijzigen.

Het promotorinductiesysteem vertegenwoordigt een derde benadering om de halfduur van een specifiek mRNA te meten. Deze methode meet de afbraak van een specifiek mRNA op een vergelijkbare manier als methoden die transcriptieremmers gebruiken. Er worden vaak twee soorten inductiesystemen gebruikt: de door serum geïnduceerde c-fos promotor³ en het Tet-Off onducible systeem⁴. Met het c-fos-systeem is het gebruik van transcriptieremmers die giftig kunnen zijn voor de cel niet nodig. Deze methode vereist echter synchronisatie van de celcyclus, waardoor de evaluatie van de werkelijke stabiliteit van een transcript tijdens interfase⁵wordt voorkomen. Het Tet-Off-systeem maakt daarentegen de sterke expressie van het gen of interest (GoI) mogelijk onder controle van een synthetische tetracycline-gereguleerde promotor. Dit systeem vereist de aanwezigheid van twee elementen die moeten worden gecotransfected in de cel functioneel te zijn. De eerste plasmid (pTet-Off) drukt het regelgevende eiwit tTA-Adv uit, een hybride synthetische transcriptiefactor bestaande uit de prokaryotische repressor TetR (van Escherichia coli) versmolten tot drie transcriptietransactivatiedomeinen van het virale eiwit HSV VP16. De Ingoi wordt gekloond in de pTRE-Tight plasmid onder controle van een synthetische promotor (P_Tight),bestaande uit de minimale volgorde van het cytomegalovirus (CMV) promotor gesmolten tot zeven herhalingen van de tetO operator sequentie. De transcriptie van het gen stroomafwaarts van P_Tight is afhankelijk van de interactie van TetR met tetO. In aanwezigheid van tetracycline of zijn afgeleide, doxycycline, verliest de TetR-onderdrukker zijn affiniteit met de tetO-operator, wat leidt tot een stopzetting van de transcriptie⁴. De kenmerken van het Tet-Off-systeem maken het een ideaal model voor de studie van specifieke mRNA-expressie in eukaryotische cellen, terwijl potentiële pleiotropische effecten worden vermeden die ondergeschikt zijn aan de afwezigheid van prokaryotische regulerende sequenties in eukaryotische cel⁶. Meestal worden dubbel stabiele Tet-Off-cellijnen (HEK 293, HeLa en PC12) met dit systeem gebruikt om kopieën van de regulator en responsplasmids te integreren voor gemakkelijke toegang tot controleerbare genexpressie^7,8,9.

Verschillende modellen van alveolar epitheelcellen in de cultuur zijn gebruikt om de cellulaire en moleculaire biologie van het alveolar epitheel te bestuderen. Jarenlang hebben onderzoekers op grote schaal gebruik gemaakt van menselijke of knaagdier primaire cellen^10,11 evenals vereeuwigde cellijnen zoals de menselijke A549 of rat RLE-6TN cellen^12,13. Hoewel ze over het algemeen minder proliferative en moeilijker te kweken en transfect, alveolar epitheel cellen in de primaire cultuur blijven de gouden standaard voor de studie van de functie en disfunctie van de alveolar epitheel in fysiologische en pathologische omstandigheden. Inderdaad, vereeuwigde cellijnen zoals A549 cellen vertonen niet de complexe kenmerken en fenotypen van primaire cellen, terwijl alveolar epitheliale cellen in de primaire cultuur de belangrijkste eigenschappen van het alveolaire epitheel samenvatten, met name het vermogen om een gepolariseerde en strakke barrière te vormen^14,15. Helaas zijn deze cellen zeer resistent tegen conventionele transfection technieken, zoals die gebruik te maken van liposomen, waardoor het gebruik van een promotor-geïnduceerde systeem zoals Tet-Off zeer moeilijk.

De posttranscriptional modulatie van mRNAs is een van de meest effectieve methoden voor het snel moduleren van de genexpressie van een transcript¹⁶. De onvertaalde regio mRNA 3 (3' UTR) speelt een belangrijke rol in dit mechanisme. Het is aangetoond dat, in tegenstelling tot de 5' UTR, er een exponentiële correlatie is tussen de lengte van de 3' UTR en de cellulaire en morfologische complexiteitvan een organisme. Deze correlatie suggereert dat de 3' UTR, net als de mRNA-coderingsgebieden, is onderworpen aan natuurlijke selectie om in evolutie¹⁷steeds complexere posttranscriptiemogelijk te maken. De 3' UTR bevat verschillende bindende sites voor eiwitten en miRNAs die de stabiliteit en vertaling van het transcript beïnvloeden.

In het huidige werk ontwikkelden we een tool om de rol van sterk bewaarde domeinen in de 3' UTR van een InI voor de controle van de stabiliteit van het transcript te onderzoeken. We richtten ons op het epitheliale natriumkanaal, alfa subunit (αENaC), die een belangrijke rol speelt in alveolar epitheelfysiologie¹⁸. Alveolar epitheelcellen in de primaire cultuur werden met succes tijdelijk transfected met de twee componenten van het Tet-Off-systeem, dat het mogelijk maakt voor de studie van de rol van de 3' UTR in mRNA stabiliteit met een systeem dat minimaal van invloed op de celfysiologie en metabolisme in vergelijking met het gebruik van transcriptieremmers met andere protocollen. Een kloonstrategie werd ontwikkeld om de expressie van de Ini te onderscheiden van die van het endogene gen met behulp van een nonendogene uitgedrukte epitope (V5). De respons en regelgevende plasmiden werden vervolgens overgebracht naar alveolar epitheel cellen met behulp van een pipet elektroporatie techniek. Vervolgens werd de expressie van het transcript gemeten door de cellen met doxycycline op verschillende tijdstippen uit te broeden. De halfwaardetijd van het transcript werd geëvalueerd door RT-qPCR met een aangepaste Cq-methode met behulp van het transfected tTA-Ad mRNA product voor normalisatie. Door middel van ons protocol bieden we een handige manier om de posttranscriptional modulatie van een transcript onder verschillende voorwaarden te bestuderen en de betrokkenheid van de onvertaalde regio's in meer detail te definiëren.

Protocol

Alle dierprocedures werden uitgevoerd volgens de richtlijnen van de Canadian Council on Animal Care en zijn goedgekeurd door het Institutioneel Comité voor dierenverzorging van het Onderzoekscentrum van Centre Hospitalier de l'Université de Montréal (CRCHUM).

1. Ontwerp en generatie van de respons plasmid uitdrukken van het gen van belang (IGoI)

1. Gebruik een inducible tetracycline-off vector, zoals pTRE-Tight.
2. Analyseer de volgorde van de GoI en de meervoudige kloonsite (MCS) van de vector om de beperkingssites in de MCS te identificeren die intern niet in de GoI aanwezig zijn.
3. Isoleer primaire alveolar epitheelcellen uit mannelijke Sprague-Dawley rattenlongen zoals eerder beschreven^19,20.
4. Zuiver het totale RNA uit de alveolar epitheelcellen door RNA-extractie met behulp van een standaardmethode, zoals fenol/chloroformextractie of het gebruik van op silica gebaseerde RNA-spinkolommen.
5. Reverse-transcriberen van de mRNA in complementaire DNA (cDNA) met behulp van oligo (dT) en high-fidelity reverse transcriptase.
6. Gebruik high-fidelity Taq polymerase en standaard overlappende PCR-technieken om de GoI te flankeren met twee geselecteerde restrictieenzymherkenningssites met behulp van ontworpen primers.
   1. Laat de voorwaartse primer een Kozak consensus riosome binding site²¹ bevatten om expressieniveaus te verbeteren om eiwitexpressie parallel met mRNA-stabiliteit te bestuderen. Een sequentie die het V5-epitoop stroomopwaarts van de Ing codeert, moet worden opgenomen om de expressie van de transfected Ing i.g. te onderscheiden van endogene expressie(tabel 1).
   2. Laat de omgekeerde primer een polyadenylation signaal bevatten na de stop codon.
7. Mutanten kunnen worden gegenereerd door sequentiële verwijdering om de effecten van verschillende 3' UTR-regio's op de stabiliteit van het mRNA van de Ini te bestuderen met behulp van omgekeerde primers die een polyadenylationsite coderen die geleidelijk het einde van de 3' 3' UTR(figuur 6)verwijdert. Als alternatief kan pcr-gerichte mutagenese worden gebruikt om zich te richten op een specifieke interesseregio in de 3' UTR²².
8. Verwerk de induceerbare vector en de wisselplaat met de eerder gekozen beperkingsenzymen bij de juiste incubatietemperatuur gedurende 1 uur, gevolgd door behandeling met fosphatase tijdens de vectorreactie gedurende 30 min om zelfligatie te voorkomen.
9. Scheid de verteerde vector en voeg segmenten door elektroforese in een 1-1,5% agarosegel (concentratie afhankelijk van de grootte van de wisselplaat).
10. Verzamel met behulp van een mes en een UV-licht de DNA-fragmenten met de gewenste wisselplaat en vector die moeten worden vastgestomeerd.
    LET OP: Het protocol kan hier worden onderbroken.
11. Zuiver de verzamelde segmenten van de agarosegel met behulp van een op silica gebaseerde PCR-zuiveringskit en meet de concentratie door spectrofotometrie op 260 nm.
12. Ligate de Ini en de onducible vector met T4 DNA ligase met behulp van een vector: voeg molaire verhouding van 1:3 om de kans op ligatie te verhogen. Incubeer de reactie bij kamertemperatuur (RT) gedurende 3 uur.
13. Zet de ligatiereactie om in competente E. coli (DH5α).
    1. Voeg 1-10 ng vector en gen toe aan een buis met 100 μL competente cellen. Incubeer de cellen 30 min op ijs en verwarm vervolgens de cellen bij 42 °C voor 45 s. Plaats de buis gedurende 2 min op ijs en voeg 900 μL RT LB-medium toe. Incubeer de cellen gedurende 1 uur bij 37 °C met schudden bij 225 tpm.
    2. Verspreid 100 μL van de reactie op een LB agar plaat met een geschikt antibioticum (bijvoorbeeld 100 μg/mL ampicillin voor de pTRE-Tight vector) om de getransformeerde bacteriën te selecteren. Incubeer de plaat 's nachts bij 37 °C.
    3. Selecteer individuele kolonies met behulp van een inentingslus of een 20 μL-tip en incubeer 's nachts in 5 mL LB-medium met het geschikte antibioticum bij 37 °C met schudden. De getransformeerde bacteriën kunnen worden opgeslagen in glycerolvoorraden bij -80 °C bij een verhouding van 400:600 LB-medium tot glycerol.
14. Haal het plasmide-DNA eruit met behulp van plasmakolommen op basis van silica en meet de concentratie per spectrofotometrie op 260 nm. Bevestig de invoeging van de Ingoi door beperkingsanalyse en de oriëntatie ervan en de afwezigheid van mutaties die mogelijk tijdens RT-PCR worden geïntroduceerd door sequencing.

2. Transfection van de respons plasmid die het gen van belang (Initi) uitdrukt in primaire alveolar epitheelcellen

1. Isoleer type II alveolar epitheelcellen van rattenlongen.
2. Zaai de cellen met een dichtheid van 1 x 10⁶ cellen/cm² in 100 mm petrischaaltjes met een volledig minimaal essentieel medium (volledige MEM). Complete MEM is MEM aangevuld met 10% FBS, 0,08 mg/L tobramycine, Septra (3 μg/mL trimethoprim en 17 μg/mL sulfamethoxazool), 0,2% NaHCO₃, 0,01 M HEPES (pH = 7.3) en 2 mM L-glutamine. Kweek de cellen 24 uur bij 37 °C in 5% CO₂ in een bevochtigde couveuse.
3. Plaats de volgende dag 500 μL volledige MEM zonder antibioticum in elke put van een nieuwe 12-putplaat en verwarm de plaat 30 minuten lang bij 37 °C. Tijdens deze stap is het belangrijk om foetale runderserum te gebruiken dat vrij is van contaminatie tetracyclines of met een te laag niveau om de inducibiliteit te verstoren.
4. Bereid 1,5 mL buizen met de plasmid met de inducible GoI (Goi plasmid) en de regelgevende vector (bijvoorbeeld pTet-Off) door toevoeging van 1 μg Ini plasmid en 1 μg van regelgevende vector per goed bij RT. Voor coexpressieexperimenten met RNA-bindende eiwitten (RBP) wordt 1 μg van een constitutieve vector (bijvoorbeeld pcDNA3) die de RPB van belang uitdrukt, toegevoegd aan de DNA-mix (figuur 7).
5. Aanzuigen van het medium en voorzichtig spoelen de cellen met PBS (zonder calcium en magnesium) voorverwarmd op 37 °C.
6. Voeg 5 mL van 0,05% trypsine voorverwarmd bij 37 °C en uitbroed de cellen tot de cellen zijn losgemaakt (2-4 min). Neutraliseer de trypsine door 10 mL volledig MEM toe te voegen zonder antibioticum.
7. Verzamel de celsuspensie in een buis van 50 mL, was de petrischaal met 4 mL medium om zoveel mogelijk resterende cellen te verzamelen en centrifugeer vervolgens de celsuspensie bij 300 x g gedurende 5 min.
8. Trek de supernatant voorzichtig aan en gooi de pellet opnieuw op in 1 mL PBS. Tel en bereken het aantal cellen met behulp van een hemocytometer.
9. Centrifugeer de cellen op 300 x g gedurende 5 min. Zuig de supernatant voorzichtig aan en breg de pellet opnieuw op in resuspensiebuffer bij een concentratie van 4 x 10⁷ cellen/mL. Voeg de cellen van de 1,5 mL buis bereid in stap 2.4 bij een concentratie van 400.000 cellen per put en meng ze voorzichtig door op en neer te stampen.
10. Plaats de buis in de elektroporatie-inrichting en vul deze met 3,5 mL elektrolytische buffer.
11. Steek een vergulde elektrodetip in een pipet door de zuiger volledig te drukken. Meng voorzichtig de inhoud van de 1,5 mL buis en trek de cellen voorzichtig aan met de pipet. Wees voorzichtig om te voorkomen dat luchtbellen de tip binnendringen, omdat dit elektrische arcing zal veroorzaken tijdens elektroporatie en zal leiden tot verminderde transfection-efficiëntie.
12. Steek de pipet in het elektroporatiestation totdat er een klikkend geluid is.
13. Selecteer het juiste elektroporatieprotocol voor alveolar epitheelcellen, overeenkomend met een pulsspanning van 1.450 V en 2 pulsen met een breedte van 20 ms, en druk op Start op het touchscreen.
14. Onmiddellijk na het transfection, verwijder de pipet en breng de cellen naar een goed eerder gevuld met volledige MEM zonder antibioticum dat is voorverwarmd tot 37 °C.
15. Herhaal stap 2.11-2.14 voor de overige monsters.
16. Schud de plaat voorzichtig om de cellen gelijkmatig over het putoppervlak te verspreiden. Incubeer de cellen bij 37 °C in 5% CO₂ in een bevochtigde couveuse. Vervang na 2 dagen het medium door volledige MEM door antibiotica.
17. Bevestig het succes van de transfection door de expressie van eGFP onder een fluorescentiemicroscoop of door stroomcytometrie te observeren met behulp van een controlevector (figuur 1).
    OPMERKING: Deze stap is optioneel en vereist een extra transfection stap met behulp van een andere plasmid uitdrukken eGFP, zoals pcDNA3-EGFP.

3. Inductie van de transcriptieremming van de Indez

OPMERKING: De cellen kunnen worden voorbehandeld met de gewenste behandelingen vóór doxycycline inductie om hun impact op mRNA stabiliteit te beoordelen (figuur 5).

1. Bereid een doxycycline stock oplossing van 1 mg/mL in gedeïoniseerd water. Bewaar de voorraadoplossing op -20 °C beschermd tegen licht. Doxycycline, een tetracycline derivaat, wordt gebruikt in plaats van tetracycline omdat het een langere half-life (2x) dan tetracycline heeft. Bovendien is een lagere concentratie van doxycycline vereist voor de volledige inactivering van de tet operon²³.
   OPMERKING: Doxycycline kan de mRNA-expressie van de endogene IG beïnvloeden. Om dit te verifiëren, moet het effect van een behandeling van 24 uur met doxycycline op alveolarcellen worden getest om de afwezigheid van veranderingen in de Init-expressie te bevestigen (figuur 2).
2. Bereid een verse 1 μg/mL doxycycline oplossing in volledige MEM 72 h posttransfection en verwarm deze tot 37 °C.
3. Vervang het medium door 1 mL volledig MEM met 1 μg/mL doxycycline per put om de transcriptie van de Ini te remmen.
4. Incubeer meerdere putten bij 37 °C in 5% CO₂ voor verschillende hoeveelheden tijd van 15 min-6 uur om de mRNA halfwaardetijd van de Ini te beoordelen.
5. Aan het einde van de behandeling, was de cellen met ijskoude PBS en lyse ze met een commercieel beschikbare fenol-chloroform RNA extractie kit door het toevoegen van 500 μL buffer per put en schudden van de plaat om de cellen te homogeniseren.
6. Isoleer het RNA volgens het protocol van de fabrikant. Bepaal de RNA-opbrengst en -zuiverheid door spectrofotometrie op 230, 260 en 280 nm. RNA-monsters met respectievelijk 260:230 en 260:280-ratio's van respectievelijk 1,8 en 2,0 worden als zuiver beschouwd.
   LET OP: Het protocol kan hier worden onderbroken.

4. Het bepalen van de mRNA stabiliteit van de Indev.

1. Behandel 1 μg totaal RNA met RNAse-vrije DNAse I (versterkingsgraad) om elk spoor van plasmidDNA te verwijderen dat de daaropvolgende DNA-versterking zou kunnen verstoren.
   1. Combineer in een 0,2 mL PCR-buis 1 μg totaal RNA, 1 μL van 10x DNase I-reactiebuffer, 1 μL DNAse I (1 U/μL) en RNAse-vrij water om een totaal volume van 10 μL te verkrijgen.
   2. Incubeer de reactie bij RT gedurende 20 min.
   3. Deactiveer DNAse I door 1 μL van 25 mM EDTA toe te voegen aan de 10 μL-reactiemix en de reactie gedurende 10 min bij 70 °C uit te broeden.
2. Reverse-transcriberen van de DNA-uitgeput totale RNA in cDNA met behulp van een commercieel beschikbare cDNA synthese kit met een mix van oligo (dT) en willekeurige hexamer primers om de omgekeerde transcriptie efficiëntie te verbeteren.
   1. Voeg kort 4 μL 5x reactiemix, 1 μL omgekeerde transcriptase en 4 μL RNAse-vrij water toe aan 11 μL van de DNA-uitgeputte totale RNA-mix om een totaal reactievolume van 20 μL te verkrijgen. Meng de reactie goed door het op en neer te beten.
   2. Incubeer de reactie gedurende 5 min bij 25 °C, gevolgd door 20 min bij 46 °C, en activeer vervolgens de reactie door deze gedurende 1 min bij 95 °C uit te broeden. Elke reactie levert 50 ng/μL cDNA-product op.
   3. Verdun de cDNA-reactie tot een concentratie van 5 ng/μL door 180 μL moleculair biologisch waardig water toe te voegen aan de 20 μL-reactiemix. Bewaar de cDNA-producten op -80 °C of ga onmiddellijk over tot het uitvoeren van real-time kwantitatieve PCR (qPCR).
      LET OP: Het protocol kan hier worden onderbroken.
3. Ontwerp vooruit en draai qPCR primers specifiek voor de GoI.
   1. Vanwege de endogene expressie van de Ini in de cellen, moeten de primers zijn ontworpen om een 100-150 bp amplicon van de V5-epitoop gekoppeld aan de Ini (tabel 1) te versterken.
   2. Interne referentiegenprimers moeten ook worden gebruikt als normalisatiecontrole. Meestal worden huishoudelijke genen, zoals de bèta-actine en hypoxanthine fosforibosyltransferase 1 genen, gebruikt als referentiegenen. Deze kunnen echter niet worden gebruikt met dit inductiesysteem vanwege de variatie van de transfection-efficiëntie. In plaats daarvan wordt de expressie van het tTA-Ad transcript beoordeeld met het oog op normalisatie, omdat de expressie ervan constitutief is in cellen als gevolg van de activiteit van de cytomegaloviruspromotor. Elke variatie in de expressie gemeten door qPCR zal representatief zijn voor de transfection-efficiëntie (primers: forward 5'-GCC TGA CGA CAA GGA AAC TC-3' en reverse 5'-AGT GGG TAT GAT GCC TGT CC-3; 129 bp amplicon) en zal de normalisatie van de expressie van de transfected klonen mogelijk maken (figuur 3).
4. Bereid elke qPCR reactie in drievoud met behulp van een SYBR Green kleurstof master mix.
   1. Verdun het 5 ng/μL cDNA-mengsel tot een concentratie van 1,25 ng/μL met behulp van water van moleculaire biologiekwaliteit.
   2. Combineer 5 μL SYBR Green dye master mix (2x), 0,1 μL moleculair biologisch waardig water, 0,45 μL van 7,5 μM voorwaartse primer, 0,45 μL van 7,5 μM omgekeerde primer, en 4 μL van 1,25 ng/μL cDNA om een totaal reactievolume van 10 μL te verkrijgen. Meng goed door op en neer te stampen in een 96 goed PCR-plaat. Gebruik optische kleeffolie om ervoor te zorgen dat de plaathoes wordt verzegeld en om verontreiniging en verdamping te voorkomen.
   3. Draai de reactiemix kort naar beneden door centrifugeren en plaats de plaat in een qPCR thermocycler.
5. Versterk de V5-gelabelde GoI- en tTA-Ad-amplicons met behulp van de volgende qPCR-omstandigheden: 95 °C voor 10 min als denaturatiestap, gevolgd door 40 cycli van 95 °C voor 10 s, 58 °C voor 15 s en 72 °C voor 20 s. Na de versterkingscycli moet een smeltcurve met hoge resolutie worden gegenereerd om de specifieke smelttemperaturen van de gewenste ampliconen te beoordelen en de afwezigheid van geluidsversterkingspieken te garanderen.
   1. Neem negatieve controles voor de qRT-PCR door het uitvoeren van qPCR met RNA als een sjabloon zonder omgekeerde transcriptase om te dienen als een controle voor mogelijke plasmid DNA-besmetting en qPCR zonder cDNA toegevoegd aan de qPCR mix om het gebrek aan primer dimers of Verontreinigingen.
   2. De optimale cDNA-concentratie, primer-efficiëntie en concentratie moeten volgens de GoI worden geoptimaliseerd door een standaard curvetest. Voer hiervoor een seriële verdunning uit met behulp van cDNA uit onbehandelde cellen (gekweekt zonder doxycycline). De standaardcurve wordt gegenereerd door de Cq-waarden af te plotten tegen het logboek van de cDNA-verdunningsfactor en de versterkingsefficiëntie (E) wordt berekend op basis van de helling van de standaardcurve met behulp van de volgende formule:
      E = 10^-1/helling
      OPMERKING: De versterkingsefficiëntie moet ongeveer 0,9 tot 1,05 bedragen. Anders moeten de primers opnieuw worden ontworpen.
6. Analyseer de qPCR-gegevens met behulp van de vergelijkende Cq-methode door de expressiewaarden van de Ini te normaliseren tot de expressie van tTA-Ad om de relatieve expressieniveaus van de Ini te verkrijgen en de expressie ervan te rapporteren als een percentage van de mRNA-expressie van de Ini in cellen van hetzelfde dier bij het beginpunt (t = 0) (figuur 4).
7. De half-life wordt bepaald aan de hand van de koersconstante (K) van de GoI mRNA degradatiecurve aan de hand van de volgende vergelijking:
   t_1/2 = ln 2/K.

Results

Dit protocol werd met succes gebruikt om een Tet-Off transcriptiesysteem te genereren dat plasmaleexpressiesysteem bevat om het belang van verschillende delen van de αENaC 3' UTR in de modulatie van transcriptiestabiliteit in primaire alveolar epitheelcellen te evalueren.

De eerste stap in de implementatie van dit systeem was het vaststellen van een snelle, eenvoudige en efficiënte transfection techniek voor alveolar epitheelcel...

Discussion

De lage transfection rate van alveolar epitheelcellen in de primaire cultuur is een ernstige beperking voor het gebruik van het Tet-Off systeem om de mRNA stabiliteit in deze cellen te beoordelen. Deze beperking werd echter overwonnen door pipetelektroporatie, waardoor een transfection-efficiëntie van 25-30% mogelijk was (figuur 1 en figuur 3)²⁶.

De meting van transcript stabiliteit is fundamenteel voor het beg...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Actinomycin D	Sigma-Aldrich	A9415
Ampicillin	Sigma-Aldrich	A1593
Bright-LineHemacytometer	Sigma-Aldrich	Z359629
Chloroform - Molecular biology grade	Sigma-Aldrich	C2432
ClaI	New England Biolabs	R0197S
Cycloheximide	Sigma-Aldrich	C7698
DM IL LED Inverted Microscope with Phase Contrast	Leica	-
DNase I, Amplification Grade	Invitrogen	18068015
Doxycycline hyclate	Sigma-Aldrich	D9891-1G
Dulbecco’s Phosphate-buffered Saline (D-PBS), without calcium and magnesium	Wisent Bioproducts	311-425-CL
Ethanol - Molecular biology grade	Fisher Scientific	BP2818100
Excella E25 ConsoleIncubatorShaker	Eppendorf	1220G76
Glycerol	Sigma-Aldrich	G5516
HEPES pH 7.3	Sigma-Aldrich	H3784
Heracell 240i	ThermoFisher Scientific	51026420
iScript cDNA Synthesis Kit	Bio-Rad Laboratories	1708890
Isopropanol - Molecular biology grade	Sigma-Aldrich	I9516
LB Broth (Lennox)	Sigma-Aldrich	L3022
LB Broth with agar (Lennox)	Sigma-Aldrich	L2897
L-glutamine	Sigma-Aldrich	G7513
Lipopolysaccharides fromPseudomonas aeruginosa10	Sigma-Aldrich	L9143
MEM, powder	Gibco	61100103
MicroAmp Optical 96-Well Reaction Plate	Applied Biosystems	N8010560
MicroAmp Optical Adhesive Film	Applied Biosystems	4360954
MSC-Advantage Class II Biological Safety Cabinets	ThermoFisher Scientific	51025413
Mupid-exU electrophoresis system	Takara Bio	AD140
NanoDrop 2000c	ThermoFisher Scientific	ND-2000
Neon Transfection System 10 µL Kit	Invitrogen	MPK1025
Neon Transfection System Starter Pack	Invitrogen	MPK5000S
NheI	New England Biolabs	R0131S
One Shot OmniMAX 2 T1RChemically CompetentE. coli	Invitrogen	C854003
pcDNA3 vector	ThermoFisher Scientific	V790-20
pcDNA3-EGFP plasmid	Addgene	13031
PlatinumTaqDNA Polymerase High Fidelity	Invitrogen	11304011
pTet-Off Advanced vector	Takara Bio	631070
pTRE-Tight vector	Takara Bio	631059
Purified alveolar epithelial cells	n.a.	n.a.
QIAEX II Gel Extraction Kit	QIAGEN	20021
QIAGEN Plasmid Maxi Kit	QIAGEN	12162
QIAprep Spin Miniprep Kit	QIAGEN	27104
QuantStudio 6 and 7 Flex Real-Time PCR System Software	Applied Biosystems	n.a.
QuantStudio 6 Flex Real-Time PCR System, 96-well Fast	Applied Biosystems	4485697
Recombinant Rat TNF-alpha Protein	R&D Systems	510-RT-010
Septra	Sigma-Aldrich	A2487
Shrimp Alkaline Phosphatase (rSAP)	New England Biolabs	M0371S
Sodium bicarbonate	Sigma-Aldrich	S5761
SsoAdvanced Universal SYBR Green Supermix	Bio-Rad Laboratories	1725270
SuperScript IV Reverse Transcriptase	Invitrogen	18090010
T4 DNA Ligase	ThermoFisher Scientific	EL0011
Tet System Approved FBS	Takara Bio	631367
Tobramycin	Sigma-Aldrich	T4014
TRIzol Reagent	Invitrogen	15596018
Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red	Gibco	25300054
UltraPure Agarose	Invitrogen	16500500
Water, Molecular biology Grade	Wisent Bioproducts	809-115-EL