Karakteriseren exon overslaan efficiëntie in DMD patiënt monsters in klinische proeven van antisense oligonucleotiden

Samenvatting

Hier presenteren we de moleculaire karakterisering van dystrofine 38 expressie met behulp van Sanger sequencing, RT-PCR, en westerse blotting in de klinische studie.

Samenvatting

Duchenne spierdystrofie (DMD) is een degeneratieve spierziekte die progressief verlies van spiermassa veroorzaakt, wat leidt tot vroegtijdige dood. De mutaties veroorzaken vaak een vervormd leesframe en voortijdige stopcodons, wat resulteert in een bijna totaal gebrek aan dystrofisch eiwit. Het leesframe kan worden gecorrigeerd met behulp van antisense oligonucleotiden (AONs) die exon overslaan veroorzaken. De morpholino AON viltolarsen (codenaam: NS-065/NCNP-01) is aangetoond dat exon 53 overslaan induceren, het herstel van het leesframe voor patiënten met exon 52 deleties. Onlangs hebben we NS-065/NCNP-01 intraveneus toegediend aan DMD-patiënten in een verkennend onderzoek van de onderzoeker naar de eerste mens van NS-065/NCNP-01. In dit methodesartikel presenteren we de moleculaire karakterisering van dystrofineexpressie met sanger sequencing, RT-PCR en western blotting in de klinische studie. De karakterisering van dystrofie expressie was fundamenteel in de studie voor het tonen van de werkzaamheid, omdat er geen functionele uitkomsttests werden uitgevoerd.

Inleiding

Duchenne spierdystrofie (DMD) is een degeneratieve spierziekte die progressief verlies van spiermassa, ademhalingsfalen en cardiomyopathie veroorzaakt, en het leidt tot vroegtijdige dood¹. De ziekte wordt veroorzaakt door een gebrek aan het grote structurele spiereiwit dystrophin². Mutaties in het DMD-gen op het X-chromosoom zijn recessief en de ziekte treft 1 op 3500-5000 pasgeboren mannetjes^3,4,5. De mutaties zijn vaak grote schrappingen in een hotspotgebied tussen exons 44 en 55 die leiden tot een vervormd leesframe en voortijdige stopcodons, waardoor onzin-gemedieerd verval en een bijna totaal gebrek aan dystrofisch eiwit^6,7,8. Het leesframe kan worden gecorrigeerd met behulp van antisense oligonucleotiden (AONs) die exon overslaan en herstellen van het leesframe induceren, gedeeltelijk herstellen van dystrofie expressie en het vertragen van ziekte progressie^9,10,11. De morpholino AON eteplirsen, die onlangs werd goedgekeurd door de Federal Drug Agency (FDA), induceert overslaan van exon 51 en kan het lezen frame te herstellen bij patiënten met exon 52 verwijderingen^12,13. Exon 53 overslaan herstelt echter het leesframe voor patiënten met exon 52-verwijderingen en kan mogelijk ongeveer 10% van de DMD-patiënten^{behandelen 14}. Het morpholino AON medicijn NS-065/NCNP-01 is aangetoond dat exon 53 overslaan in menselijke cellen induceert, en we hebben onlangs NS-065/NCNP-01 toegediend aan DMD-patiënten in een open-label dosis-escalatie klinische studie (hierna "de studie" genoemd) (geregistreerd als UMIN: 000010964 en ClinicalTrials.gov: NCT02081625)¹⁴. De studie toonde een dosis-afhankelijke toename van exon 53 overslaan op basis van RT-PCR en dystrofine eiwitniveaus op basis van westerse blotting, en geen ernstige bijwerkingen of uitval werden waargenomen¹⁴.

In alle klinische studies is de analyse van de resultaten van het grootste belang. Voor DMD klinische studies, een debat is nog steeds aan de gang met betrekking tot de beste methode om een behandeling voordeel te tonen. Klinische tests zoals de 6 minuten durende looptest hebben bepaalde nadelen. Moleculaire karakterisering van de dystrofische expressie kan worden uitgevoerd met behulp van verschillende methoden, zoals RT-PCR, qPCR, digital-PCR, western blotting en immunohistochemie. De mate van herstel van eiwitexpressie die nodig is om een klinisch voordeel te geven, blijft echter onduidelijk. In deze methoden artikel, beschrijven we in detail de RT-PCR en westerse blotting methoden die worden gebruikt om de exon overslaan en eiwit niveaus te bepalen, respectievelijk in de fase 1 proef van de AON overslaan drug NS-065/NCNP-01¹⁴.

Protocol

De operationele procedure voor de door onderzoekers geïnitieerde proef is goedgekeurd door de ethische commissie van het NCNP (goedkeurings-ID: A2013-019).

1. Voorbereiding van spiermonsters

OPMERKING: Biceps brachii of quadriceps spieren worden vaak geselecteerd als biopsie sites. Echter, de tibialis voorste werd gebruikt in de klinische studie.

1. Spierbiopsie van patiënten
   1. Markeer de incisieplaats voor het prepareren van de huid.
   2. Bereid zout-gedempt gaas voor het biopsiemonster. Knijp goed in het gaas.
   3. Injecteer lokale anesthesie in de huid en onderhuids weefsel, maar niet in de spieren. Zorg ervoor dat de diepte van de anesthesie door de afwezigheid van cutane pijn.
      OPMERKING: Algemene anesthesie wordt over het algemeen gebruikt bij pediatrische patiënten jonger dan 15 jaar.
   4. Maak een incisie van de huid naar het onderhuidse weefsel. Gebruik kleine oprolmechanismen om de incisie te openen en het onderhuidse vet te scheiden.
      OPMERKING: Bij deze stap kan een deel van de huid worden gesneden voor fibroblastcultuur.
   5. Maak nog een kleine incisie in de fascia en snijd de fascia verder. Klem de randen met behulp van muggen tangen om de spier bloot te leggen.
   6. Gebruik een hechting om het geselecteerde gedeelte van de spier op te trekken. Maak een kleine tunnel met irisschaar en steek muggen tangen in de tunnel.
   7. Scheid de spierbundel met tangen en snijd beide uiteinden van het doelgedeelte.
      OPMERKING: Spierbiopsiemonsters moeten ongeveer de grootte van een potlood hebben voor volwassen patiënten (lengte 1,0-1,5 cm, diameter 0,8-1,0 cm). Het monster moet ongeveer 1 cm lang zijn en bij pediatrische patiënten een diameter van 5 mm hebben.
   8. Wikkel het monster in zoutoplossing gedempt gaas en transport de verse spier bij kamertemperatuur (RT) onmiddellijk naar een faciliteit waar het monster kan worden voorbereid voor verdere analyse.
      LET OP: De monsters moeten bij 4 °C worden vervoerd als de transportduur meer dan 1 uur bedraagt.

2. Voorbereiding van spiermonsters

1. Meng gelijke volumes tragacanth gom en water tot het tandvlees wordt zacht en plakkerig. Laad het mengsel in 25 mL spuiten. De spuiten kunnen in een koelkast worden bewaard.
2. Plaats ongeveer 0,5 tot 1 cm tragacanth gom op kurkschijven. Label de schijven aan de andere kant.
3. Plaats een container met isopentane in vloeibare stikstof tot een deel van de vloeistof bevriest.
4. Plaats het monster in de tragacanth gom. De lengteas van elke spier moet loodrecht op de kurk staan. Plaats gom rond de bodem van elke spier om een goede plaatsing te helpen.
5. Met behulp van een pincet, plaats de spier / kurk monster in koude isopentane bereid in stap 2.3 te bevriezen. Verplaats het monster constant gedurende 1 min of tot het volledig bevroren is, en plaats het tijdelijk op droogijs.
6. Plaats het monster in glazen flacons en bewaar op -80 °C.

3. Spiersectie

1. Stel de cryostat in voor doorsnede met een werktemperatuur van -25 °C.
2. Monteer de kurk / spier blok en trim tot platte secties zijn bereikt.
3. Gebruik een sectiedikte van 10 μm voor RT-PCR en western blotting. Gebruik een dikte van respectievelijk 6-8 μm en 10-12 μm voor immunohistochemie of hematoxylin en eosine kleuring. Doe gesneden delen in buizen van 2,0 mL en bewaar op -80 °C voor RT-PCR en western blotting.

4. RNA-extractie en omgekeerde transcriptie polymerasekettingreactie (RT-PCR)

1. Haal ongeveer 10 plakjes met een dikte van 10 μm uit bevroren spieren door een cryostat. Verzamel het gezuiverde totale RNA met behulp van de zuiveringskit van het totale RNA volgens de instructies van de fabrikant.
2. Meet de RNA-concentratie met behulp van een spectrofotometer.
3. Combineer de vereiste reagentia voor een RT-PCR-reactie in PCR-buizen volgens tabel 1. Zie tabel 2 voor primersequenties.
   LET OP: De voorwaartse primer was 44F voor patiënt NS-03 en 46F voor patiënt NS-07. De omgekeerde primer was standaard 54/55R. Als niet-specifieke producten duidelijk waren, werd 54R gebruikt als alternatief.
4. Plaats de PCR-buizen die het mengsel in een thermo-cycler bevatten. Voer de thermo-cycler volgens tabel 3.
5. Sla PCR-product op bij 4 °C voor opslag op korte termijn of -20 °C voor langdurige opslag.

5. Microchip elektroforese en exon overslaan berekening

OPMERKING: Een microchip elektroforese (MCE) systeem wordt vaak geselecteerd om exon overslaan efficiëntie te analyseren. In dit protocol beschrijven we de stappen die nodig zijn om de exon overslaan efficiëntie te analyseren met behulp van een MCE-systeem door fabrikant A en van fabrikant B, hierna genoemd systeem A en B. Tijdens de klinische studie werd de exon overslaan efficiëntie geanalyseerd op systeem A. Systeem A is echter niet meer te koop en we raden systeem B aan om de efficiëntie van het overslaan van exon te analyseren. We hebben protocollen voor beide systemen opgenomen (zie punt 5.1 voor systeem A en 5.2 voor systeem B). Zie Tabel met materialen voor informatie over systeem A en B. Bovendien kan deze stap ook worden uitgevoerd met normale agarose gel elektroforese, maar de gevoeligheid neemt aanzienlijk af.

1. Microchip elektroforese met behulp van systeem A
   OPMERKING: Systeem A heeft twee soorten chips. Hier beschrijven we de stappen voor de DNA-chip.
   1. Equilibrate kit reagentia (vlekbuffer, laadbuffer, ladder en gelbuffer) naar RT, vortex en spin down.
   2. Voeg 12,5 μL vlekbuffer toe aan 250 μL gelbuffer en vortex voor 10 s om gelvlekbuffer (GS) voor te bereiden. Verplaats de oplossing naar een spinfilterbuis en centrifuge op 2.400 x g gedurende 15 minuten. Gooi het filter weg.
      LET OP: De gefilterde GS kan gedurende 1 maand bij 4 °C worden opgeslagen.
   3. Als de monsters sterk geconcentreerd zijn, verdun dan tot ongeveer 50 ng/μL met TE-buffer of DNase-vrij water.
      OPMERKING: Als monsters in een zoutconcentratie zijn ≥ 200 mM KCl (of NaCl) en/of 15 mM MgCl_2,wissel de buffer uit.
   4. Voeg 12 μL GS-oplossing toe aan de gelpriming (gemarkeerde en gelabelde GS) van de DNA-chip en plaats de chip in het primingstation.
      OPMERKING: Om luchtbellen te voorkomen, plaatst u de pipetpunt verticaal en aan de onderkant van de put bij het uitdelen. Laat langzaam afstaan aan de eerste stop op de pipet en verdrijft geen lucht aan het einde van de pipetstap.
   5. Selecteer de C3-modus en druk op de knop Start. Nadat priming is voltooid, verwijdert u de chip.
   6. Inspecteer de microkanalen visueel op gevangen luchtbellen of onvolledige priming.
   7. Laad de voorbereide monsters en ladder op de chip zoals hieronder.
      1. Pipette 9 μL GS oplossing in de andere 3 GS putten.
      2. Pipette 5 μL laadbuffer in de L-put en elk monsterput (1-11).
      3. Pipette 1 μL ladder in de L put.
      4. Pipette 1 μL DNA-monster in elk van de 11 monsterputten.
      5. Pipette 1 μL TE- of DNase-vrij water in ongebruikte putten. De kit quick guide toont een figuur van de chip lay-out.
         OPMERKING: Inspecteer alle putten op luchtbellen door de chip boven een licht gekleurde achtergrond te houden. Verjagen alle gevangen luchtbellen aan de onderkant van een put met een schone pipet tip of door het verwijderen en herladen van de oplossing.
   8. Plaats de chip in het vortexstation en druk op Mix. Het vortexstation stopt automatisch na 1 min.
   9. Voer de chip in de elektroforese station binnen 5 minuten na het laden.
   10. Selecteer Nieuwe run op de werkbalk van de software. Selecteer op het New Run-scherm DNA en DNA 1K uit de Uittreklijst van Assay.
   11. Selecteer een projectmap voor de run in de pull-downlijst project of maak een nieuwe projectmap door een naam in te voeren in het veld Project.
   12. Voer een naam in voor de run in het veld Voorvoegsel uitvoeren en klik op Uitvoeren starten.
   13. Het instrument piept wanneer de analyse is voltooid en er wordt een venster geopend dat het einde van de run aangeeft. Selecteer OK en verwijder de chip van het chipplatform.
   14. Bestand selecteren | Gegevens exporteren om de gegevens te exporteren. Selecteer de gewenste opties in de dialoog Exporteren.
   15. Om de elektroden schoon te maken, vul een reinigingschip met 800 μL gedeïoniseerd water en plaats deze op het chipplatform, sluit u het deksel en laat u het 1 min gesloten. Na 1 min, open het deksel, verwijder de reinigingschip, en laat de elektroden te drogen gedurende 1 min.
2. Microchip elektroforese met systeem B
   1. Open de bedrijfssoftware en voer de voorbeeldinformatie in. Na het invoeren van de informatie berekent de software automatisch de hoeveelheid scheidingsbuffer- en markeroplossingen.
   2. Bereid de benodigde hoeveelheid scheidingsbuffer voor die door de software is berekend. Bereid eerst 100x nucleïnezuurgelvlekoplossing voor door 10.000x-oplossing te verdunnen met de juiste hoeveelheid TE-buffer. De 100x oplossing kan worden opgeslagen bij -20 °C.
   3. Meng een geschikte hoeveelheid 100x nucleïnezuurgelvlek met scheidingsbuffer in de specifieke buis die door het bedrijf wordt geleverd om een 1x oplossing voor te bereiden. Vortex de oplossing.
   4. Bereid de benodigde hoeveelheid markeroplossing in de buis voor.
   5. Start het sondewasprogramma.
   6. Start het microchip wasprogramma wanneer u klaar bent.
   7. Tegelijkertijd pipette de monsters naar een PCR multiplate (96-goed, helder) en verdun 4 keer met gedeïmiseerd water. Het minimale volume dat de machine aankan is 6 μL en het maximum is 30 μL. We stellen een totaal volume van 10 μL (2,5 μL monster en 7,5 μL water/TE-buffer) voor.
   8. Bedek de platen met kleef-PCR-afdichtingsfolievellen en spin-down de monsters.
   9. Stel de plaat, markeringsoplossing en 1x scheidingsbuffer in de machine in op basis van de plaatsing die door de machine wordt weergegeven. Druk op de startknop.
   10. Wanneer de uitvoering is voltooid, exporteert u de resultaatgegevens als een CSV-bestand uit de software en berekent u de exon die de efficiëntie overslaat met behulp van molaire concentratie als volgt:
       Exon overslaan efficiëntie (%) = (Overgeslagen band / (Overgeslagen band + Niet-overgeslagen band) X 100

6. Complementaire DNA (cDNA) sequencing

1. Agarose gel voorbereiding
   1. Meet 1,5 g agarosepoeder en meng het poeder met 100 mL 1x TAE buffer in een microwavable kolf (wat resulteert in een 1,5% agarose gel).
   2. Magnetron gedurende 1-3 min tot de agarose volledig is opgelost.
      OPMERKING: Overboil de oplossing niet, omdat een deel van de buffer zal verdampen en het uiteindelijke agarosepercentage van de gel zal veranderen.
   3. Laat de agarose-oplossing afkoelen tot ongeveer 50 °C.
   4. Voeg 10 μL 10.000x fluorescerende nucleïnezuurverf toe aan de agarose-oplossing.
   5. Giet de agarose in een gellade met de put kam op zijn plaats. Laat op RT voor 20-30 min totdat het volledig gestold.
2. Sequencing
   1. Meng 5 μL RT-PCR product (vanaf stap 4.4) en 1 μL 6x laadbuffer. Laad ze in de putten van de 1,5% agarose gel.
   2. Voer de gel op 135 V voor 5 min en 120 V voor 20 min.
   3. Visualiseer de banden met behulp van een transilluminator volgens het protocol van de fabrikant.
   4. Accijnsbanden van belang uit de gel en gebruik een gel en PCR cleanup kit om RT-PCR producten op te halen.
   5. Meet de concentratie met behulp van een spectrofotometer.
      OPMERKING: De gezuiverde band kan worden verzonden voor sequencing bij een bedrijf of sequencing faciliteit als er geen Sanger sequencing apparatuur beschikbaar is in-house.
   6. Bereid de vereiste reagentia voor op een cyclussequencingkit en pipet in een multiplate PCR-plaat volgens tabel 4. Zie tabel 2 voor primersequenties.
   7. Sluit de plaat af met een heldere kleeffolie.
   8. Vortex de plaat voor 2 tot 3 s. Centrifuge kort in een swingende emmer centrifuge, zodat de inhoud vestigen op de bodem van de putten (5 tot 10 s) op 1.000 x g.
      OPMERKING: Luchtbellen kunnen aanwezig zijn in de putten, maar ze hebben geen negatieve invloed op de reactie.
   9. Plaats het mengsel in een thermo-cycler en loop volgens tabel 5.
   10. Zuiver de volgorde reacties met platen volgens de instructies van de fabrikant.
   11. Gebruik een DNA-analyzer om de sequenties te bepalen volgens het protocol van de fabrikant.
   12. Vergelijk de volgorde verkregen met de verwachte volgorde van de patiënt.

7. Westerse blotting

1. Monsterbereiding
   1. Bereid SDS-monsterbuffer voor (4% SDS, 4 M ureum, 10% 2-mercaptoethanol, 10% glycerol, 70 mM Tris-HCl pH 6.4, 0,001% bromofenolblauw en proteaseremmer).
   2. Plaats ongeveer 100 plakjes van de 10 μm spiersecties verzameld uit cryo-sectioning in 150 μL SDS buffer.
   3. Homogeniseer de eiwitmonsters op ijs in een korte tijd met een handige microhomogenisator.
   4. Centrifuge op 16.500 x g gedurende 15 minuten, en breng de supernatant naar een verse buis. Ga verder met analyse of bewaar bij -80 °C.
2. SDS-PAGE voor meting eiwitconcentratie
   OPMERKING: Een fluorescerende gelvlek werd gebruikt om de eiwitconcentratie te bepalen.
   1. Bepaal het normale gewicht van het gezonde controlemonster en de concentratie met behulp van de BCA-eiwittestkit volgens de instructies van de fabrikant.
   2. Bereid de monsters voor op gel elektroforese. Pipette 10 μg van het totale eiwit van de gezonde controle en 5 μL van de patiëntmonsters, 5 μL monsterbuffer, 2 μL van 10x monsterreductiemiddel. Zodra deze zijn gemengd, voeg gedeïmiseerd water toe aan een eindvolume van 20 μL in elk monster.
   3. Warmtemonsters bij 70 °C gedurende 10 minuten.
   4. Bereid 2.000 mL 1x SDS running buffer voor met behulp van 50 mL van 40x SDS running buffer. Verdun met 1.950 mL gedeïmiseerd water.
      OPMERKING: Op dit punt is 1.000 mL lopende buffer voldoende. De resterende buffer van 1.000 mL wordt gebruikt bij stap 7.3.1.
   5. Meng grondig en zet 800 mL van de 1x SDS lopende buffer opzij voor gebruik in de onderste (buitenste) bufferkamer van de gelbox.
   6. Voeg vlak voor elektroforese 500 μL antioxidantbuffer toe aan 200 mL 1x SDS loopbuffer voor gebruik in de bovenste (binnen)bufferkamer van de gelbox.
   7. Bereid je voor op gel elektroforese door het opzetten van een 3-8% Tris-acetaat gel volgens het protocol van de fabrikant. Laad 20 μL van elk monster op de gel.
   8. Voer elektroforese uit bij 150 V gedurende 75 minuten.
   9. Na elektroforese plaatst u de gel direct in een schone lade met een fluorescerende gelvlekoplossing van 50 mL.
   10. Bedek de lade, plaats op een shaker, en roer zonder spatten vloeistof of beschadiging van de gel gedurende 90 min.
   11. Breng de gel in water voordat u in een fluorescentiesysteem met 312 nm-verlichting met ethidium bromide-emissiefilter wordt gebruikt om fluorescentie te detecteren.
   12. Meet de concentraties van de patiëntmonsters op basis van een analytische curve die is opgebouwd met behulp van het normale controlelysaat met bekende concentratie.
3. SDS-PAGINA voor western blotting
   1. Bereid de geldoos volgens stap 7.2.4-7.2.6.
   2. Op basis van de concentratiemeting verkregen in stap 7.2.11, laad 100 μg per rijstrook van gezonde controle lysaat en 300 μg per rijstrook van het patiëntenmonster. Elektrophorese met dezelfde instellingen als stap 7.2.7.
4. Eiwitoverdracht
   1. Bereid de transferbuffer voor. Week een PVDF membraan voor 20 s in methanol. Verplaats het naar de blotting buffer B tot gebruik.
   2. Week een extra dik blotting papier in blotting buffer A, B en C voor ten minste 30 minuten per buffer.
   3. Na elektroforese, weken de gel in blotting buffer B gedurende 5 min.
   4. Plaats blotting papier, PVDF membraan, en gel op de semi-droge overdracht machine volgens de tekening in figuur 1. Rol luchtbellen uit tussen de gel en het membraan met een roller.
   5. Breng over op 2 mA/cm² membraan voor 1 uur bij RT.
      OPMERKING: Na het overbrengen wordt aanbevolen om een totale eiwitvlek uit te voeren die vergelijkbaar is met Ponceau-kleuring om een succesvolle overdracht van de eiwitten met een groot moleculair gewicht te bevestigen.
5. Blokkeren en antilichaam kleuring
   1. Spoel het membraan twee maal af met PBST (1x PBS met 0,1% Tween 20).
   2. Plaats het membraan in 1% blokkerend middel en rock zachtjes 1 uur op RT om te blokkeren.
   3. Het membraan inbroed met antidystrofisch antilichaam in blokkeringsoplossing (1:125) en antispectrineantilichaam (1:25.000) gedurende 1 uur bij RT of 's nachts bij 4 °C.
   4. Was het membraan drie keer gedurende 10 minuten per stuk met PBST op RT.
   5. Het membraan incubeer maken met mierikswortelperoxidase (HRP)-geconjugeerde secundaire anti-muis/konijnantilichaam in PBST (1:100) gedurende 40 minuten bij RT.
   6. Was het membraan opnieuw drie keer gedurende 10 minuten met PBST op RT.
6. Detectie
   1. Mix detectie oplossingen A en B in een verhouding van 1:1. Het uiteindelijke detectiereagensmiddel is 0,1 mL/cm² membraan.
   2. Haal de overtollige PBST uit het gewassen membraan en leg het met de eiwitkant op een vel plastic folie of andere geschikte schone oppervlakken. Voeg het gemengde detectiereagens toe aan het membraan en broed gedurende 5 minuten in rt.
   3. Verwijder het overtollige detectiereagens door het membraan voorzichtig in tangen te houden en de rand tegen een weefsel aan te raken.
   4. Leg de vlek eiwit kant omhoog op een monster lade. Bedien het fluorescerende systeem volgens de gebruikersdocumentatie. Stel de machine als volgt in. Belichtingstype: Toename, Intervaltijd: 10 s, Gevoeligheid/Resolutie: hoog.
      OPMERKING: De gemeten gebieden zijn verpakt met een blauwe rechthoek (figuur 4a-b):BG: achtergrond; D: dystrofine 427 kDa, SL: spectrin beta long isoform (274 kDa); SS: korte isoform (253 kDa). Dystrophin/spectrin signaal ratio werd berekend als (D-BG)/[(SL-BG) + (SS-BG)]. De verhouding van de normale controle werd ingesteld als 100%.

Resultaten

Om RT-PCR te gebruiken om exon-overslaan te detecteren, zijn primers aan weerszijden van de exon die wordt overgeslagen ontworpen en geëvalueerd om alleen specifieke banden op te leveren (zie figuur 2 voor een schematisch diagram van exon-overslaan en primerpositie). De primers moeten producten genereren die gemakkelijk kunnen worden onderscheiden door grootte op een MCE-systeem of normale agarose gel elektroforese als MCE niet beschikbaar is. Figuur 3a toont MCE-systeem Een gelbeelden van RT-PCR-reacties en de volgorderesultaten van de overgeslagen band van patiënten NS-03 en NS-07 voor en na behandeling met NS-065/NCNP-01 in de dosis-escalatie fase 1-studie. NS-03 en NS-07 havendeleties die exons 45-52 en 48-52 omvatten, respectievelijk. NS-03 ontving 5 mg/kg en NS-07 20 mg/kg NS-065/NCNP-01 wekelijks gedurende 12 weken. Zoals verwacht voor de behandeling, beide patiënten toonde geen overslaan, en alleen een niet-overgeslagen band kon worden gevisualiseerd. Na 12 weken behandeling werd voor NS-07 een duidelijke overgeslagen onderband gevisualiseerd. Het was echter nog steeds moeilijk om een overgeslagen product voor patiënt NS-03 op te sporen. De sequencing resultaten toonden een samenvoeging van exons 47 en 54 voor NS-07, evenals exons 44 en 54 voor NS-03. Volgens de sequentie zouden deze theoretisch een functionele maar verkorte dystrofine isoform kunnen produceren. Om het overslaande percentage in figuur 3b teberekenen, werd de kiesconcentratie voor de overgeslagen band gedeeld door de overgeslagen en niet-overgeslagen band. Voor patiënt NS-07 was het percentage na behandeling 72%, en voor NS-03 was dat 3,4%. Westerse vlekgegevens (in drievoud) van patiënten NS-03, NS-07 en een gezonde controle worden weergegeven in figuur 4a. Naar verwachting werd er geen dystrofieband ontdekt vóór de behandeling. Na de behandeling werd een band van patiënt NS-07 gedetecteerd met een lager moleculair gewicht in vergelijking met gezonde controle (wild type dystrophin heeft een moleculair gewicht van 427 kDa, en NS-07 dystrofine heeft een moleculair gewicht van 389 kDa). Vanwege de exon verwijdering en overslaan, de dystrofische isoform van patiënt NS-07 ontbrak verschillende exonen, en het was naar verwachting een lager moleculair gewicht hebben. Patiënt NS-03 vertoonde geen detecteerbare niveaus van dystrofie na de behandeling. In figuur 4bwordt de hoeveelheid dystrofie ten opzichte van een gezonde controle voor patiënt NS-07 weergegeven. De locatie waar signaalintensiteiten werden gemeten voor de berekening van dystrofine restauratie worden aangegeven met blauwe vierkanten. De dystrofine specieratio werd gebruikt om de hoeveelheid dystrofine te berekenen in vergelijking met die van de gezonde controle. Hiertoe werd het signaal van de dystrofische minus achtergrond gedeeld door de som van de twee spectrin isovormen (lange en korte) minus achtergrond (zie stap 8.6.5). De verhouding voor gezonde controle werd ingesteld op 100%. De hoeveelheid dystrofie ten opzichte van de gezonde controle bij patiënt NS-07 na behandeling was 9,1%. Het percentage kon echter niet worden berekend voor patiënt NS-03 vanwege een zwakke dystrofieband, die vergelijkbaar is met die welke voor eerdere behandelingsmonsters voor beide patiënten zijn verkregen.

Figuur 1: Schematisch diagram van de overdrachtsstapel voor western blot-analyse. Montage van de westelijke vlek overdracht stapel met blotting papier gedrenkt in blotting buffer A in de bodem, gevolgd door blotting papier gedrenkt in blotting buffer B, PVDF membraan, de 3-8% Tris-Acetaat Gel en op de top 2 blotting papier gedrenkt in blotting buffer C wordt getoond. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figuur 2: Schematische tekening van exon overslaan van exon 53 bij een patiënt met exon 45-52 verwijdering in het DMD-gen. Bijvoorbeeld, patiënt NS-03 in de dosis-escalatie klinische studie had deze schrapping. Als exon 53 wordt bewaard, zal het mRNA buiten beeld zijn, omdat de exon-exon-verbinding tussen exon 44 en 53 het leesframe verstoort, waardoor een stopcodon in exon 53 ontstaat. Het leesframe wordt hersteld wanneer exon 53 wordt overgeslagen en een kortere isovorm van dystrofine wordt geproduceerd. Om exon 53-overslaan door RT-PCR te detecteren, worden primers in exon 44 en 54 gebruikt, zodat het PCR-product tussen overgeslagen en niet-overgeslagen mRNA gemakkelijk kan worden gedetecteerd. FWD: forward primer, REV: reverse primer, PMO: phosphorodiamidate morpholino oligomer. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figuur 3: Overslaan efficiëntie voor patiënten NS-03 en NS-07 van tibialis anterieerpier biopsie monsters. a) Gel beeld gegenereerd door elektroforese systeem A van RT-PCR monsters van onbehandelde en behandelde monsters van patiënten NS-03 en NS-07. Bovenpaneel toont NS-03 en lager paneel NS-07 in drievoud. Voor NS-03, de un-skiped band is 422 bp, en de overgeslagen band is 212 bp. Voor NS-07 zijn de banden respectievelijk 836 bp en 624 bp. Sequentieanalyse toonde een samenvoeging van exon 44 en exon 54 voor NS-03 en exon 47 tot exon 54 voor NS-07. b) Overslaan efficiëntie voor en na de behandeling wordt getoond voor patiënten NS-03 en NS-07, berekend op basis van de kiesconcentratie van de twee banden die door systeem A als overgeslagen band /(overgeslagen band + un-skiped band) x 100. De overslaande efficiëntie voor NS-03 was zeer laag na de behandeling; voor NS-07 was de overslaande efficiëntie meer dan 70%. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figuur 4: Eiwitkwantificering van dystrofische isovormen voor en na exon-overslaande therapie. a)Eiwitkwantificering van dystrofische isovormen voor en na exon overslaan van therapie. Westerse vlek van spierbiopsie van tibialis anterior van patiënten NS-03 en NS-07 voor en na de behandeling en van gezonde controle in drievoud. Dystrofine is te zien bij 427 kDa voor de gezonde controle en bij 389 kDa voor NS-07 na behandeling. Voor een patiënt vóór de behandeling kon geen dystrofie worden gedetecteerd, noch kon na behandeling voor patiënt NS-03 geen dystrofie worden gedetecteerd. Het gebied in de zwarte doos wordt weergegeven in figuur 4b. Links in elke vlek wordt de markering weergegeven. b) De hoeveelheid dystrofie hersteld na behandeling voor patiënt NS-07. Dystrophin restauratie werd berekend op basis van de intensiteit van de banden voor dystrofine, achtergrond, en de lange en korte isoform van spectrine volgens de formule: (dystrofine - achtergrond)/(spectrin L -achtergrond) + (spectrin S - achtergrond) waar de verhouding voor gezonde controle is ingesteld op 100%. De intensiteit van elke band werd gemeten in de blauwe dozen in de figuur. De dystrofie restauratie voor NS-07 was 9,1% na behandeling. Het dystrofiphin signaal was te zwak om te meten in de onbehandelde monsters. Markeringsgroottes worden weergegeven in kilodaltons. Dys: Dystrophin, BG: achtergrond, SL: Spectrin lange isoform, SS: Spectrin korte isoform, Mijn: Myosin type 1. Markeringsgroottes worden weergegeven in kilodaltons. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Oplossing	Volume/reactie (μl)	Definitieve concentratie
RNase-vrij water (voorzien)	Variabele	-
5x QIAGEN OneStep RT-PCR Buffer	5.0	1x
dNTP Mix (met 10 mM per dNTP)	1.0	400 μM van elke dNTP
Voorwaartse primer (10 μM)	1.5	0,6 μM
Reverse Primer (10 μM)	1.5	0,6 μM
QIAGEN OneStep RT-PCR Enzymmix	1.0	-
RNase-remmer (optioneel)	Variabele	5–10 eenheden/reactie
SjabloonRNA	50 ng
Totale	25

Tabel 1: RT-PCR reagentia. De nodige verbindingen voor één reactie van de RT-PCR.

Primer	Volgorde
44F	5'-CCTGAGAATTGGGAACATGC-3'
46F	5'-AACCTGGAAAAGAGCAGCAA-3'
48F	5'-CCAAGAAGGACCATTTGACG-3'
54/55R	5'-TCTCGCTCACTCACTTTT-3'
54R	5'-GTGGACTTTTCTGGTATCAT-3'

Tabel 2: Primer lijst. Sequenties voor de primers gebruikt in deze studie. F: Vooruit, R: Achteruit.

1 cyclus	Omgekeerde transcriptie	30 min	50 °C
1 cyclus	Eerste PCR-activeringsstap	15 min	95 °C
35 cycli	Denaturatie	1 min	94 °C
	Annealing	1 min	60 °C
	Extensie	1 min	72 °C
1 cyclus	Laatste uitbreiding	7 min	72 °C
Houden		∞	4 °C

Tabel 3: PCR geconditioneerd gebruikt. Pcr-voorwaarden weergeven voor de RT-PCR-reactie.

Oplossing	Volume/reactie (μl)
RNase-vrij water	Variabele
BigDye Terminator 3.1 Ready Reaction Mix	3.5
Voorwaartse primer/omgekeerde primer (3,2 μM)	2.0
SjabloonRNA	20 ng
Totale	20

Tabel 4: Reagentia die nodig zijn voor de sequencing reactie. Gebruik forward of reverse primer in de setup, niet beide tegelijk.

1 cyclus	1 min	96 °C
25 cycli	10 s	96 °C
	5 s	50 °C
	4 min	60 °C
Houden	∞	4 °C

Tabel 5: PCR voorwaarden voor de Sanger sequencing.

Discussie

Klinische studies van DMD hebben geleid tot zowel successen en mislukkingen in de afgelopen jaren. Zowel RT-PCR en western blotting zijn gemeenschappelijke technieken om de overslaan efficiëntie gegenereerd door exon-overslaan verbindingen toegediend aan de patiënten te beoordelen. Echter, RT-PCR is gemeld aan over-schatting van de overslaan efficiëntie in vergelijking met digitale PCR¹⁵. Hoewel dit te wijten is aan een aantal redenen, wordt het voornamelijk veroorzaakt door de efficiëntere versterking van de kleinere overgeslagen fragmenten tijdens PCR-cycli. Het lijkt erop dat RT-PCR gebruikt in deze klinische studie ook gegenereerd hogere overslaan efficiëntie in vergelijking met de eiwitexpressie geschat door westerse blotting. Volgens de FDA, dit is een meer betrouwbare manier om dystrofine restauratie¹²kwantificeren. Daarom moet voorzichtigheid worden betracht bij het interpreteren van RT-PCR-overslaande resultaten; de monsters kunnen echter nog steeds worden vergeleken. Monsters met hogere overslaan efficiëntie op basis van RT-PCR resultaten vaak exhbit hogere eiwit expressie niveaus in westerse vlek analyses.

Aangezien alle patiënten in DMD-klinische studies niet hetzelfde verwijderingspatroon hebben, kan het moeilijk zijn om primers en sondes te ontwerpen die voldoende specifiek zijn om digitale of qPCR op alle monsters uit te voeren. Daarom is RT-PCR nog steeds een goed alternatief voor een eerste beoordeling van de overslaande efficiëntie. Voordat de klinische studie van NS-065/NCNP-01 begon, was het vervelend om overslaande efficiëntie voor elke patiënt in vitro te beoordelen, omdat een spier- of huidbiopsie verplicht was om patiëntspecifieke myoblasten te genereren. Echter, we hebben onlangs een nieuwe techniek gepubliceerd om patiënt-specifieke MYOD1-geconverteerde, urine-afgeleide cellen (UDC's) te genereren als een nieuwe DMD spiercel model¹⁶. Zo is alleen urine verzameld van de patiënt nodig om de myoblasten te genereren, en geen invasieve procedure is nodig. Wij geloven dat deze methode kan worden gebruikt om verschillende AONs in patiëntspecifieke cellen te screenen. Bovendien kunnen verschillende primers en sondes worden getest voordat de patiënt met een klinische studie begint. Dit kan het gebruik van qPCR of digitale PCR voor exon skipping meting in DMD klinische studies in de toekomst vergemakkelijken.

Voor het uitvoeren van westerse vlekanalyse in deze klinische studie werd één enkel antilichaam tegen dystrofine gebruikt en slechts één gezonde controle werd gebruikt als referentiemonster. Daarom werd de specificiteit van het antilichaam niet op de juiste manier gevalideerd. Dit, samen met het feit dat het antilichaam alleen het C-terminale domein van dystrofine herkent, is een beperking van het protocol. Meer gezonde controles en antilichamen gericht tegen verschillende domeinen van de dystrofine molecuul zijn raadzaam in de toekomst.

Hier hebben we de protocollen samengevat die werden gebruikt in de recente verkennende onderzoeker geïnitieerde, first-in-human proef van NS-065/NCNP-01. NS-065/NCNP-01 is mogelijk van toepassing op 10,1% van de patiënten met DMD.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
100 bp DNA Ladder	Takara	3407A	marker solution for MultiNA
1mol/l-Tris-HCl Buffer Solution(pH 7.6)	Nacalai	35436-01
2-mercaptoethanol	Nacalai	21418-42
2-Methylbutaan (Isopentaan)	Sigma-Aldrich	15-2220
5 mL Round Bottom Polystyrene Test Tube	Falcon	352235
6× Loading Buffer	Takara	9156
Agarose ME	Iwai chemical	50013R
Applied Biosystems 3730 DNA Analyzer	Applied Biosystems	A41046
BD Matrigel Matrix	BD Biosciences	356234
BigDye Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit	Applied Biosystems	4337455
Bovine Serum Albumin solution	Sigma-Aldrich	A8412
Bromofenolblauw	Nacalai	05808-61
Centri-Sep 96-Well Plates	Applied Biosystems	4367819
cOmplete Protease Inhibitor Cocktail	Roche	4693116001
DMEM/F-12	Gibco	11320033
ECL Prime Blocking Reagent	GE healthcare	RPN418
ECL Prime Western Blotting Detection Reagent	GE healthcare	RPN2232
Endo-Porter	GeneTools	2922498000
Experion Automated Electrophoresis Station	Bio-Rad	7007010	Microchip electrophoresis system A
Experion DNA 1K Analysis Kit for 10 Chips	Bio-Rad	7007107JA
Experion Priming Station	Bio-Rad	7007030
Experion Vortex Station II	Bio-Rad	7007043
Extra Thick Blot Filter Paper	Bio-Rad	1703965
EzBlot	Atto	AE-1460
GelRed Nucleic Acid Gel Stain	Biotium	41003
glas vial	Iwaki	1880 SV20
Glycerol	Nacalai	17045-65
Histofine Simple Stain MAX PO	Nichirei	424151
Paarden Serum	Gibco	16050122
Immobilon-P Transfer Membrane	Millipore	IPVH304F0
ITS Liquid Media Supplement	Sigma-Aldrich	I3146
Methanol	Sigma-Aldrich	34860
MicroAmp Clear Adhesive Film	Applied Biosystems	4306311
MultiNA	SHIMADZU	MCE-202	Microchip electrophoresis system B
Multiplate 96-Well PCR Plates	Bio-Rad	mlp9601
NanoDrop One Microvolume UV-Vis Spectrophotometer with Wi-Fi	Thermo Scientific	ND-ONE-W
NovocastraTM Lyophilized Mouse Monoclonal Antibody Dystrophin (C-terminus)	Leica biosystems	NCL-DYS2
NovocastraTM Lyophilized Mouse Monoclonal Antibody Spectrin	Leica biosystems	NCL-SPEC1
NuPAGE 3-8% Tris-Acetate Protein Gels	Invitrogen	EA03785BOX
NuPAGE Antioxidant	Invitrogen	NP0005
NuPAGE LDS Sample Buffer	Invitrogen	NP0007
NuPAGE Sample Reducing Agent	Invitrogen	NP0009
NuPAGE Tris-Acetate SDS Running Buffer	Invitrogen	LA0041
Oriole Fluorescent Gel Stain	Bio-Rad	1610496
PBS	Gibco	10010023
Penicillin-Streptomycin Solution Stabilized	Sigma-Aldrich	P4458
Physcotron Handy micro-homogenizer	MICROTEC	NS-310E3
Pierce BCA Protein Assay Kit	Thermo Scientific	23227
Polybrene Infection / Transfection Reagent	Sigma-Aldrich	TR-1003
Propidium Jodide Staining Solution	BD Pharmingen	556463
QIAGEN OneStep RT-PCR Kit	Qiagen	210212
RNeasy Fibrous Tissue Mini Kit	Qiagen	74704
SDS	Nacalai	31606-75
Semi-dry transfer machine	Bio Craft	41-1293
SYBR Gold Nucleic Acid Gel Stain	Invitrogen	S11494	for MultiNA
TAE Buffer	Nacalai	35430-61
Tragacanth Gum	Wako	200-02245
Tris-EDTA Buffer	Nippon Gene	316-90025	for MultiNA
Trypsin-EDTA (0.05%)	Gibco	25300054
TWEEN 20	Sigma-Aldrich	P9416
Urea	Nacalai	35907-15
Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System	Promega	A9281
XCell SureLock Mini-Cell	Invitrogen	EI0001