Hier presenteren we een protocol om de totale cellulaire reactieve zuurstofsoorten (ROS) te detecteren met behulp van 2',7'-dichlorodihydrofluorescein diacetaat (DCFH-DA). Deze methode kan cellulaire ROS lokalisatie visualiseren in aanhangende cellen met een fluorescentiemicroscoop en ros intensiteit kwantificeren met een fluorescentieplaatlezer. Dit protocol is eenvoudig, efficiënt en kosteneffectief.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Detectie van totale reactieve zuurstofsoorten in aanhangende cellen door 2',7'-Dichloododihydrofluorescein Diacetate Kleuring
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Oxidatieve stress is een belangrijke gebeurtenis onder zowel fysiologische als pathologische omstandigheden. In deze studie laten we zien hoe oxidatieve stress te kwantificeren door het meten van de totale reactieve zuurstof soorten (ROS) met behulp van 2',7',7's ofgfohydrofluoresceïne diacetaat (DCFH-DA) kleuring in colorectale kanker cellijnen als voorbeeld. Dit protocol beschrijft gedetailleerde stappen, waaronder de voorbereiding van dcfh-DA-oplossing, incubatie van cellen met DCFH-DA-oplossing en meting van genormaliseerde intensiteit. DCFH-DA kleuring is een eenvoudige en kosteneffectieve manier om ROS in cellen te detecteren. Het kan worden gebruikt om ROS generatie te meten na chemische behandeling of genetische modificaties. Daarom is het nuttig voor het bepalen van cellulaire oxidatieve stress op milieustress, het verstrekken van aanwijzingen voor mechanistische studies.
Inleiding
Drie belangrijke reactieve zuurstofsoorten (ROS) die door cellulair metabolisme worden geproduceerd die van fysiologische betekenis zijn superoxideanion, hydroxylradical, en waterstofperoxide1. Bij lage concentraties nemen ze deel aan fysiologische celprocessen, maar bij hoge concentraties hebben ze nadelige effecten op celsignaleringstrajecten1. Ons lichaam heeft antioxidantsystemen ontwikkeld, die effectief zijn tegen overmatige ROS. Oxidatieve stress kan echter optreden wanneer ROS het ontgiftende vermogen van ons lichaam overweldigt, wat bijdraagt aan vele pathologische aandoeningen, waaronder ontsteking, kanker en n....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
1. Celzaaien
- Zaad 2 x 105 HCT116 colorectale kankercellen per put in een 24-put plaat en onderhouden de cellen in dulbecco's gemodificeerde Eagle medium (DMEM) 's nachts op 37 °C.
- Vervang het kweekmedium door of zonder 100 μM ferrosulfaat (FS) of 10 μM doxorubicine (DOX) met medium en incubaat gedurende 24 uur.
2. Voorbereiding van de DCFH-DA-oplossing
- Los 4,85 mg DCFH-DA op in 1 mL dimethylsulfoxide (DMSO) om een voorraadoplossing van 10 mM te maken.
- Verdun de voorraadoplossing met voorverwarmde DMEM tot 10 μM werkoplossing vlak voordat deze aan de putten wordt toegevoegd.
- ....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
HCT116 colorectale kankercellen werden behandeld met 100 μM FS of 10 μM DOX om oxidatieve stress te veroorzaken7. Zoals blijkt uit figuur 1,werd de groene fluorescentie zoals verwacht drastisch verhoogd met zowel FS als DOX. Om de relatieve intensiteitsverandering te kwantificeren, werden de cellen na het nemen van beelden gelysed en genormaliseerd met eiwitconcentraties. De gekwantificeerde fluorescentieintensiteit werd aanzienlijk verhoogd door FS of DOX in HCT116 c.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Het experimentele protocol dat hier wordt beschreven is gemakkelijk reproduceerbaar om cellulaire totale ROS te meten. De kritieke stappen omvatten het maken van DCFH-DA-oplossing fris en het vermijden van blootstelling aan licht, het minimaliseren van de cel status verstoring en uitgebreide PBS wassen vlak voor het nemen van beelden. Voor de bereiding van dcfh-DA werkoplossing moet de voorraadoplossing worden toegevoegd in voorverwarmde DMEM vlak voordat deze in de 24 putplaat wordt toegevoegd. De reden is dat oude oplo.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs hebben niets te onthullen.
Dankbetuigingen
Dit werk werd gedeeltelijk ondersteund door de National Institutes of Health (K01DK114390), een Research Scholar Grant van de American Cancer Society (RSG-18-050-01-NEC), een Research Pilot Project Grant van de University of New Mexico Environmental Health Signature Program and Superfund (P42 ES025589), een Shared Resources Pilot Project Award en een Research Program Support Pilot Project Award van UNM uitgebreid kankercentrum (P30CA118100) , en een nieuwe onderzoeker award van de Dedicated Health Research Funds aan de Universiteit van New Mexico School of Medicine.
....Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| 2',7'-Dichloorfluoresceine diacetaat | Cayman Chemical, Ann Arbor, MI | 20656 | |
| Doxorubicine hydrochloride | TCI America, Portland, OR | D4193-25MG | |
| Dulbecco's Gemodificeerd Eagle Medium | Corning, Corning, NY | 45000-304 | |
| Ferrosulfaat Heptahydraat | VWR, Radnor, PA | 97061-542 | |
| Invitrogen EVOS FL Auto Beeldvormingssysteem | Thermo Fisher Scientific Waltham, MA | AMAFD1000 | of elke andere fluorescentiemicroscoop |
| Proteïne assay Bradford-oplossing | Bio-Rad, Hercules, CA | 5000001 | |
| SpectraMax M2 Microplate Reader | Molecular Devices, Radnor, PA | 89429-532 | of elke andere fluorescentie microplate reader |
Referenties
- Birben, E., et al. Oxidative stress and antioxidant defense. World Allergy Organization Journal. 5 (1), 9-19 (2012).
- Kim, G. H., et al. The Role of Oxidative Stress in Neurodegenerative Diseases. Experimental Neurobiology. 24 (4), 325-3....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
