Kwantificering van metaal uitspoeling in geïmmobiliseerde metaal Affiniteits chromatografie

Samenvatting

We presenteren een assay voor eenvoudige kwantificering van metalen geïntroduceerd voor monsters bereid met behulp van geïmmobiliseerde metaal affiniteit chromatografie. De methode maakt gebruik van hydroxynaphthol blauw als de colorimetrische metalen indicator en een UV-VIS-spectrofotometer als de detector.

Samenvatting

Besmetting van enzymen met metalen uit geïmmobiliseerde metalen affiniteits chromatografie (IMAC) kolommen vormt een belangrijke zorg voor enzymologen, omdat veel van de gemeenschappelijke di-en trivalente kationen die worden gebruikt in IMAC-harsen een remmende werking op enzymen hebben. De omvang van het uitlogen van metaal en de impact van verschillende eluering-en reducerende reagentia zijn echter slecht begrepen voor een groot deel vanwege de afwezigheid van eenvoudige en praktische overgangs metaalkwantificerings protocollen die gebruikmaken van apparatuur die gewoonlijk beschikbaar is in Biochemie Labs. Om dit probleem aan te pakken, hebben we een protocol ontwikkeld om snel de hoeveelheid metaalverontreiniging te kwantificeren in monsters die worden bereid met behulp van IMAC als zuiveringsstap. De methode maakt gebruik van hydroxynaphthol Blue (HNB) als een colorimetrische indicator voor metaal CATIE-inhoud in een monsteroplossing en UV-VIS-spectroscopie als middel om de hoeveelheid metaal aanwezig te kwantificeren, in het nanomolair-bereik, gebaseerd op de verandering in het HNB-spectrum bij 647 nm. Hoewel het metaalgehalte in een oplossing historisch is bepaald met behulp van atomische Absorptie spectroscopie of inductief gekoppelde plasma technieken, vereisen deze methoden gespecialiseerde apparatuur en training buiten het bereik van een typisch biochemie laboratorium. De hier voorgestelde methode biedt een eenvoudige en snelle manier voor biochemici om het metaalgehalte van monsters te bepalen met behulp van bestaande apparatuur en kennis, zonder in te boeten op nauwkeurigheid.

Inleiding

Sinds de oprichting door Porath en co-workers¹, geïmmobiliseerde metaal affiniteit chromatografie (iMac) is uitgegroeid tot een methode van keuze om snel te scheiden van eiwitten op basis van hun vermogen om te binden met overgangsmetalen ionen zoals Zn^{2 +}, ni^{2 +}, Cu^{2 +}, en co^{2 +}. Dit wordt meestal gedaan via engineered poly-histidine Tags en is nu een van de meest voorkomende chromatografische zuivering technieken voor de isolatie van recombinant eiwitten². IMac heeft ook toepassingen gevonden die verder gaan dan recombinant-eiwit zuivering als een manier om quinolonen, tetrac....

Protocol

1. preparaat van de test component

1. Bepaal de chromatografie fracties die moeten worden getest met optische extinctie bij 280 nm of alternatieve methoden voor eiwit kwantificering om de eiwit verrijkte fracties te identificeren.
   Opmerking: voor dit werk gebruikten we een diode array UV-VIS spectrofotometer. Om de doorvoer te verhogen, kan een plaat lezer worden gebruikt die geschikt is voor het meten van de UV/VIS-extinctie.
2. Bereiding van de noodzakelijke assay componenten
   1. Bereid of verkrijg 10-100 mM buffer ("sample buffer") met een pH tussen 7 en 12.
      Opmerking: gemeenschappelijke biochemische buffers zoals Tris, HEPES, MOPS en fosfaa....

Resultaten

Het spectrum van vrije HNB bij neutrale pH (zwarte lijn) en representatieve spectra van fracties die zijn aangevallen voor ni^{2 +} uit de isolatie van MSP1E3D1²⁹ zijn weergegeven in Figuur 2. Een succesvolle assay-serie moet een verminderde extinctie vertonen bij 647 nm in vergelijking met de HNB-controle, die overeenkomt met de vorming van HNB-complexen in de aanwezigheid van een overgangsmetaal. Een mislukte test zou worden aangegeven door een toename van d.......

Discussie

Colorimetrische detectie van metalen met behulp van HNB biedt een eenvoudige manier om de mate van eiwit verontreiniging te kwantificeren door overgangsmetalen ionen van IMAC-harsen. Zoals we gevestigd in Ref. 20, ni^{2 +} bindt aan hnb met 1:1 Stoichiometrie en de dissociatieconstante voor de ni-hnb complex veranderingen met pH. Het complex K_d bevindt zich echter in het Sub-nm-bereik voor alle aanbevolen (7-12) pH-waarden. Praktisch gezien betekent dit dat alle ni^{2 +} in alle geteste fractie.......

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
2xYT broth	Fisher Scientific	BP9743-500	media voor E.coli groei
HEPES, vrije zuur	BioBasic	HB0264	alternatieve buffer
HisPur Ni-NTA hars	Thermo Scientific	88222
Hydroxynaftol blauw disoidum zout	Sigma-Aldrich	219916-5g
Imidazool	Fisher Scientific	O3196-500
Imidazool	BioBasic	IB0277
MOPS, vrije zuur	BioBasic	MB0360	alternatieve buffer
Natriumchloride	Fisher Scientific	S271-500
Natriumfosfaat	Fisher Scientific	S369-500	alternatieve buffer
Tricine	Gold Bio	T870-100
Tris base	Fisher Scientific	BP152-500
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T9284-500