Kwantificering van metaal uitspoeling in geïmmobiliseerde metaal Affiniteits chromatografie

Samenvatting

We presenteren een assay voor eenvoudige kwantificering van metalen geïntroduceerd voor monsters bereid met behulp van geïmmobiliseerde metaal affiniteit chromatografie. De methode maakt gebruik van hydroxynaphthol blauw als de colorimetrische metalen indicator en een UV-VIS-spectrofotometer als de detector.

Samenvatting

Besmetting van enzymen met metalen uit geïmmobiliseerde metalen affiniteits chromatografie (IMAC) kolommen vormt een belangrijke zorg voor enzymologen, omdat veel van de gemeenschappelijke di-en trivalente kationen die worden gebruikt in IMAC-harsen een remmende werking op enzymen hebben. De omvang van het uitlogen van metaal en de impact van verschillende eluering-en reducerende reagentia zijn echter slecht begrepen voor een groot deel vanwege de afwezigheid van eenvoudige en praktische overgangs metaalkwantificerings protocollen die gebruikmaken van apparatuur die gewoonlijk beschikbaar is in Biochemie Labs. Om dit probleem aan te pakken, hebben we een protocol ontwikkeld om snel de hoeveelheid metaalverontreiniging te kwantificeren in monsters die worden bereid met behulp van IMAC als zuiveringsstap. De methode maakt gebruik van hydroxynaphthol Blue (HNB) als een colorimetrische indicator voor metaal CATIE-inhoud in een monsteroplossing en UV-VIS-spectroscopie als middel om de hoeveelheid metaal aanwezig te kwantificeren, in het nanomolair-bereik, gebaseerd op de verandering in het HNB-spectrum bij 647 nm. Hoewel het metaalgehalte in een oplossing historisch is bepaald met behulp van atomische Absorptie spectroscopie of inductief gekoppelde plasma technieken, vereisen deze methoden gespecialiseerde apparatuur en training buiten het bereik van een typisch biochemie laboratorium. De hier voorgestelde methode biedt een eenvoudige en snelle manier voor biochemici om het metaalgehalte van monsters te bepalen met behulp van bestaande apparatuur en kennis, zonder in te boeten op nauwkeurigheid.

Inleiding

Sinds de oprichting door Porath en co-workers¹, geïmmobiliseerde metaal affiniteit chromatografie (iMac) is uitgegroeid tot een methode van keuze om snel te scheiden van eiwitten op basis van hun vermogen om te binden met overgangsmetalen ionen zoals Zn^{2 +}, ni^{2 +}, Cu^{2 +}, en co^{2 +}. Dit wordt meestal gedaan via engineered poly-histidine Tags en is nu een van de meest voorkomende chromatografische zuivering technieken voor de isolatie van recombinant eiwitten². IMac heeft ook toepassingen gevonden die verder gaan dan recombinant-eiwit zuivering als een manier om quinolonen, tetracyclines, aminoglycosiden, macroliden en β-lactams voor voedsel monsteranalyse³ te isoleren en als een stap in het identificeren van bloed-serumeiwit markers voor lever-en pancreaskanker^4,5. Niet verrassend, iMac is ook uitgegroeid tot een methode van keuze voor de isolatie van een aantal inheemse Bioenergetics enzymen^6,7,8,9,10. De succesvolle toepassing van deze zuiverings methoden voor studies op enzymatisch actieve bioenergetische eiwitten is echter afhankelijk van de aanwezigheid van verwaarloosbare metaal kationen uit de kolom matrix in het eluaat. De divalente metaal kationen die gewoonlijk in iMac worden gebruikt, hebben een pathologisch biologisch belang, zelfs bij lage concentraties^11,12. Het fysiologische effect van deze metalen is het meest uitgesproken in bioenergetische systemen, waar ze dodelijk kunnen blijken als remmers van cellulaire ademhaling of fotosynthese^13,14,15. Vergelijkbare problemen zijn onvermijdelijk voor de meerderheid van de eiwit klassen waar rest verontreiniging metalen kunnen interfereren met de biologische functies van een eiwit of karakterisering met biochemische en biofysische technieken.

Terwijl het gehalte aan metaalverontreiniging onder oxiderende omstandigheden en het gebruik van imidazol als eluant doorgaans laag is¹⁶, eiwit isolaties uitgevoerd in de aanwezigheid van cysteïne reducerende agentia (DTT, β-mercaptoethanol, enz.) of met sterkere chelatoren zoals histidine^17,18 of ethyleendiaminetetraazijnzuur (EDTA) resulteren in veel hogere niveaus van metaalverontreiniging^19,20. Evenzo, aangezien metaalionen in IMAC-harsen vaak worden gecoördineerd door Carbon groepen, hebben eiwit eluties die onder zure omstandigheden worden uitgevoerd waarschijnlijk ook veel hogere niveaus van metaalverontreiniging. Metaalgehalte in oplossingen kan worden beoordeeld met behulp van atomische Absorptie spectroscopie (aas) en inductief gekoppeld plasma-massaspectrometrie (ICP-MS) tot een aantoonbaarheidsgrens in het ppb-ppt-bereik^21,22,23,24. Helaas, AAS en ICP-MS zijn niet realistisch middelen voor detectie in een traditionele biochemie Lab omdat deze methoden toegang tot gespecialiseerde apparatuur en training zou vereisen.

Vorig werk van Brittain^25,26 onderzocht het gebruik van hydroxynaphthol Blue (hnb) als een manier om de aanwezigheid van overgangsmetalen in oplossing te identificeren. Er waren echter verschillende interne contradicties in de data²⁰ en die werken hebben geen adequaat protocol kunnen bieden. Studies van Temel et al.²⁷ en Ferreira et al.²⁸ verbreiden het werk van Brittain met hnb als een potentiële metalen indicator. Echter, Temel ontwikkelde een protocol dat gebruik maakt van AAS voor monsteranalyse, met behulp van HNB alleen als een chelerende agent. De studie van Ferreira gebruikte de verandering in het HNB extinctie Spectra bij 563 nm, een gebied van de Free-Dye HNB spectra die zwaar overlapt met de spectra van HNB-Metal complexen bij pH 5,7, waardoor de gevoeligheid van de assay vrij laag is en ook resulteert in relatief zwakke metaalbinding affiniteit²⁰. Om problemen in ons eigen lab met ni^{2 +} uitspoeling van iMac aan te pakken, hebben we het werk van Brittain^25,26 en Ferreria²⁸ uitgebreid om een eenvoudige assay te ontwikkelen die in staat is om nanomolaire niveaus van verschillende overgangsmetalen te detecteren. We toonden aan dat HNB nikkel bindt en andere vaak voor IMAC-metalen met sub-nanomolaire bindende affiniteiten en Form 1:1 complex over een breed scala aan pH-waarden²⁰. De hier gerapporteerde assay is gebaseerd op deze bevindingen en maakt gebruik van absorptie veranderingen in het HNB-spectrum bij 647 nm voor metaal kwantificering. De test kan worden uitgevoerd in de fysiologische pH-reeks met behulp van gemeenschappelijke buffers en instrumentatie gevonden in een typische biochemie Lab met behulp van colorimetrische detectie en kwantificering van metaal-Dye complexen en de bijbehorende verandering in de extinctie van de vrije-kleurstof wanneer het bindt aan metaal.

Protocol

1. preparaat van de test component

1. Bepaal de chromatografie fracties die moeten worden getest met optische extinctie bij 280 nm of alternatieve methoden voor eiwit kwantificering om de eiwit verrijkte fracties te identificeren.
   Opmerking: voor dit werk gebruikten we een diode array UV-VIS spectrofotometer. Om de doorvoer te verhogen, kan een plaat lezer worden gebruikt die geschikt is voor het meten van de UV/VIS-extinctie.
2. Bereiding van de noodzakelijke assay componenten
   1. Bereid of verkrijg 10-100 mM buffer ("sample buffer") met een pH tussen 7 en 12.
      Opmerking: gemeenschappelijke biochemische buffers zoals Tris, HEPES, MOPS en fosfaat in neutrale of basis pH zijn allemaal aanvaardbaar voor de bepaling. Tricine en histidine kunnen worden gebruikt, maar zullen kalibratie curven vereisen, omdat ze beide metaalionen substantieel cheleren. Een voorbeeld van kalibratie voor histidine wordt weergegeven in verwijzing²⁰.
   2. Bereid een 12% g/v (20-voudige geconcentreerde) oplossing van hydroxynaphthol Blue (HNB) dispersie in de monster buffer met 120 mg HNB-reagens voor elke milliliter van de voorbereide stamoplossing.
      Let op: blootstelling van HNB aan het oog kan ernstige schade en irritatie veroorzaken. Oogbescherming moet worden gebruikt bij het hanteren van HNB en de handen moeten grondig worden gewassen na het hanteren.
      Opmerking: HNB wordt verkocht als een spreiding op KCl door grote leveranciers van wetenschappelijke reagentia. Als zodanig, werkelijke concentratie in oplossing zal variëren van verschillende fabrikanten, batches, en waar in de fles de HNB dispersie wordt genomen van. Idealiter moet een extinctie tussen 0,5-0,8 bij 647 nm na 20-voudige verdunning van de kolf worden bereikt.

2. monstervoorbereiding en-meting

1. Voorbereiding van de spectrofotometer voor het verzamelen van gegevens
   1. Schakel de UV-VIS-spectrofotometer in en warm deze op. Stel de spectrofotometer in om gegevens te verzamelen bij 647 nm.
      Opmerking: als de spectrofotometer dit toelaat, moet u bovendien gegevens verzamelen bij 850 nm, of een andere golflengte zonder significante wijzigingen in verband met het kleurstof-metaal en de kleurstof spectra, die moeten worden gebruikt voor een basislijn correctie.
   2. Leeg de spectrofotometer met behulp van de monster buffer.
      Opmerking: er mogen kwarts of wegwerp plastic cuvettes worden gebruikt. Kwarts cuvettes hebben de voorkeur voor kwantitatieve analyse, omdat ze een hogere nauwkeurigheid en precisie mogelijk maken dan wegwerp plastic cuvettes. Echter, plastic cuvettes blokkeren UV-licht, die aanwezig kunnen zijn in de meet balken van sommige diode-array spectrofotometers. Blootstelling van HNB aan intens UV-licht veroorzaakt opmerkelijke vermindering van de kleurstof en een ongewenste langzame absorptie daling die kan worden verward met langzame metaalbinding (zie bijvoorbeeld Figuur 1 in ondersteunende informatie van referentie 20).
2. Voorbereiding en extinctie meting van de controle
   1. Bereid een controleoplossing met 50 μL HNB-kolf per milliliter van het totale volume van de assay. Pipetteer eerst de kleine volumes om een goede menging van alle monsters te garanderen en voeg vervolgens de monster buffer toe, gevolgd door mengen door pipetteren. Verdunde HNB-oplossing moet vers worden bereid, maar HNB-voorraden kunnen gedurende weken worden opgeslagen bij 4 °C en worden afgeschermd van licht zonder significante degradatie.
   2. Laat de controle gedurende minimaal 3 minuten bij kamertemperatuur inbroed.
      Opmerking: een langere incubatietijd kan nodig zijn voor monsters met een alkalische pH of in de aanwezigheid van fosfaat als gevolg van de vorming van slecht oplosbare metaalcomplexen, resulterend in een tragere evenwichts fase.
   3. Meet en noteer de extinctie bij 647 nm voor het controlemonster.
3. Voorbereiding en extinctie meting van monsters
   1. Bereid de test monsters door 50 μL HNB-kolf te mengen met 950 μL van naar behoren verdunde eiwit fracties met de monster buffer.
      Opmerking: aangezien de in de literatuur gerapporteerde metaalverontreinigings niveaus met een factor van meer dan 1000 variëren, afhankelijk van de elutie-condities^16,20, kan het nodig zijn om enkele verdunningen van de onderzochte proteïne fracties met de monster buffer te proberen (zie stap 1.2.1 hierboven) om absorptie veranderingen binnen het dynamische bereik van de assay te bereiken.
      Let op: nikkel en andere metalen die in IMAC worden gebruikt, zijn bekend als irriterend voor de huid, vermoedelijk kankerverwekkend en kunnen de nieren en het bloed beschadigen na langdurige blootstelling. Handschoenen en oogbescherming moeten worden gebruikt bij het hanteren van eiwit monsters bereid met IMAC.
   2. Laat het monster inbroed gedurende minimaal 3 minuten bij kamertemperatuur en meet gemiddelde bij 647 nm.
      Opmerking: de beperkende stap van de test in termen van tijd geïnvesteerd is de incubatie stap. De gegevens voor dit papier werden verzameld met behulp van een enkele kwarts kuvette die zorgvuldig werd gewassen tussen elk monster. Zelfs met de toegevoegde wastijd en voorbereiding van de HNB voorraad, gegevensverzameling voor 14 monsters en de controle duurde ongeveer anderhalf uur en als zodanig, het protocol kan gemakkelijk worden voltooid zonder de noodzaak van onderbreking.
   3. Herhaal stap 2.3.1 en 2.3.2 voor elke breuk die wordt gemeten.
      Opmerking: als er meerdere cuvetten worden gebruikt voor meervoudige monsters, moeten monsters worden bereid op een manier die een vergelijkbare incubatietijd en blootstelling aan omgevingslicht mogelijk maakt.

3. metaal kwantificering

1. Bepaling van de concentratie van metaal in elk monster
   1. Zoek het verschil van elke monster extinctie bij 647 nm van de HNB-besturing.
   2. Bepaal de metaal concentratie (in μM) met behulp van de onderstaande formule:
      
      
      
      waarbij DF de verdunningsfactor is voor de assay Fractie, δabs₆₄₇ is de extinctie verandering bij 647 nm, 3,65 X10^-2 staat voor de uitsterving coëfficiënt van hnb (ε = 36,5 mm^-1· cm^-1 Zie referentie²⁰ voor meer details) en l is het optische pad van Cuvette in cm.

Resultaten

Het spectrum van vrije HNB bij neutrale pH (zwarte lijn) en representatieve spectra van fracties die zijn aangevallen voor ni^{2 +} uit de isolatie van MSP1E3D1²⁹ zijn weergegeven in Figuur 2. Een succesvolle assay-serie moet een verminderde extinctie vertonen bij 647 nm in vergelijking met de HNB-controle, die overeenkomt met de vorming van HNB-complexen in de aanwezigheid van een overgangsmetaal. Een mislukte test zou worden aangegeven door een toename van d...

Discussie

Colorimetrische detectie van metalen met behulp van HNB biedt een eenvoudige manier om de mate van eiwit verontreiniging te kwantificeren door overgangsmetalen ionen van IMAC-harsen. Zoals we gevestigd in Ref. 20, ni^{2 +} bindt aan hnb met 1:1 Stoichiometrie en de dissociatieconstante voor de ni-hnb complex veranderingen met pH. Het complex K_d bevindt zich echter in het Sub-nm-bereik voor alle aanbevolen (7-12) pH-waarden. Praktisch gezien betekent dit dat alle ni^{2 +} in alle geteste fractie...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
2xYT broth	Fisher Scientific	BP9743-500	media voor E.coli groei
HEPES, vrije zuur	BioBasic	HB0264	alternatieve buffer
HisPur Ni-NTA hars	Thermo Scientific	88222
Hydroxynaftol blauw disoidum zout	Sigma-Aldrich	219916-5g
Imidazool	Fisher Scientific	O3196-500
Imidazool	BioBasic	IB0277
MOPS, vrije zuur	BioBasic	MB0360	alternatieve buffer
Natriumchloride	Fisher Scientific	S271-500
Natriumfosfaat	Fisher Scientific	S369-500	alternatieve buffer
Tricine	Gold Bio	T870-100
Tris base	Fisher Scientific	BP152-500
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T9284-500