Methodenartikel

Live Cell Imaging en Cryo-Electron Tomography toepassen op Resolve Spatiotemporal Features of the Legionella pneumophila Dot/Icm Secretion System

DOI:

10.3791/60693

⸱

10 maart 2020

 ,  ,  ,  , 
1Department of Microbial Pathogenesis, Boyer Center for Molecular Medicine, Yale University School of Medicine, 2Microbial Sciences Institute, Yale University, 3Department of Microbiology and Molecular Genetics, McGovern Medical School, The University of Texas Health Science Center at Houston

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Beeldvorming van bacteriële cellen is een opkomende systeembiologiebenadering gericht op het definiëren van statische en dynamische processen die de functie van grote macromoleculaire machines dicteren. Hier wordt integratie van kwantitatieve live celbeeldvorming en cryo-elektronentomografie gebruikt om legionella pneumophila type IV secretiesysteemarchitectuur en -functies te bestuderen.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De Dot/Icm secretie systeem van Legionella pneumophila is een complex type IV secretie systeem (T4SS) nanomachine dat lokaliseert bij de bacteriële pool en bemiddelt de levering van eiwitten en DNA substraten om cellen te richten, een proces dat over het algemeen directe cel-naar-cel contact. We hebben onlangs de structuur van het Dot/Icm-apparaat opgelost door cryo-elektronentomografie (cryo-ET) en hebben aangetoond dat het een cel-overspannen kanaal vormt dat verbinding maakt met een cytoplasma-complex. Toepassing van twee complementaire benaderingen die de inheemse structuur van het monster te behouden, fluorescerende microscopie in levende cellen en cryo-ET, maakt in situ visualisatie van eiwitten en assimilatie van de stoichiometry en timing van de productie van elke machine component ten opzichte van andere Dot / Icm subeenheden. Om de vereisten voor polaire positionering te onderzoeken en dynamische kenmerken te karakteriseren die verband houden met T4SS-machinebiogenese, hebben we een gencoderingsupermap groen fluorescerend eiwit samengevoegd met Dot/Icm ATPase-genen op hun oorspronkelijke posities op het chromosoom. De volgende methode integreert kwantitatieve fluorescentiemicroscopie van levende cellen en cryo-ET om polaire lokalisatie, dynamiek en structuur van deze eiwitten in intacte bacteriële cellen te kwantificeren. Het toepassen van deze benaderingen voor het bestuderen van de Legionella pneumophila T4SS is nuttig voor het karakteriseren van de functie van het Dot/Icm-systeem en kan worden aangepast om een breed scala aan bacteriële pathogenen te bestuderen die gebruik maken van de T4SS of andere soorten bacteriële afscheidingscomplexen.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Legionella pneumophila (L. pneumophila), de etiologische agent van legionairs ziekte, woont zoetwaterreservoirs, waar de bacteriën zich voortplanten door te infecteren en te repliceren in aquatische vrijzwemmen protozoa. L. pneumophila veroorzaakt ziekte-uitbraken bij de mens wanneer inademing van aerosolized bacteriën uit drinkbare waterbronnen optreedt. In geïnfecteerde cellen, subversie van gastheer trajecten kan L. pneumophila te vertragen endocytische rijping van de vacuole waarin het zich bevindt en biogenese van een cellulair compartiment dat bacteriële replicatie ondersteunt bevorderen. Dit proces wordt aangedreven door een gespecialiseerd bacterieel type IVB secretie systeem (T4BSS) bekend als Dot / Icm en het repertoire van meer dan 300 "effector" eiwitten die worden overgedragen in de gastheer cytosol tijdens infectie te vergemakkelijken manipulatie van cellulaire functies1,2,3,4,5. Mutanten die geen functioneel Dot/Icm-apparaat hebben, leveren geen effectoren in de gastheercytosol, zijn defect voor intracellulaire replicatie en zijn avirulent in diermodellen van ziekte6,7.

Veel bacteriële soorten hebben extreem complexe en dynamische multicomponent machines ontwikkeld die nodig zijn voor infectieprocessen. Andere T4BSS zoals de Dot / Icm systeem zijn ook essentieel voor intracellulaire replicatie van bacteriële pathogenen zoals Coxiella burnetii en Rickettsiella grylli. Hoewel T4BSS evolutionair verwant zijn aan prototypische IVA-systemen, die DNA-overdracht bemiddelen en een beperkt repertoire van effectoreiwitten kunnen leveren, heeft het Dot/Icm-systeem bijna twee keer zoveel machinecomponenten en levert het een breed scala aan effectoren. Vermoedelijk heeft deze uitbreiding van het aantal componenten het Dot/Icm-apparaat in staatgesteld om gemakkelijk8,9nieuwe effectoren op te vangen en te integreren.

We hebben onlangs cryo-elektronentomografie (cryo-ET) gebruikt om de structuur van het Dot/Icm-apparaat in situ op te lossen en toonden aan dat het een cel-overloopkanaal vormt dat verbinding maakt met een cytoplasma-complex. Verdere analyse toonde aan dat de cytosolic ATPase DotB associeert met het Dot/Icm systeem op de L. pneumophila celpool door middel van interacties met de cytosolic ATPase DotO. We hebben ontdekt dat DotB een cytosoieke beweging vertoont in de meeste bacteriële cellen, wat aangeeft dat deze ATPase aanwezig is in een dynamische cytosoieke populatie, maar ook associeert met de polaire Dot/Icm complexen. Daarnaast vormt DotO een hexameric assemblage van DotO dimers geassocieerd met het binnenste membraan complex, en een DotB hexamer sluit zich aan bij de basis van dit cytoplasmacomplex. De assemblage van het energiecomplex DotB-DotO creëert een cytoplasmathermisch kanaal dat de translocatie van substraten door de T4SS(figuur 1)10leidt.

Ondanks deze recente vooruitgang is er weinig bekend over hoe het Dot/Icm-systeem functioneert en hoe elk eiwit samenkomt om een actief apparaat te vormen8. Het blootleggen van de regelgevingscircuits van de Dot/Icm T4SS is van fundamenteel belang voor het begrijpen van de moleculaire mechanismen van host-pathogene interacties. Daarom bespreken we hoe we live celmicroscopie en cryo-ET kunnen gebruiken om essentiële L. pneumophila Dot/Icm-systeemcomponenten te detecteren en te karakteriseren die zijn gelabeld met supermap GFP (sfGFP). Met behulp van kwantitatieve fluorescentiemicroscopie wordt de polarisatie van DotB gedefinieerd in een wilde achtergrond of wanneer het type IV-systeem wordt verwijderd. Time-lapse microscopie zal worden gebruikt om verschillen in lokalisatie en dynamiek tussen de Dot/Icm cytosolic ATPases te kwantificeren.

De gecombineerde toepassing van twee complementaire benaderingen zoals live imaging en cryo-ET biedt een voordeel ten opzichte van andere in vitro systemen. Beide methoden worden uitgevoerd in intacte cellen en behouden de natuurlijke omgeving van de T4BSS, waardoor verstoring van de oorspronkelijke structuur tijdens de voorbereiding van het monster wordt geminimaliseerd. Omdat overexpressie van eiwitten de stoichiometry van het secretieapparaat kan aantasten, worden sfGFP-fusies via allelic exchange teruggestuurd naar het Legionella-chromosoom, zodat elke fusie in één exemplaar wordt gecodeerd en de expressie wordt aangedreven door de endogene promotor. Visualisatie van chromosoomgecodeerde fusies maakt het mogelijk om het exacte eiwitgehalte op een bepaald tijdstip te kwantificeren. Cryo-ET heeft ook veel voordelen voor het bepalen van de structuur van secretiesystemen. Het meest opvallende voordeel is dat cryo-ET monsters bestaan uit bevroren intacte cellen die inheemse complexen behouden in de context van bacteriële celarchitectuur. Cryo-ET kan dus de voorkeur krijgen boven biochemische zuiveringsbenaderingen, die membraancomplexen extraheren en perifere eiwitten uit het kernapparaat kunnen halen of de algehele structuur kunnen wijzigen. Bovendien voegt het taggen van een eiwit met een omvangrijk eiwit zoals sfGFP een massa toe die door cryo-ET kan worden gedetecteerd en kan helpen bij het in kaart brengen van de verschillende subcomplexen van het Dot/Icm-apparaat op de structuur die door cryo-ET wordt verkregen.

Deze aanpak is een krachtig hulpmiddel voor het blootleggen van structurele informatie over multimoleculaire complexen die zich in het bacteriële celmembraan verzamelen. De interpretatie van structuren die met behulp van deze technieken worden toegelicht, zal het veld helpen begrijpen hoe T4BSS-componenten functioneren, waarom zoveel componenten nodig zijn voor functie, hoe de componenten interageren binnen het grotere complex en welke functies deze subassemblies presteren.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

OPMERKING: Alle procedures met betrekking tot de groei, manipulatie en beeldvorming van L. pneumophila moeten worden uitgevoerd in een laboratorium op biologisch veiligheidsniveau 2, conform de lokale richtlijnen.

1. Inbrengen van sfGFP in L. pneumophila-chromosoom met allelic exchange en double selection strategie(figuur 2, figuur 3)

  1. Kloon in de genvervangende vector pSR47S11 de volgende volgorde: de 1.000 bp stroomopwaarts van de site van belang, dan de sfGFP-sequentie, vervolgens de 1.000 bp stroomafwaarts van de site van belang (figuur 2). De sfGFP-sequentie moet in beeld worden gebracht bij de N-terminus- of C-terminusuiteinden met een linkerdie vier tot acht aminozuren bevat. Zet de resulterende vector om in E. coli DH5αλpir. Later, streep L. pneumophila (de ontvanger) voor enkele kolonies op houtskool-gist extract (CYE) agar12 met 100 μg/mL streptomycine en groeien gedurende 5 dagen op 37 °C (Figuur 3).
  2. Streak L. pneumophila op CYE-agar-streptomycine en groeien gedurende 2 dagen bij 37 °C (zware patch)10. Streep E. coli DH5α getransformeerd met pRK600 helper plasmid (helper)13 op LB agar met 25 μg/mL chloramphenicol. Streep de E. coli DH5αλpir (donor) op LB agar met 50 μg/mL kanamycine.
  3. Voer triparentalparing uit: broed een kolonie van de helper, een kolonie van de donor, en de ontvanger door het overleggen van patches van de drie stammen op een CYE agar plaat zonder selectie en incubatie voor 4-8 uur bij 37 °C. Als negatieve controles uitbroeden een helper + ontvanger stam mix en een donor + ontvanger stam mix voor dezelfde periode van tijd.
  4. Resuspende de paringsreacties in 500 μL ddH2O. Plaat 20 μL en 50 μL van de reacties op CYE agar met 100 μg/mL streptomycine en 10 μg/mL kanamycine en groeien gedurende 5 dagen bij 37 °C. Streep vier van de resulterende klonen op CYE agar met 100 μg/mL streptomycine en groei gedurende 5 dagen bij 37 °C.
  5. Streep 16 klonen op CYE agar met 5% sacharose en 100 μg/mL streptomycine en groeien gedurende 5 dagen bij 37 °C. Dan, streep 32 van deze klonen op CYE agar met 100 μg/mL streptomycine en op CYE agar met 100 μg/mL streptomycine en 10 μg/mL kanamycine en groeien gedurende 5 dagen bij 37 °C.

2. Isolatie van klonen die sfGFP in het L. pneumophila chromosoom integreerde

  1. Streak klonen die gevoelig waren voor kanamycine op CYE-agar-streptomycine platen en bevestigen het inbrengen van sfGFP in het chromosoom met kolonie PCR. Gebruik primers die complementair zijn aan het sfGFP-gen en aan het chromosomale gebied dat van belang is om de invoegverbinding te versterken.
    1. Meng 0,5 μL van elk van de 10 μM primers oplossingen en één kolonie tot een laatste volume van 12,5 μL en denatureer gedurende 10 min bij 95 °C. Koel 10 min op ijs, voeg 12,5 μL 2x PCR master mix-oplossing toe en voer een PCR-analyse uit.
  2. Kweek zware stukken van de geïsoleerde kolonies op CYE-agar-streptomycine platen gedurende 2 dagen bij 37 °C. Bestudeer de expressieniveaus en stabiliteit van de sfGFP-fusies door immunoblotting met een anti-GFP-antilichaam.

3. Live Cell Imaging van L. pneumophila met fluorescerend gelabelde Dot/Icm Componenten

  1. Bereiding van agarosepads
    1. Maak ongeveer 30 mL van een 1% laagsmeltende agaroseoplossing in water. Magnetron in een glazen kolf voor ongeveer 90 s, af en toe wervelende, totdat de agarose volledig is opgelost.
    2. Plaats twee glazen dia's van 22 x 22 x 22 x 0,15 mm3 aan de rand van een glazen plaat van 25 x 75 x 1,1 mm3, één bovenop de andere. Stapel nog twee 22 x 22 x 0,15 mm3 glazen platen aan de andere rand.
    3. Pipetongeveer 1 mL van de gesmolten agarose in de middendia tussen de twee bovenste glasplaten, plaats dan nog eens 25 x 75 x 1,1 mm3 dia bovenop de gesmolten agarose. Probeer de vorming van luchtbellen te voorkomen. Koel de glijbanen 15 min op 4 °C.
    4. Met behulp van een scalpel of scheermesje, snijd de pad voorzichtig in kleine vierkantjes, ~ 5 x 5 mm2. Bevestig een dubbelzijdige lijm van 17 x 28 x 0,25 mm3 frame op een glazen plaat van 25 x 75 x 1,1 mm3 en plaats verschillende pads op de glijbaan.
  2. Beeldverwerving
    OPMERKING: De volgende stappen worden beschreven voor een microscoop die onder de controle van SlideBook 6.0 en uitgerust met solid state illuminators, CCD monochrome camera, en een 100x objectieve lens (1.4 numerieke diafragma). Gebruik indien nodig alternatieve microscopieapparaten met de juiste hardware- en softwareconfiguraties die kunnen worden aangepast aan de protocolinstellingen.
    1. Los een zware patch l. pneumophila op in 1 mL ddH2O, vortex en pipet 2-3 μL van de verdunning op de pads. Plaats een 50 x 24 x 0,15 mm3 dekslip voorzichtig over het kleefframe.
    2. In het venster van de vangst past u de ND aan op 180. Pas de binning aan op 2×2 en gebruik het 488 nm-kanaal om het monster tussen 500-1000 ms bloot te leggen. Valideer de specificiteit van het fluorescentiesignaal door niet-gelabelde L. pneumophila met dezelfde parameters bloot te stellen (figuur 4).

4. Kwantificering van polaire lokalisatie en dynamiek van Dot/Icm-componenten

OPMERKING: De volgende stappen zijn ontworpen voor afbeeldingen met 0,129 μm per pixel die zijn aangeschaft met 2 x 2 binning.

  1. Kwantificering van polariteit voor sfGFP-fusieeiwitten (figuur 5)
    1. Pas het beeldcontrast aan zodat de bacteriën duidelijk zichtbaar zijn. Gebruik het gebiedsgereedschap om een rechthoek van 0,25 x 1,3 μm2 te plaatsen vanaf de paal en uit te breiden tot het cytoplasma. De rechthoek moet precies binnen de bacteriële grenzen blijven.
    2. Markeer ten minste 200 bacteriën en gebruik de knop Regio tot Masker om maskers te maken voor de gebieden van belang. Kies Object onder Maskerstatistieken en Maskerbereikde optie Object. Markeer vervolgens onder Kenmerken en Intensiteit gemiddelde intensiteit en variantie.
    3. Exporteer de gegevens en bereken de polariteitsscores van elke bacterie als de verhouding tussen de variantie met de gemiddelde intensiteit.
    4. Voor toepassingen met een hoge doorvoer gebruiken een fasedoelstelling en een geschikte condensatoropstelling om beelden te verkrijgen met de fase en 488 nm kanalen. Zorg ervoor dat u gezichtsvelden kiest waar de bacteriën volledig gescheiden zijn.
    5. Pas het fasekanaalcontrast van de afbeelding aan op een niveau waarop de bacteriën duidelijk zichtbaar zijn. Open de afbeelding met twee kanalen, start het venster Segmentmasker maken en wijzig het kanaal in fase.
    6. Pas een geschikte drempelwaarde aan en verwijder kleine objecten met de knop Objecten definiëren. Kies Onder Masker verfijnen de optie Randenverwijderen en later afzonderlijke maskers van bacteriën die naast elkaar liggen.
    7. Bereken de polariteitsscores van het signaal in het 488-kanaal voor elke cel, zoals eerder werd beschreven in de stappen 4.1.2–4.1.3.
  2. Kwantificering van de dynamiek voor sfGFP-fusieeiwitten(figuur 6)
    OPMERKING: Volg de instructies in sectie 3 om een voorbeeld voor te bereiden op het verkrijgen van afbeeldingen. Dynamiek wordt gedefinieerd als veranderingen in intensiteit in de tijd en de volgende stappen zijn ontworpen voor korte beeldperioden (d.w.z. enkele minuten). Voeg aan het pad de juiste supplementen als langere imaging periodes gewenst zijn.
    1. Markeer timelapsein het venster Afbeeldingvastmaken, voer de intervallentijd in het intervalvak in en voer 2 in het vak # tijdpunten in. Verwerf twee opeenvolgende beelden van L. pneumophila die het fluorescerende eiwit van belang uitdrukken.
    2. Pas het beeldcontrast aan totdat de cellen duidelijk zichtbaar zijn. Volg figuur 6A en de onderstaande beschrijvingen om drie verschillende maskers te plaatsen. Gebruik het gereedschap regio om een vierkant van 0,25 x 0,25 μm in het midden van ten minste 400 cellen te plaatsen.
    3. Gebruik de knop Regio naar Masker om een masker (masker 1) van de interessepleinen te maken. Maak een nieuw leeg masker (masker 2) en gebruik het pixelgereedschap of het veelhoekgereedschap om het hele celgebied van ten minste 25 willekeurige cellen te markeren, dat zal worden gebruikt om fluorescentiebleken te berekenen. Maak een nieuw leeg masker (masker 3) en gebruik het grote penseelgereedschap om gebieden tussen de cellen te markeren, die worden gebruikt voor aftrekking op de achtergrond.
    4. Kies Onder Maskerstatistieken en Maskerbereikde optie Object voor masker 1 en masker 2. Kies vervolgens onder Eigenschappen en Intensiteitde optie Gemiddelde intensiteit en exporteer de gegevens van de twee maskers. Exporteer voor masker 3 de gemiddelde intensiteit van het hele masker.
    5. Bereken de verandering in de fluorescentieintensiteit voor elk object in masker 1 met behulp van de volgende formules:

figure-protocol-1

figure-protocol-2

waar masker 1 een 0,25 μm × 0,25 μm vierkant is geplaatst in het celcentrum, masker 2 de hele cel bedekt, masker 3 de achtergrond is tussen cellen, t1 is de gemiddelde intensiteit in het eerste tijdspunt en t2 is de gemiddelde intensiteit in het tweede tijdspunt.

5. Detectie van sfGFP-massadichtheid met Cryo-ET

  1. Monstervoorbereiding, gegevensverzameling en reconstructie
    1. Laat een zware patch l. pneumophila groeien die een fluorescerend gelabeld Et/Icm-eiwit uitdrukt op CYE-agar-streptomycine platen gedurende 48 uur bij 37 °C. Resuspend de cellen in ddH2O tot OD600 ~ 0,7. Voeg 5 μL colloïdale gouddeeltjes (BSA Tracer, 10 nm) toe aan 20 μL van de celsuspensie.
    2. Pipette er 5 μL van het celmengsel op vers gloeigeloosd gatkoolstofraster (R 2/1 op Cu 200 mesh) en laat 1 min. Blot met filterpapier en vries in vloeibaar ethaan met behulp van een zwaartekracht-aangedreven zuigerapparaat zoals eerder beschreven14,15.
    3. Beeld de bevroren gehydrateerde exemplaren met een 300 kV transmissie elektronenmicroscoop uitgerust met een veld emissie pistool, een energiefilter, Volta fase plaat, en een direct detectie-apparaat. Verzamel eenenkele-assige kantelreeks met 26.000 x en 42.000x vergrotingen, wat resulteert in pixelgroottes op het modelniveau van respectievelijk 5,4 Å/pixel of 3,4 Å/pixel.
    4. Gebruik het tomografische pakket SerialEM om beeldstapels te verzamelen bij ~0 μm defocus, met een bereik van kantelhoeken tussen -60° en +60° met 3° staptoename en cumulatieve dosis van ~60 e-/Å2,16. Uitlijn dosisgefractioneerde filmbeelden in elke stapel met Behulp van MotionCor217. Monteer door driftgecorrigeerde stapels met TOMOAUTO14.
    5. Lijn door de drift gecorrigeerde stapels uit met de IMOD-markeringsafhankelijke uitlijning18. Reconstrueer tomogrammen met de SIRT-methode19 voor segmentaties en directe beeldanalyse en de WBP-methode20.
  2. Subtomogramanalyse van sfGFP-fusiemonsters
    1. Gebruik het tomografisch pakket I3 (0.9.9.3) voor subtomogramanalyse14,21,22.
      OPMERKING: De uitlijning verloopt iteratief, waarbij elke iteratie bestaat uit drie delen waarin verwijzingen en classificatiemaskers worden gegenereerd, subtomogrammen worden uitgelijnd en geclassificeerd en klassengemiddelden op elkaar zijn afgestemd.
    2. Gebruik 4 x 4 x 4 binned subtomogrammen voor een eerste uitlijning. Voeg deeltjes samen die tot klassengemiddelden behoren en tonen elektronendichtheid die overeenkomt met sfGFP. Gebruik na het sorteren van deeltjes met sfGFP-fusies 2 x 2 x 2 binned subtomogrammen voor een gerichte uitlijning van een gebied van belang (zoals het Dot/Icm cytoplasmaATPase-complex) om een structuur met hoge resolutie te verkrijgen.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Homologe recombinatie met dubbele selectie in twee stappen werd gebruikt om de gedefinieerde invoeging van sfGFP te construeren. In de eerste stap werd triparentalparing uitgevoerd, waarbij de pRK600 conjugative plasmid (een IncP plasmid) van de E. coli helper stam MT616 werd gemobiliseerd om de donor E. coli stam met de zelfmoordvector pSR47S met het sfGFP gen geflankeerd door de twee homologe regio's, de oorsprong van transfer oriT en de Bacillus subtilis counterselection gen sacB. V...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Het verduidelijken van de functies van bacteriële afscheidingssystemen is de sleutel tot een volledig begrip van host-pathogene interacties. Secretiesystemen zijn complexe machines die effectoreneiwitten in gastheercellen kunnen injecteren en in sommige gevallen de oprichting van een subcellulaire niche bevorderen die bacteriële replicatie ondersteunt. De bovenstaande methode biedt belangrijke nieuwe instrumenten voor het bestuderen van de Dot / Icm afscheidingsysteem van de respiratoire bacteriële pathogene Legionel...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

D.C. en C.R.R. werden ondersteund door de NIH (R37AI041699 en R21AI130671). D.P., B.H., en J.L. werden ondersteund door de National Institutes of Health (R01AI087946 en R01GM107629).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
10 nm colloidal gouddeeltjesAurion25486
100x Plan Apo objectief (1.4 NA)Nikon
ACESSigma-AldrichA9758
Geactiveerde houtskoolSigma-AldrichC5510
Agaroza GPG/LMP, laag smeltpuntAmerican bioanalyticalAB00981
Bacto gedehydrateerde agarBD214010
CoolSNAP EZ 20 MHz digitale monochroomcameraPhotometrics
Gene Frame, 1.7x2.8 cm, 125 µLFisher ScientificAB-0578
Holey Carbon raster R 2/1 Cu 200 meshQuantifoilQ225-CR1
IJzer(III) nitraat nonahydraatSigma-Aldrich216828
K2 Summit camera voor cryo-EMGATAN
L-CysteineSigma-AldrichC7352
Dekglasjes voor microscoop 22x22 mmFisher Scientific12-542B
Dekglasjes voor microscoop 24x50 mmFisher Scientific12-545K
Microscoopglaasjes 25x75x1 mmGlobe Scientific1380
SlideBook 6.0Intelligent Imaging Innovations
Spectra X lichtmotorLumencor
Taq 2X Master MixNew England BioLabsM0270
Titan KriosThermo Fisher Scientific
Gist ExtractBD212750

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Franco, I. S., Shuman, H. A., Charpentier, X. The perplexing functions and surprising origins of Legionella pneumophila type IV secretion effectors. Cellular Microbiology. 11, 1435-1443 (2009).
  2. Burstein, D., et al. Genome-scale identification of Legionella pneumophila effectors using a machine learning approach. PLOS Pathogens. 5, 1000508(2009).
  3. Ninio, S., Roy, C. R. Effector proteins translocated by Legionella pneumophila: strength in numbers. Trends in Microbiology. 15, 372-380 (2007).
  4. Vogel, J. P., Andrews, H. L., Wong, S. K., Isberg, R. R. Conjugative transfer by the virulence system of Legionella pneumophila. Science. 279, 873-876 (1998).
  5. Isberg, R. R., O'Connor, T. J., Heidtman, M. The Legionella pneumophila replication vacuole: making a cosy niche inside host cells. Nature Reviews Microbiology. 7, 13-24 (2009).
  6. Roy, C. R., Berger, K. H., Isberg, R. R. Legionella pneumophila DotA protein is required for early phagosome trafficking decisions that occur within min of bacterial uptake. Molecular Microbiology. 28, 663-674 (1998).
  7. Archer, K. A., Roy, C. R. MyD88-Dependent Responses Involving Toll-Like Receptor 2 Are Important for Protection and Clearance of Legionella pneumophila in a Mouse Model of Legionnaires' Disease. Infection and Immunity. 74, 3325-3333 (2006).
  8. Nagai, H., Kubori, T. Type IVB Secretion Systems of Legionella and Other Gram-Negative Bacteria. Frontiers in Microbiology. 2, 136(2011).
  9. Kubori, T., Nagai, H. The Type IVB secretion system: an enigmatic chimera. Current Opinion in Microbiology. 29, 22-29 (2016).
  10. Chetrit, D., Hu, B., Christie, P. J., Roy, C. R., Liu, J. A unique cytoplasmic ATPase complex defines the Legionella pneumophila type IV secretion channel. Nature Microbiology. 3, 678-686 (2018).
  11. Merriam, J. J., Mathur, R., Maxfield-Boumil, R., Isberg, R. R. Analysis of the Legionella pneumophila fliI gene: intracellular growth of a defined mutant defective for flagellum biosynthesis. Infection and Immunity. 65, 2497-2501 (1997).
  12. Feeley, J. C., et al. Charcoal-yeast extract agar: primary isolation medium for Legionella pneumophila. Journal of Clinical Microbiology. 10, 437-441 (1979).
  13. Andrews, H. L., Vogel, J. P., Isberg, R. R. Identification of linked Legionella pneumophila genes essential for intracellular growth and evasion of the endocytic pathway. Infection and Immunity. 66, 950-958 (1998).
  14. Morado, D. R., Hu, B., Liu, J. Using Tomoauto: A Protocol for High-throughput Automated Cryo-electron Tomography. Journal of Visualized Experiments. (107), e53608(2016).
  15. Hu, B., Lara-Tejero, M., Kong, Q., Galan, J. E., Liu, J. In Situ Molecular Architecture of the Salmonella Type III Secretion Machine. Cell. 168, 1065-1074 (2017).
  16. Mastronarde, D. N. Automated electron microscope tomography using robust prediction of specimen movements. Journal of Structural Biology. 152, 36-51 (2005).
  17. Zheng, S. Q., et al. MotionCor2: anisotropic correction of beam-induced motion for improved cryo-electron microscopy. Nature Methods. 14, 331-332 (2017).
  18. Kremer, J. R., Mastronarde, D. N., McIntosh, J. R. Computer visualization of three-dimensional image data using IMOD. Journal of Structural Biology. 116, 71-76 (1996).
  19. Gilbert, P. Iterative methods for the three-dimensional reconstruction of an object from projections. Journal of Theoretical Biology. 36, 105-117 (1972).
  20. Radermacher, M. Weighted Back-projection Methods. Electron Tomography. , 245-273 (2007).
  21. Winkler, H., et al. Tomographic subvolume alignment and subvolume classification applied to myosin V and SIV envelope spikes. Journal of Structural Biology. 165, 64-77 (2009).
  22. Winkler, H., Taylor, K. A. Accurate marker-free alignment with simultaneous geometry determination and reconstruction of tilt series in electron tomography. Ultramicroscopy. 106, 240-254 (2006).
  23. Prevost, M. S., Waksman, G. X-ray crystal structures of the type IVb secretion system DotB ATPases. Protein Science. 27, 1464-1475 (2018).
  24. Miklos, G. L., Rubin, G. M. The role of the genome project in determining gene function: insights from model organisms. Cell. 86, 521-529 (1996).
  25. Reyrat, J. M., Pelicic, V., Gicquel, B., Rappuoli, R. Counterselectable markers: untapped tools for bacterial genetics and pathogenesis. Infection and Immunity. 66, 4011-4017 (1998).
  26. Yu, J. Single-Molecule Studies in Live Cells. Annual Review of Physical Chemistry. 67, 565-585 (2016).
  27. Stewart, P. L. Cryo-electron microscopy and cryo-electron tomography of nanoparticles. Wiley Interdisciplinary Reviews: Nanomedicine and Nanobiotechnology. 9, (2017).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

FluorescentiemicroscopieType IV secretiesysteembacteri le polaire lokalisatieSuperfolder GFP fusieanalyse van structurele dynamiekintacte bacteri le cellen

Gerelateerde artikelen