Method Article

Volledig verwerkte recombinant KRAS4b: isoleren en karakteriseren van het Farnesylated en gemethyleerd eiwit

DOI:

10.3791/60703

⸱

January 16th, 2020

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1NCI RAS Initiative, Cancer Research Technology Program, Frederick National Laboratory for Cancer Research

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Prenylatie is een belangrijke modificatie op perifere membraan bindende eiwitten. Insecten cellen kunnen worden gemanipuleerd om gefarnesylen carboxymethylated KRAS4b te produceren in hoeveelheden die biofysische metingen van eiwit-eiwit-en proteïne-lipide-interacties mogelijk maken

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Eiwit prenylatie is een belangrijke modificatie die verantwoordelijk is voor het richten van eiwitten op intracellulaire membranen. KRAS4b, dat wordt gemuleerd in 22% van de menselijke kankers, wordt verwerkt door farnesylatie en carboxymethylatie als gevolg van de aanwezigheid van een ' CAAX ' vak motief bij het C-Terminus. Een Engineered Baculovirus systeem werd gebruikt om farnesylated en carboxymethylated KRAS4b in insecten cellen uit te drukken en is eerder beschreven. Hier beschrijven we de gedetailleerde, praktische zuivering en Biochemische karakterisering van het eiwit. Met name werden affiniteit en ionenwisselingschromatografie gebruikt om het eiwit te zuiveren tot homogeniteit. Intact en inheemse massaspectrometrie werd gebruikt voor het valideren van de juiste modificatie van KRAS4b en om te controleren of nucleotide binding. Tot slot werd de membraan vereniging van farnesylated en carboxymethylated KRAS4b aan liposomen gemeten met behulp van oppervlakte Plasmon resonantie spectroscopie.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Posttranslationele modificaties spelen een belangrijke rol bij het bepalen van de functionele activiteit van eiwitten. Wijzigingen zoals fosforylering en glycosylatie zijn goed vastgesteld. Lipide-modificaties zijn echter minder goed gekarakteriseerd. Geschat wordt dat maar liefst 0,5% van alle cellulaire eiwitten kunnen worden prenylated1. Prenylation is de overdracht van een 15-Carbon het of een 20-Carbon geranylgeranyl lipide keten aan een acceptor eiwit met de caax Motif2. Prenylated eiwitten zijn betrokken bij de progressie van verschillende ziekten van de mens, met inbegrip van vroegtijdige veroudering

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. eiwit zuivering

  1. Buffers voorbereiden A – H, zoals te zien in tabel 1.
BufferoplossingBuffer-agent (alle 20 mM) pH NaCl (mM)imidazol (mM)MgCl2 TCEP
AHEPES7,3300-51
B....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Een van de grootste variabelen in het protocol is de hoeveelheid uitgedrukt doel proteïne (His6-MBP-TeV-KRAS4b). Dit protocol werd ontwikkeld met behulp van een isolaat uit een Trichoplusia ni cellijn, TNI-FNL17, aangepast voor de groei van de suspensie en gespeende uit serum. Gezien het brede scala van resultaten gerapporteerd over de verschillende insecten cellijnen met de Baculovirus expressie systeem, is het raadzaam dat TNI-FNL worden gebruikt, althans aanvankelijk, om KRAS4b-FMe gep.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Zoals opgemerkt in de representatieve resultaten sectie, de meest kritieke stap tijdens de zuivering is de behandeling van het monster gedurende de tijd dat het in lager zout. Het beperken van de tijd dat het monster wordt blootgesteld aan minder dan 200 mM NaCl zal helpen verminderen neerslag en verhoging van de monster opbrengst. Interpretatie van de resultaten van de CEX kan moeilijk zijn als het profiel niet overeenkomt met de verwachtingen (Zie Figuur 2). Totdat het protocol routine is .......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs hebben niets te onthullen.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

We erkennen het klonen en expressie steun van Carissa Grose, Jen Melhalko, en Matt Drew in het proteïne Expression laboratorium, Frederick National Laboratory voor kankeronderzoek. Dit project is geheel of gedeeltelijk gefinancierd met federale fondsen van het nationaal kanker instituut, National Institutes of Health, onder contract nr. HHSN261200800001E. De inhoud van deze publicatie weerspiegelt niet noodzakelijkerwijs de standpunten of het beleid van het Department of Health and Human Services, noch vermeldt handelsnamen, commerciële producten of organisaties goedkeuring door de Amerikaanse overheid

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
1.8 mL Safe-Lock Tubes, NaturalEppendorf22363204
11 mm Cl SS Interlocked Insert Autosampler VialsThermo Scientific30211SS-1232
1-palmitoyl-2-oleoyl-glycero-3-phosphocholine (POPC)AVANTI POLAR LIPIDS850457purchase as liquid stocks in chloroform
1-palmitoyl-2-oleoyl-glycero-3-phospho-L-serine (POPS)AVANTI POLAR LIPIDS840034purchase as liquid stocks in chloroform
5427R CentrifugeEppendorf
Acetonitrile, HPLC GradeFisher ChemicalA998-1 1L
Ammonium AcetateSigma-Aldrich09689-250g
Argon gasAirgasARUP
Assay Plate 384CORNING3544
Biacore T200 InstrumentGE Healthcare
Blue Snap-It Seals, T/SThermo ScientificC4011-54B
Branson Ultrasonic BathThermo Fisher15-336-1000
Cation Exchange Chromatography (CEX) columnGE Healthcare Life Sciences29018183HiPrep SP Sepharose High Performance
CHAPSSigmaC3023
Dyna Pro Plate ReaderWyatt Technologies
Exactive Plus EMR Mass SpectrometerThermo Scientific
Formic AcidSigma-AldrichF0507-500MlUse Reagent Grade or better
Gilson vials 7x14 mm TubesGE HealthcareBR-1002-12
Glass screw thread vials with PTFE foam linersScientific SpecialitiesB69302
High speed/benchtop centrifugeThermo Fischer Scientific05-112-114Dcapable of up to 4,000 xg
His6-Tobacco Etch Virus (TEV) proteaseAddgene92414Purified as per Raran-Kurussi et al. (2017) Removal of Affinity Tags with TEV Protease. In: Burgess-Brown N. (eds) Heterologous Gene Expression in E.coli. Methods in Molecular Biology, vol 1586. Humana Press, New York, NY
Immobilized Metal Affinity Chromatography (IMAC) columnGE Healthcare Life Sciences28-9365-51HisPrep FF 16/10
In-House Water Supply, Arium AdvanceSartorius StedimResistivity of 18 MΩ0-cm
Lipid extruder set with holderAVANTI POLAR LIPIDS610023
Liquid nitrogenAirgasNI-DEWAR
M110-EH microfluidizerMicrofluidics
MabPac RP UHPLC Column, 4 um, 3.0 x 50 mmThermo Scientific088645
MabPac SEC-1 Column, 5 um, 300 Å, 2.1 x 150 mmThermo Scientific088790
MagTran softwareThermo Scientific
Methanol, HPLC GradeVWR ChemicalsBDH20864.400
NGC Chromatography SystemBioRad78880002NGC QuestTM 100 Chromatography system
Protease Inhibitor Cocktail without EDTA or other chelatorsMillipore SigmaP8849
Rubber Caps type 3GE HealthcareBR-1005-02
Series S Sensor Chip L1GE Healthcare29104993
SpectrophotometerThermo Fischer Scientific13-400-519Absorbace at 280nm
Ultra-15 Centrifugal Filter Units, 10K NMWLMillipore SigmaUFC901008PES membrane
Ultracel 10K MWCO Ultra 0.5 mL Centrifuge FiltersAmiconUFC501024
UltracentrifugeBeckman CoulterOptima - L80Kcapable of 100,000 xg
Vanquish UHPLC (Pump, Column Hearter, and LC System)Thermo Scientific
Vortex Genie 2Fisher12-812
Water, HPLC GradeSigma-Aldrich270733-1LMay use in-house water source (see below)
Whatman GD/XP PES 0.45 mm syringe filterGE Healthcare - Whatman6994-2504
Xcalibur QualBrowserThermo Scientificproteomics software

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Cox, A. D., Der, C. J. Protein prenylation: more than just glue. Current Opinion in Cell Biology. 4 (6), 1008-1016 (1992).
  2. Zhang, F. L., Casey, P. J. Protein Prenylation: Molecular Mechanisms and Functional Consequences. Annual Review of Biochemistry.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

KRAS4b PurificationFarnesylated ProteinCation Exchange ChromatographyIntact Mass SpectrometrySurface Plasmon ResonanceBaculovirus ExpressionLiposome Binding AssayProtein DialysisIMAC ChromatographyNucleotide Binding Analysis

Related Articles