Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Volledig verwerkte recombinant KRAS4b: isoleren en karakteriseren van het Farnesylated en gemethyleerd eiwit

5.7K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/60703

⸱

16 januari 2020

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1NCI RAS Initiative, Cancer Research Technology Program, Frederick National Laboratory for Cancer Research

In dit artikel

Samenvatting

Prenylatie is een belangrijke modificatie op perifere membraan bindende eiwitten. Insecten cellen kunnen worden gemanipuleerd om gefarnesylen carboxymethylated KRAS4b te produceren in hoeveelheden die biofysische metingen van eiwit-eiwit-en proteïne-lipide-interacties mogelijk maken

Samenvatting

Eiwit prenylatie is een belangrijke modificatie die verantwoordelijk is voor het richten van eiwitten op intracellulaire membranen. KRAS4b, dat wordt gemuleerd in 22% van de menselijke kankers, wordt verwerkt door farnesylatie en carboxymethylatie als gevolg van de aanwezigheid van een ' CAAX ' vak motief bij het C-Terminus. Een Engineered Baculovirus systeem werd gebruikt om farnesylated en carboxymethylated KRAS4b in insecten cellen uit te drukken en is eerder beschreven. Hier beschrijven we de gedetailleerde, praktische zuivering en Biochemische karakterisering van het eiwit. Met name werden affiniteit en ionenwisselingschromatografie gebruikt om het eiwit te zuiveren tot homogeniteit. Intact en inheemse massaspectrometrie werd gebruikt voor het valideren van de juiste modificatie van KRAS4b en om te controleren of nucleotide binding. Tot slot werd de membraan vereniging van farnesylated en carboxymethylated KRAS4b aan liposomen gemeten met behulp van oppervlakte Plasmon resonantie spectroscopie.

Inleiding

Posttranslationele modificaties spelen een belangrijke rol bij het bepalen van de functionele activiteit van eiwitten. Wijzigingen zoals fosforylering en glycosylatie zijn goed vastgesteld. Lipide-modificaties zijn echter minder goed gekarakteriseerd. Geschat wordt dat maar liefst 0,5% van alle cellulaire eiwitten kunnen worden prenylated1. Prenylation is de overdracht van een 15-Carbon het of een 20-Carbon geranylgeranyl lipide keten aan een acceptor eiwit met de caax Motif2. Prenylated eiwitten zijn betrokken bij de progressie van verschillende ziekten van de mens, met inbegrip van vroegtijdige veroudering3, Alzheimer4, cardiale disfunctie5, choroideremia6, en kanker7. De kleine gtpases, hri's, nri's, en kras1, nucleaire laminaten, en de kinetochoren cenp-E en F zijn farnesylated eiwitten onder de basale aandoening. Andere kleine GTPases, namelijk RhoA, RhoC, Rac1, CDC-42 en RRAS zijn geranylgeranylated8, terwijl rhob farnesylated of geranylgeranylated9kan zijn.

De kleine GTPase KRAS4b fungeert als een moleculaire switch, in wezen overdracht van extracellulaire groeifactor signalering naar intracellulaire signaaltransductie trajecten die celgroei en proliferatie stimuleren, via meerdere eiwit-eiwit interacties. Er zijn twee belangrijke aspecten van KRAS4b biochemie die essentieel zijn voor haar activiteit. Ten eerste, de eiwit cycli tussen een inactief BBP en een actieve GTP gebonden toestand waarbij het actief met Effectors bezig is. Tweede, een C-terminale poly-lysine regio en een farnesylated en carboxymethylated cysteïne direct het eiwit naar het plasma membraan, waardoor werving en activering van stroomafwaartse Effectors. Mutant KRAS4b is een oncogene driver in pancreatic, colorectale en longkanker10, en als zodanig, therapeutische interventie zou een groot klinisch voordeel hebben. Productie van authentiek gemodificeerd recombinant eiwit dat is farnesylated en carboxymethylated zou biochemische screening mogelijk maken met behulp van KRAS4b in combinatie met membraan surrogaten zoals liposomen of lipide nano schijven11,12.

Het Transferase (fnt) katalyseert de toevoeging van het pyrofosfaat aan de C-terminale cysteïne in het caax motief in KRAS4b. Na prenylatie wordt het eiwit verhandeld aan het endoplasmisch reticulum (er) waar het RAS converting enzym (RCE1) de drie C-terminale residuen Slaid. De laatste stap in de verwerking is methylering van het nieuwe C-terminale farnesylcysteïne residu door het ER membraan proteïne, isoprenylcysteïne carboxylgroep methyltransferase (ICMT). Expressie van recombinant KRAS4b in E. coli resulteert in de productie van een ongemodificeerd eiwit. Eerdere pogingen om verwerkte KRAS4b te produceren zijn beperkt als gevolg van onvoldoende opbrengsten voor structurele of drug screening experimenten of hebben nagelaten om de inheemse full-length volwassen eiwit13,14te recapituleren. Het protocol hier gepresenteerd maakt gebruik van een Engineered Baculovirus gebaseerde insect Cell expressie systeem en zuiveringsmethode die zeer gezuiverde, volledig verwerkte KRAS4b genereert bij rendementen van 5 mg/L celcultuur.

Zorgvuldige eiwit karakterisering is essentieel voor het valideren van de kwaliteit van recombinant eiwitten voorafgaand aan het beginnen met structurele biologie of drug screening studies. Twee belangrijke parameters van volledig verwerkte KRAS4b zijn validatie van de juiste prenyl-modificatie en de beschikbaarheid van de farnesylated en carboxymethylated C-Terminus (FMe) voor interactie met membraan vervangers of lipiden. Elektro spray ionisatie massaspectrometrie (ESI-MS) van de KRAS4b-FME werd gebruikt om het molecuulgewicht te meten en de aanwezigheid van de het en Carboxymethyl modificaties te bevestigen. Inheemse massaspectrometrie, waarbij monsters worden besproeid met niet-denaturerende oplosmiddelen, werd gebruikt om aan te tonen dat KRAS4b-FMe ook gebonden was aan zijn BBP cofactor. Ten slotte werd oppervlak Plasmon resonantie spectroscopie gebruikt om de directe binding van KRAS4b-FMe met geïmmobiliseerde liposomen te meten.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

1. eiwit zuivering

  1. Buffers voorbereiden A – H, zoals te zien in tabel 1.
BufferoplossingBuffer-agent (alle 20 mM) pH NaCl (mM)imidazol (mM)MgCl2 TCEP
AHEPES7,3300-51
BHEPES7,33003551
CHEPES7,330050051
DMES6,0200-51
EMES6,0--51
FMES6,0100-51
GMES6,01000-51
HHEPES7,3300-11
  1. Bereiden van de zuiverings materialen (Zie tabel van de materialen): cocktail van de proteaseremmer zonder EDTA of andere chelatoren; geïmmobiliseerde metalen affiniteits chromatografie (IMAC) kolom; Cex-kolom (kation Exchange chromatografie); 0,45 μm spuit filter; 2 M imidazol (pH = 7,5); ultracentrifuge geschikt voor 100.000 x g; High Speed tafel centrifuge geschikt voor 4.000 x g; centrifugale filter units (10 KDa NMWL); spectrofotometer in staat om te lezen bij 280 nm; His6-tabak etch virus (TEV) protease; en chromatografie instrumentatie die twee bufferoplossingen kunnen mengen, oplossingen toepassen op kolommen, verloop eluties van kolom maken en fracties van kolommen verzamelen.
  2. Ontdooi cellen van ~ 2 L van insecten celcultuur eerder opgeslagen bij-80 °C of gebruik vers geoogste cellen. Zie Gillette et al. 201915 voor meer informatie over de TNI. FNL insecten cellijn en expressie protocollen. Zorgvuldig hervatten van de cellen met 200 mL buffer A met toegevoegde 1:200 v/v protease inhibitor zonder invoering van lucht of het maken van schuim.
    Opmerking: stap 1,3 en volgende stappen (behalve zoals vermeld) moeten worden uitgevoerd bij kamertemperatuur (~ 22 °C). Het is belangrijk dat het monster homogeen is om volledige lysis in de volgende stap toe te staan.
  3. Lyse celpellet in een microfluidizer bij 7.000 psi voor twee passes of in een gelijkwaardig lysissysteem. Alternatieve methoden van lysis zijn niet onderzocht.
  4. Verhelderende insecten cellysaten is problematisch als gevolg van de aanwezigheid van verbindingen die filters verstoppen. Zo is ultracentrifugatie (100.000 x g gedurende 30 minuten bij 4 °c) erg belangrijk. Een wit lipide residu op het oppervlak van het supernatant moet worden vermeden en kan worden verwijderd of verminderd met behulp van wattenstaafjes. Filter het gedecanteerde supernatant door een 0,45 μm PES filter. Gebruik het geklaarde monster onmiddellijk of Bewaar bij-80 °C.
    Opmerking: het residu blokkeert filters snel en er kunnen veel filters nodig zijn. Het niet verminderen van de hoeveelheid van dit materiaal zal leiden tot een hoge kolom terug druk in de volgende stappen.
  5. Bepaal het volume van het geklaarde lysaat en stel het monster in op 35 mM imidazol door toevoeging van 2 M imidazool kolf. Laad het monster in 3 mL/min op een IMAC-kolom van 20 mL (HisPrep FF 16/10-kolom), voorgeëscaleerd in buffer B voor drie kolom volumes (CVs).
  6. Hoewel het doeleiwit doorgaans kwantitatief wordt geadsorbeend aan de kolom, is het het beste om de kolom stroom te verzamelen voor latere analyse. Was de kolom totdat de ABS280 een stabiele Baseline bereikt (< 100 milliextinctie eenheden [mAU]) met buffer B bij 3 ml/min voor 20 ml (1 CV) dan voor ~ 3 CV bij 4 ml/min voor de rest van de Wash stap. Gewoonlijk is 60 – 80 mL buffer B nodig om de uitgangs absorptie te bereiken.
  7. Elute het eiwit met een gradiënt van 400 mL (20 CV) van buffer B naar buffer C bij het verzamelen van 8 mL fracties. Meestal wordt het doeleiwit in de eerste helft van het verloop weergegeven (Figuur 1A; niet alle latere fracties worden getoond).
  8. Analyseer eiwit fracties met SDS-PAGE/Coomassie-kleuring. Pool piek fracties en dialyseer het zwembad 's nachts tegen 2 L buffer D bij 4 °C.
    Opmerking: lage pH is essentieel om te zorgen voor eiwitbinding in de volgende stap. De pH-verandering tijdens deze dialyse treedt echter langzaam op en dit is een handige stap voor een nachtelijke incubatie. Alternatieve strategieën voor buffer uitwisseling (bijv. een hogere buffer concentratie om de pH-verandering te versnellen) zijn niet onderzocht. Het eiwit begint langzaam neer te slaan in de tijd bij lagere pH-en lagere zoutconcentraties en een kleine hoeveelheid neerslag is normaal tijdens deze stap. Daarom vermijden we de buffer te verwisselen voor de 100 mM NaCl die nodig is voor de binding aan de volgende kolom tijdens dialyse. In plaats daarvan wordt een NaCl-concentratie van 200 mM gebruikt voor dialyse en wordt het eiwit verdund tot 100 mM (zie hieronder) onmiddellijk voorafgaand aan de toepassing op de kolom. We hebben niet onderzocht of deze neerslag specifiek is voor KRAS4b, maar het eiwit dat neerslaan is bevestigd als KRAS4b-FMe. Daarom raden we aan om de hogere NaCl-concentratie in de dialyse buffer te gebruiken voor elk eiwit van belang als voorzorgsmaatregel totdat de stabiliteit van het doeleiwit in de bindings buffer kan worden bepaald.
  9. Verwijder het monster van dialyse en centrifugeer bij 4.000 x g gedurende 10 minuten om een precipitaat te verwijderen. De laatste gedialyseerde, geklaarde steekproef op dit punt is nog vaak wazig, maar kan zonder verdere verwerking worden toegepast op de daaropvolgende CEX-kolom.
  10. Maak een wissel kolom van 20 mL (Zie tabel met materialen) door te wassen met drie CVS van buffer G en vervolgens met drie cv's van buffer F.
    Opmerking: Hoewel we andere harsen niet nauwgezet hebben geëvalueerd, hebben verschillende collega's een slechte resolutie gevonden met andere harsen dan SP Sepharose High Performance Resin.
  11. Verdun 20 ml van het gedialyseerde monster tot een uiteindelijke NaCl-concentratie van 100 mM door 20 mL buffer E toe te voegen en het verdunde monster toe te passen op de kationen wisselingskolom.
  12. Doorgaan met het laden van de kolom door het toevoegen van vers verdunde monsters bereid zoals hierboven beschreven aan de laad buis als de vorige verdunning nadert het einde van de lading.
    Opmerking: verdunning van het volledige monster in één keer tot 100 mM NaCl heeft geresulteerd in significant verlies van doel proteïne als gevolg van neerslag.
  13. Was de kolom naar Baseline ABS280 met buffer F. Dit vereist meestal 3 CV. Het eiwit wordt uit de kolom verwijderd tijdens een gradiënt van 400 mL (20 CV) van buffer F tot 65% buffer G, verzameld in fracties van 6 mL (Figuur 1B).
  14. Doorgaan met het wassen van de kolom voor een extra 1,5 CV (65% buffer G) zodra het verloop is voltooid. Kies positieve fracties op basis van SDS-PAGE/Coomassie Blue Stain analyse en inspectie van het UV-spoor van het chromatogram.
    Opmerking: de UV-Trace bevat meestal vijf pieken. Beginnend bij lagere zoutconcentraties, is de eerste piek meestal onverwerkte en/of proteolyzed eiwit. De tweede en derde pieken zijn een mengsel van twee vormen van verwerkte eiwitten: de tweede piek is in de eerste plaats een farnesylated intermediair (FARN), terwijl de derde in de eerste plaats het volledig verwerkte FMe-eiwit van belang is. Pieken vier en vijf vertegenwoordigen His6-MBP-KRAS4b Fusion eiwitten (alle van het eiwit is in dit formaat op dit punt, als er geen TEV spijsvertering heeft plaatsgevonden). Deze zijn niet N-geacetyleerd op het N-eindpunt en zijn farnesylated (piekvier) en farnesylated en carbon (piek vijf) op het C-eindpunt. Omdat Peak Two en Peak Four identieke eiwitten produceren na het verwijderen van tags (d.w.z. KRAS4b-FARN), kunnen deze in dit stadium desgewenst worden samengevoegd. Op dezelfde manier kunnen piek drie en piek vijf worden gecombineerd om één lot KRAS4b-FMe te produceren (Figuur 1B, Figuur 2). Er wordt echter geadviseerd deze bundeling alleen te doen wanneer de aard van het eiwit in de afzonderlijke pieken is bevestigd.
  15. Verteren het eiwit gegroepeerd in stap 1,15 met His6-TEV protease (~ 200 μg protease/mL monster.
    Opmerking: we maken His6-TEV protease met behulp van de plasmide en protocollen die beschikbaar zijn bij Addgene (https://www.addgene.org/92414). Dialyze de TEV Digest tegen buffer A (10 kDa MWCO dialyse slang met minimaal 40 mL buffer A per mL monster) gedurende 2 uur bij kamertemperatuur en vervolgens 's nachts bij 4 °C.
  16. Na de spijsvertering en dialyse, laadt u het eiwit direct in een 20 mL IMAC-kolom met buffer A bij 3 mL/min.
    Opmerking: Verzamel 7 mL fracties tijdens deze hele chromatografie, omdat het doeleiwit een lage affiniteit heeft voor de kolom, maar mogelijk niet volledig gebonden is aan de hars. Was de kolom op 3 mL/min met buffer A voor in totaal 3 Cv's of tot een baseline extinctie is bereikt.
  17. Het doeleiwit wordt voorzien van een 5 CV gradiënt van buffer C van 0% – 10%, en verzamelt 7 mL fracties. Uit voorzorg kunnen extra gebonden eiwitten worden voorzien van 100% buffer C. positieve fracties worden geïdentificeerd na analyse door SDS-PAGE (Figuur 1C). Kenmerkend is dat het doeleiwit afdempt bij een lage imidazol-concentratie (d.w.z. in de buffer C-gradiënt van 0% – 10%), maar soms afgaat in de doorstroom-of kolom spoeling.
  18. Dialyze de uiteindelijke pool tegen buffer H. Bepaal de eiwitconcentratie door spectrofotometrie bij 280 nm.
    Opmerking: Zorg ervoor dat u rekening moet maken met de aanwezigheid van de nucleotide bij het bepalen van de extinctiecoëfficiënt voor deze berekening.
  19. Het eiwit kan worden geconcentreerd tot ~ 2 – 5 mg/mL met behulp van een centrifugale filter Unit (10 K NMWL) zonder significant eiwitverlies. Filter met een spuit filter van 0,22 μM. Meet de extinctie van de oplossing bij een280 om de uiteindelijke eiwitconcentratie te berekenen (Figuur 1D). Snap Vries aliquots in vloeibare stikstof en bewaar bevroren monsters bij-80 °C.
    Opmerking: het gezuiverde eiwit is gebonden aan het BBP. KRAS4b-FMe kan worden ingewisseld voor GppNHp met behulp van eerder gepubliceerde protocollen16.

2. monstervoorbereiding voor intacte massa analyse en inheemse massa analyse

  1. Monstervoorbereiding voor intacte massa analyse
    1. Eiwit monster op ijs ontdooien voorafgaand aan de analyse. Voor intacte massa analyse, Verdun het eiwit tot 0,1 mg/mL in 20 mM Ammoniumbicarbonaat (pH = ~ 8,4). Voor inheemse massa analyse, Verdun het eiwit tot een concentratie van 0,1 mg/mL in 50 mM ammoniumacetaat (pH = ~ 7,5). Vortex elk monster voor 5 – 10 s, vervolgens Centrifugeer bij 12.500 x g gedurende 1 minuut om elk vast materiaal in de oplossing te pellet. Verwijder 10 – 20 μL van elk supernatant en breng het over in een glazen autosampler-injectieflacon. Dop elke injectieflacon strak om verontreiniging of verdamping te voorkomen.
      Opmerking: voor de intacte massa analyse of de inheemse massa analyse kan het monster vóór analyse worden ontgaan met behulp van een membraanfilter van 10 kDa MWCO cellulose voor buffer-uitwisseling in de uiteindelijke verdunningsbuffer.
  2. Voorbereiding van de massa spectroscopie van de uitgebreide massa Range (EMR) voor massa analyse
    Opmerking: voordat u een analyse uitvoert op de massaspectrometer, moet u ervoor zorgen dat deze onlangs is gekalibreerd. Draag ook altijd handschoenen en andere persoonlijke beschermingsmiddelen die nodig zijn om schadelijke chemicaliën te voorkomen en om contaminerende monsters en oplosmiddelen te voorkomen. Kalibratie gebeurt met behulp van een commercieel verkregen ijkoplossing en een 2 mg/ml cesium jodide-oplossing die in eigen huis wordt bereid.
    1. Open de analyse software en laad het juiste instrument methode bestand. Voor intacte massa analyse van KRAS4b eiwitten zijn geschikte startparameters als volgt: positieve detectiemodus; drie micro scans, resolutie = 70.000; AGC target = 3e6; maximale integratie tijd = 200 MS; en een scanbereik = 70 – 1800 massa-oplaad verhouding (m/z). Voor inheemse massa analyse van KRAS4b eiwitten zijn geschikte startparameters als volgt: positieve detectiemodus; 10 micro scans, resolutie = 17.500; in-source botsing-geïnduceerde dissociatie (CID) = 20 eV; AGC target = 3e6; botsingsenergie (CE) = 20; maximale integratie tijd = 200 MS; en een scanbereik = 500 – 10000 m/z.
  3. Bereiding van chromatografische oplosmiddelen en kolom
    1. Bereid de oplosmiddelen die nodig zijn voor de intacte massa analyse. Oplosmiddel A is water met 0,1% mierenzuur. Oplosmiddel B is 80% acetonitril en 0,1% mierenzuur in water.
    2. Bereid de oplosmiddelen die nodig zijn voor de inheemse massa analyse. Oplosmiddel A is 0,1 M ammoniumacetaat in water en oplosmiddel B is water.
    3. Nadat de juiste oplosmiddelen zijn bereid, zuivering van het systeem, zodat de slang is gevuld met de juiste oplosmiddelen en alle luchtbellen worden verwijderd uit de lijnen.
    4. Installeer de juiste kolom (een omgekeerde-fase kolom voor intacte massa analyse en een grootte uitsluitings kolom voor native massa analyse). Voor intacte massa analyse is het debiet 0,5 mL/min en is de kolomtemperatuur (met behulp van een kolom verwarmer) 50 °C. De kolom wordt in een evenwichts veld van 15 – 20 min. Voor native massa analyse is het debiet 0,25 mL/min.
      Opmerking: Controleer altijd de kolom back-Pressure om ervoor te zorgen dat deze niet stijgt boven de bovengrens, die kan duiden op een verstopte lijn of dat de kolom matrix is aangetast. Vervang indien nodig de kolom.
  4. Voorbeeld analyse
    1. Plaats het bereide eiwit monster in de glazen autosampler-injectieflacon in de juiste flacon houder in de LC-systemen autosampler. Maak een lijst met voorbeelden in het softwareprogramma met de juiste instrument methode voor de gewenste analyse. Zodra de voorbeeld lijst is voltooid, klikt u op de knop afspelen om de analyse te starten.
    2. Injecteer 1 – 2 μL monster per analyse, met een water blanco voor en na elk monster, om er zeker van te zijn dat er geen Carry-over aanwezig is.
      Opmerking: de intacte massa analyse is heel anders dan de native massa analyse en vereist heel verschillende instellingen voor instrument methoden. Dit komt omdat met de intacte massa analyse het eiwit "ontspannen" is in de aanwezigheid van een organisch oplosmiddel, en dus in staat is om meer ladingen te accepteren. Het is gemakkelijker om te deconvolumen en de isotopen verdeling van de charge toestanden op te lossen. Native Mass analyse biedt een nauwe lading verdeling van de eiwit ionen, en op basis van het eiwit, vereist verschillende spanning en botsing energie-instellingen.
  5. Data-analyse en eiwit deconvolutie
    1. Exporteer het spectrum van het monster naar software waar het kan worden omgezet in het verbrede spectrum dat de intacte massa (of de inheemse massa) van het eiwit weergeeft. De intacte massa zal een isotopen piek verdeling hebben door de hoge overvloed aan geladen spectrale pieken. De inheemse massa zal meestal zeer weinig pieken door de geringe overvloed van de geladen spectrale pieken (Figuur 3D).
    2. Breid het m/z-bereik (Mass-to-charge ratio) van de piek d uit om te bevestigen dat de gemeten massa consistent is met de voorspelde massa. Soms, als gevolg van de toevoeging van ladingen aan het eiwit, kan er een lichte variatie zijn tussen het verwachte molecuulgewicht (MW) en het waargenomen MW. Ook, zoals met veel massaspectrometrie analyses, adducten zoals natrium kunnen bijdragen tot het verschijnen van extra pieken in de gegevens, zelfs met zorgvuldig ontzout monsters. Lagere overvloedige pieken met een m/z die lager is dan verwacht worden soms waargenomen. Dit is waarschijnlijk te wijten aan een neutraal verlies, dat is het verlies van een functionele groep als gevolg van het ionisatie proces.
      Opmerking: zoals verwacht, zullen er verschillen zijn tussen de intacte massa en de inheemse massa pieken. Het intacte massa display toont het verwachte MW van het eiwit. Het zal niet het extra MW van de aangesloten nucleotide of andere modificaties hebben. Echter, de inheemse massa piek zal het eiwit met een toegevoegde nucleotide tonen.

3. validering van KRAS4b-FMe binding aan liposomen

  1. Voorbereiding van membraan liposomen
    1. Bereid een buffer bestaande uit 20 mM HEPES (pH = 7,3), 150 mM NaCl en 1 mM TCEP.
    2. Liposome voorbereidings materialen omvatten 25 mM 1-Palmitoyl-2-oleoyl-glycero-3-fosfocholine (POPC) en 10 mM 1-Palmitoyl-2-oleoyl-glycero-3-fosho-L-Serine (POPS) aandelen in chloroform; een lipide-extruder ingesteld met een houder en verwarmingsblok; Argon-gas en vloeibare stikstof; een ultrasoon bad; glazen schroefdraad flesjes met PTFE schuim liners; en een plaat lezer die dynamische lichtverstrooiing kan detecteren.
    3. De lipide voorraden in chloroform bij kamertemperatuur gedurende 30 minuten ontdooien. bereid 1 ml van 5 mm 70:30 popc: Pops liposomen door te Doseer 106 μL van 25 mm popc (Stock) en 118 μL 10 mm Pops (voorraad) in een glazen injectieflacon.
      Let op: niet aliquot lipiden met een plastic tip, omdat de chloroform bepaalde plastic tips kan oplossen.
    4. Droge lipiden onder een gestage stroom van Argon gas. Draai de glazen injectieflacon langzaam bij het aanbrengen van het Argon-gas om een dun laagje droge film te vormen.
    5. Zet monsters onder een vacuüm lyofilisator 's nachts om overtollige chloroform te verwijderen.
    6. Reconstitueer de lipiden door 1 mL buffer aan de gedroogde film toe te voegen en Vortex de mengsels gedurende 5 min. Hydrateer de lipide mengsels door te schommelen voor 1 uur bij 25 °C.
      Opmerking: het monster zal zeer troebel zijn bij toevoeging van de buffer aan de gedroogde filmlaag van lipiden.
    7. Voer vijf vries/dooi cycli uit door de monster flacon afwisselend te plaatsen tussen een ijswater (4 °C of lager) en een warmwaterbad (25 °C of hoger).
    8. Plaats de monster flacon in het ultrasone bad en sonificeren het monster voor ongeveer 0,5 uur of totdat het monster semi-doorzichtig wordt.
    9. Extrude de monsters met behulp van de lipide-extruderset. Monteer de extrusieset zoals aangegeven in de instructies van de fabrikant. Extrude de monsters met behulp van 0,1 μm filtreerpapier. Laad de monsters in één glazen spuit en bevestig deze aan één uiteinde van het extrusieapparaat. Voeg een lege spuit aan de andere kant van het extrusieapparaat toe. Duw heen en weer 10 – 20x totdat uw monsters volledig transparant worden.
    10. Draai de eindmonsters gedurende 30 minuten op 20.000 x g om grote aggregaten te verwijderen.
    11. Gebruik dynamische lichtverstrooiing (DLS) om de grootte en homogeniteit van de liposomen te bepalen (optioneel). Plaats 30 μL van de liposomen in een 384 goed plaat lezer. Draai de plaat op 1.000 x g gedurende 30 min. plaats de plaat in een plaat lezer en verzamel 10 lichtverstrooiings metingen.
  2. Karaktereren van KRAS4b-FMe binding aan liposomen via Plasmon-resonantie (SPR)
    1. Monteer de benodigde materialen: een SPR-instrument; sensor chip L1; 7 x 14 mm flacon buizen; en CHAPS.
    2. Bereid een buffer met 20 mM HEPES (pH = 7,3), 150 mM NaCl, 1 mM TCEP. Maak een 2:1 verdunningsreeks van KRAS4b-FMe van 60 μM-0,06 μM in een totaal volume van 200 μL (totaal 10 titraties). Breng de laatste verdunde monsters in de buisjes van de flacon (Zie tabel met materialen), plaats de buisjes van de flacon in een rek en steek de monsters in het SPR-instrument.
    3. Plaats de L1 sensor chip in het SPR-instrument. Bevestig de buffer en de prime het systeem met buffer voor 7 min.
    4. Stel een automatische methode als volgt in:
      1. Stel de instrument temperatuur in op 25 °C.
      2. Activeer de sensor chip L1 door deze af te spoelen met twee 1 min injecties van 20 mM CHAPS opgelost in water bij een debiet van 30 μL/min.
      3. Voer opstart cycli uit van tien 1 min injecties met een lopende buffer om het spaan oppervlak te hydrateren.
        1. Stort de liposomen op de sensor chip L1 door de liposomen op de stroomcel (FC)-2 van de L1-chip te injecteren met 2 minuten injecties bij 5 μL/min. Streef naar een opname niveau van ten minste ~ 3.000 Response-eenheden (RUs).
          Opmerking: Verhoog de injectie tijd totdat u het juiste opname niveau bereikt.
      4. Injecteer drie cycli buffer over zowel FC-1 als FC-2 met 1 min injecties bij 30 μL/min.
        1. Injecteer de verschillende KRAS4b-FMe titraties van de laagste naar de hoogste concentratie serie. Injecteer de eiwitten met 1 min injecties voor de associatie fase en 2 min injecties voor de dissociatie fase bij 30 μL/min debiet over beide Fc's.
        2. Regenereert de sensor chip L1 door deze te spoelen met twee 1 min injecties van 20 mM CHAPS bij 30 μL/min.
    5. De gegevens met behulp van de SPR-evaluatiesoftware met behulp van een enkele Sitebinding model voor het verkrijgen van duidelijke bindende affiniteiten (Zie de sectie discussie voor een uitleg van de gegevens aanpassing).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Een van de grootste variabelen in het protocol is de hoeveelheid uitgedrukt doel proteïne (His6-MBP-TeV-KRAS4b). Dit protocol werd ontwikkeld met behulp van een isolaat uit een Trichoplusia ni cellijn, TNI-FNL17, aangepast voor de groei van de suspensie en gespeende uit serum. Gezien het brede scala van resultaten gerapporteerd over de verschillende insecten cellijnen met de Baculovirus expressie systeem, is het raadzaam dat TNI-FNL worden gebruikt, althans aanvankelijk, om KRAS4b-FMe gep...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Zoals opgemerkt in de representatieve resultaten sectie, de meest kritieke stap tijdens de zuivering is de behandeling van het monster gedurende de tijd dat het in lager zout. Het beperken van de tijd dat het monster wordt blootgesteld aan minder dan 200 mM NaCl zal helpen verminderen neerslag en verhoging van de monster opbrengst. Interpretatie van de resultaten van de CEX kan moeilijk zijn als het profiel niet overeenkomt met de verwachtingen (Zie Figuur 2). Totdat het protocol routine is ...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

We erkennen het klonen en expressie steun van Carissa Grose, Jen Melhalko, en Matt Drew in het proteïne Expression laboratorium, Frederick National Laboratory voor kankeronderzoek. Dit project is geheel of gedeeltelijk gefinancierd met federale fondsen van het nationaal kanker instituut, National Institutes of Health, onder contract nr. HHSN261200800001E. De inhoud van deze publicatie weerspiegelt niet noodzakelijkerwijs de standpunten of het beleid van het Department of Health and Human Services, noch vermeldt handelsnamen, commerciële producten of organisaties goedkeuring door de Amerikaanse overheid

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
1.8 mL Safe-Lock Tubes, NaturalEppendorf22363204
11 mm Cl SS Interlocked Insert Autosampler VialsThermo Scientific30211SS-1232
1-palmitoyl-2-oleoyl-glycero-3-phosphocholine (POPC)AVANTI POLAR LIPIDS850457aanschaffen als vloeibare voorraad in chloroform
1-palmitoyl-2-oleoyl-glycero-3-phospho-L-serine (POPS)AVANTI POLAR LIPIDS840034aanschaffen als vloeibare voorraad in chloroform
5427R CentrifugeEppendorf
Acetonitrile, HPLC GradeFisher ChemicalA998-1 1L
Ammonium AcetateSigma-Aldrich09689-250g
Argon gasAirgasARUP
Assay Plate 384CORNING3544
Biacore T200 InstrumentGE Healthcare
Blue Snap-It Seals, T/SThermo ScientificC4011-54B
Branson Ultrasonic BathThermo Fisher15-336-1000
Cation Exchange Chromatography (CEX) columnGE Healthcare Life Sciences29018183HiPrep SP Sepharose High Performance
CHAPSSigmaC3023
Dyna Pro Plate ReaderWyatt Technologies
Exactive Plus EMR Mass SpectrometerThermo Scientific
Formic AcidSigma-AldrichF0507-500MlGebruik Reagent Grade of beter
Gilson vials 7x14 mm TubesGE HealthcareBR-1002-12
Glass screw thread vials with PTFE foam linersScientific SpecialitiesB69302
High speed/benchtop centrifugeThermo Fischer Scientific05-112-114Din staat tot maximaal 4.000 xg
His6-Tobacco Etch Virus (TEV) proteaseAddgene92414Gezuiverd volgens Raran-Kurussi et al. (2017) Verwijdering van affiniteitstags met TEV-protease. In: Burgess-Brown N. (red.) Heterologous Gene Expression in E.coli. Methods in Molecular Biology, vol 1586. Humana Press, New York, NY
Immobilized Metal Affinity Chromatography (IMAC) columnGE Healthcare Life Sciences28-9365-51HisPrep FF 16/10
In-House Water Supply, Arium AdvanceSartorius StedimWeerstand van 18 MΩ0-cm
Lipid extruder set with holderAVANTI POLAR LIPIDS610023
Liquid nitrogenAirgasNI-DEWAR
M110-EH microfluidizerMicrofluidics
MabPac RP UHPLC Column, 4 um, 3.0 x 50 mmThermo Scientific088645
MabPac SEC-1 Column, 5 um, 300 Å, 2.1 x 150 mmThermo Scientific088790
MagTran softwareThermo Scientific
Methanol, HPLC GradeVWR ChemicalsBDH20864.400
NGC Chromatography SystemBioRad78880002NGC QuestTM 100 Chromatography system
Protease Inhibitor Cocktail without EDTA or other chelatorsMillipore SigmaP8849
Rubber Caps type 3GE HealthcareBR-1005-02
Series S Sensor Chip L1GE Healthcare29104993
SpectrophotometerThermo Fischer Scientific13-400-519Absorptie bij 280nm
Ultra-15 Centrifugal Filter Units, 10K NMWLMillipore SigmaUFC901008PES membraan
Ultracel 10K MWCO Ultra 0.5 mL Centrifuge FiltersAmiconUFC501024
UltracentrifugeBeckman CoulterOptima - L80Kin staat tot 100.000 xg
Vanquish UHPLC (Pump, Column Hearter, and LC System)Thermo Scientific
Vortex Genie 2Fisher12-812
Water, HPLC GradeSigma-Aldrich270733-1LMag gebruik maken van de waterbron van het bedrijf (zie hieronder)
Whatman GD/XP PES 0.45 mm syringe filterGE Healthcare - Whatman6994-2504
Xcalibur QualBrowserThermo Scientificproteomics software

Referenties

  1. Cox, A. D., Der, C. J. Protein prenylation: more than just glue. Current Opinion in Cell Biology. 4 (6), 1008-1016 (1992).
  2. Zhang, F. L., Casey, P. J. Protein Prenylation: Molecular Mechanisms and Functional Consequences. Annual Review of Biochemistry. 65, 241-269 (1996).
  3. Hottman, D. A., Li, L. Protein prenylation and synaptic plasticity: implications for Alzheimer's disease. Molecular Neurobiology. 50 (1), 177-185 (2014).
  4. Hottman, D. A., Chernick, D., Cheng, S., Wang, Z., Li, L. HDL and cognition in neurodegenerative disorders. Neurobiology of Disease. 72, Pt A 22-36 (2014).
  5. Nakagami, H., Jensen, K. S., Liao, J. K. A novel pleiotropic effect of statins: prevention of cardiac hypertrophy by cholesterol-independent mechanisms. Annals of Medicine. 35 (6), 398-403 (2003).
  6. Kohnke, M., et al. Rab GTPase prenylation hierarchy and its potential role in choroideremia disease. PLoS One. 8 (12), 81758(2013).
  7. Berndt, N., Hamilton, A. D., Sebti, S. M. Targeting protein prenylation for cancer therapy. Nature Reviews Cancer. 11 (11), 775-791 (2011).
  8. Kho, Y., et al. A tagging-via-substrate technology for detection and proteomics of farnesylated proteins. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (34), 12479-12484 (2004).
  9. Armstrong, S. A., Hannah, V. C., Goldstein, J. L., Brown, M. S. CAAX geranylgeranyl transferase transfers farnesyl as efficiently as geranylgeranyl to RhoB. Journal of Biological Chemistry. 270 (14), 7864-7868 (1995).
  10. Stephen, A. G., Esposito, D., Bagni, R. K., McCormick, F. Dragging ras back in the ring. Cancer Cell. 25 (3), 272-281 (2014).
  11. Denisov, I. G., Sligar, S. G. Nanodiscs in Membrane Biochemistry and Biophysics. Chemical Reviews. 117 (6), 4669-4713 (2017).
  12. Bao, H., Duong, F., Chan, C. S. A Step-by-step Method for the Reconstitution of an ABC Transporter into Nanodisc Lipid Particles. Journal of Visualized Experiments. (66), e3910(2012).
  13. Dementiev, A. K-Ras4B lipoprotein synthesis: biochemical characterization, functional properties, and dimer formation. Protein Expression and Purification. 84 (1), 86-93 (2012).
  14. Lowe, P. N., et al. Characterization of recombinant human Kirsten-ras (4B) p21 produced at high levels in Escherichia coli and insect baculovirus expression systems. Journal of Biological Chemistry. 266 (3), 1672-1678 (1991).
  15. Gillette, W., et al. Production of Farnesylated and Methylated Proteins in an Engineered Insect Cell System. Methods in Molecular Biology. 2009, 259-277 (2019).
  16. Agamasu, C., et al. KRAS Prenylation Is Required for Bivalent Binding with Calmodulin in a Nucleotide-Independent Manner. Biophysical Journal. 116 (6), 1049-1063 (2019).
  17. Talsania, K., et al. Genome Assembly and Annotation of the Trichoplusia ni Tni-FNL Insect Cell Line Enabled by Long-Read Technologies. Genes. 10 (2), 79(2019).
  18. Spencer-Smith, R., et al. Inhibition of RAS function through targeting an allosteric regulatory site. Nature Chemical Biology. 13 (1), 62-68 (2016).
  19. Lowe, P. N., et al. Expression of polyisoprenylated Ras proteins in the insect/baculovirus system. Biochemical Society Transactions. 20 (2), 484-487 (1992).
  20. Dharmaiaha, S., et al. Structural basis of recognition of farnesylated and methylated KRAS4b by PDEδ. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (44), 6766-6775 (2016).
  21. Abdiche, Y. N., Myszka, D. G. Probing the mechanism of drug/Lipid membrane interactions using Biacore. Analytical Biochemistry. 328 (2), 233-243 (2004).
  22. Fisher, R. J., et al. Complex interactions of HIV-1 nucleocapsid protein with oligonucleotides. Nucleic Acids Research. 34 (2), 472-484 (2006).
  23. Lakshman, B., et al. Quantitative biophysical analysis defines key components modulating recruitment of the GTPase KRAS to the plasma membrane. Journal of Biological Chemistry. 294, 2193-2207 (2019).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Tags

KRAS4b-zuiveringfarnesylerend eiwitkationuitwisselingschromatografieintacte massaspectrometrieoppervlakteplasmonresonantiebaculovirus-expressieliposoombindingsassayproteïnedialyseIMAC-chromatografienucleotidebindingsanalyse
Volledig verwerkte recombinant KRAS4b: isoleren en karakteriseren van het Farnesylated en gemethyleerd eiwit
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan de bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleidsoverzicht

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.