We beschrijven een methode voor het retrograde traceren van de Drosophila embryonale motorneuronen met behulp van lipofiele fluorescerende kleurstoffen.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Retrograde tracing van Drosophila embryonale motor neuronen met behulp van lipofiele fluorescerende kleurstoffen
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
We beschrijven een techniek voor het retrograde labelen van motorneuronen in Drosophila. We gebruiken een olie-opgeloste lipofiele kleurstof en leveren een kleine druppel aan een embryonale filet preparaat door een micro injector. Elke motor neuron wiens membraan wordt benaderd door de druppel kan vervolgens snel worden gelabeld. Individuele motorneuronen worden voortdurend gelabeld, waardoor fijne structurele details duidelijk kunnen worden gevisualiseerd. Gezien het feit dat lipofiele kleurstoffen komen in verschillende kleuren, de techniek biedt ook een middel om aangrenzende neuronen gelabeld in Multicolor. Deze traceer techniek is daarom nuttig voor het bestuderen van neuronale morfogenese en synaptische connectiviteit in het motorische neuron systeem van Drosophila.
Inleiding
Het embryonale motorische neuron systeem van Drosophila biedt een krachtig experimenteel model om de onderliggende mechanismen van de ontwikkeling van het centrale zenuwstelsel (CNS)1,2,3te analyseren. Het motorische neuron systeem is vatbaar voor biochemische, genetische, beeldvormende en elektrofysiologische technieken. Met behulp van de technieken kunnen genetische manipulaties en functionele analyses worden uitgevoerd op het niveau van de enkelvoudige motorneuronen2,4,5,6.
Tijdens de vroege ontwikkeling van het zenuwstelsel verdelen en genereren neuro blasten een groot aantal gli's en neuronen. De spatiotemporele relatie tussen de delaminatie en het genexpressie profiel van neuroblasten is eerder onderzocht in detail7,8,9. In het geval van het motorische neuron systeem is de vorming van embryonale neuromusculaire junctie (nmj) uitgebreid bestudeerd met behulp van de aCC (anterieure hoekcel), RP2 (RAW garnalen 2) en RP5 motorneuronen2,10. Bijvoorbeeld, wanneer de RP5 motor neuron vormt een ontluikende synaptische kruising, de vooraf synaptische en post-synaptische filopodia worden vermengd11,12,13. Dergelijke directe cellulaire communicatie is van vitaal belang voor het initiëren van de NMJ-formatie. In tegenstelling tot wat we weten over de perifere zenuw takken, onze kennis van hoe motor dendrites initiëren synaptische connectiviteit binnen het CZS is nog steeds primitief.
In dit rapport presenteren we een techniek die retrograde labeling van motorneuronen in embryo's mogelijk maakt door middel van micropipet-gemedieerde levering van lipofiele kleurstoffen. Deze techniek stelt ons in staat om de 38 motorneuronen te traceren die elk van de 30 lichaamsspieren in een Hemi-segment innervating op 15 h na het ei leggen (AEL)14. Door gebruik te maken van deze techniek heeft onze groep een grondige onderzoek uitgevoerd naar talrijke gain-of-functie/verlies-van-functie allelen15,16,17. We hebben onlangs de moleculaire mechanismen ontrafeld die de initiatie van de motorische dendriet-connectiviteit aandrijden en aangetoond dat een Dscam1-Dock-pak interactie de plaats van dendriet-uitgroei definieert in de aCC motor neuron17. Over het algemeen is deze techniek aanpasbaar voor de fenotypische analyse van embryonale motorneuronen in wild type-of Mutante stammen, wat ons vermogen om nieuwe inzichten in het functionele ontwerp van het zenuwstelsel van Drosophila te bieden verbetert.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
1. uitrusting en benodigdheden
- Materialen voor het verzamelen van embryo's en het trainen van volwassenen om eieren te leggen
- Bereid het filtratie apparaat door een buis van 50 mL te verbreken en snijd een gat in de dop open om een mesh filter met poriën van 100 μm (Inhoudsopgave) tussen de buis en de dop te zetten.
Opmerking: als alternatief kunnen celstrainers met poriën van 100 μm (Inhoudsopgave) worden gebruikt voor de filtratie stap van de embryo verzameling. - Maak agar-platen met Grape agar premix (tabel met materialen) volgens de vermelde instructies. Roer in het kort 1 pakje poeder mengsel zachtjes in 500 mL kamertemperatuur (RT, 23 °C) dH2O en meng het opgeloste mengsel tot een krachtige kook. Na afkoelen tot 70 − 75 °C, giet het mengsel in Petri schaaltjes (60 mm). Nadat de agar is gestijgd, bewaar de platen bij 4 °C.
- Bereid gist pasta door het mengen van actieve droge gist (tafel van de materialen) en water tot een pasta consistentie, en bewaren bij 4 °c.
- Gebruik Eier opvang kooien (voor 60 mm Petri schaaltje, tafel van materialen) die voldoende luchtstroom bieden.
- Bereid het filtratie apparaat door een buis van 50 mL te verbreken en snijd een gat in de dop open om een mesh filter met poriën van 100 μm (Inhoudsopgave) tussen de buis en de dop te zetten.
- Bereiding van dissectie naalden en kleurstof injectie micropipetten
- Bereid kleurstof injectie micropipet en dissectie naald van dezelfde capillaire slang met een inwendige diameter van 0,6 mm en een buitendiameter van 1,2 mm (tabel met materialen). Trek de capillaire slang met een micro pipet trekker op 7% van 170 V maximale output (tabel van de materialen) om een scherpe naald met een taper van ~ 0,4 cm in lengte te creëren.
- Voor de injectie met kleurstof past u de micro pipet aan met een micro pipet-afgescheelde (tabel met materialen) met een in het handboek van het instrument beschreven Bubble-afschuining.
- Kortom, week de molen met een bevochtigingsmiddel (tafel van materialen) om te voorkomen dat het water de naaldpunt ' sleept '. Plaats de naald op de pipet klem op 25 − 30 ° en verlaag de punt op twee derde van de straal uit het midden van het schuine oppervlak. Slijp de naald terwijl een spuit met slangen lucht in de naald duwt, om ervoor te zorgen dat de micro pipet helder is van glas spaanders.
- Markeer de micro pipet met een permanente markering met fijne punt om de positie van de opening aan de punt aan te geven na het afwerken, omdat het lastig is om de smalle opening van de micro pipet die onder een hoek wordt gevormd, te lokaliseren.
2. voorbereiding van de embryo winning
- Zorg ervoor dat de volwassen vliegen (20 − 40 wild-type Canton-S of witte vliegen), mannetjes en vrouwtjes, worden gehouden in jonge (< 7 dagen) en gezonde omstandigheden voor de ideale Eier collectie.
Let op: om het leggen van eieren te stimuleren, worden vliegen een paar dagen voorafgaand aan de Eier collectie op agar-platen met gist pasta ten minste eenmaal per dag getraind in hun Eier opvang kooi.
3. embryonale enscenering
- Laat de vliegen om eieren te leggen 's nachts (of ten minste 15 h) bij RT om de embryo's te verzamelen op 15 h AEL, d.w.z. fase 1618, om dendritogenese van de ACC en RP3 motorneuronen te bekijken. In de ochtend, verzamelen van de plaat met de eieren.
NB: de embryo's van 15 h AEL hebben een aparte 4-kamer darm18. Voorbeeld vorming verschillende stadia volgen hun specifieke morfologische criteria en verouderings voorwaarden. - Voor het verzamelen van de embryo's, dechorionate de eieren gelegd op de plaat met 50% bleekwater gedurende 5 minuten.
- Giet, zodra de chorions zijn gewist, de inhoud van de plaat door het filtratie apparaat of de celzeef om de embryo's te isoleren. Verdun met een knijp fles water het bleekmiddel op de plaat en verzamel zo veel mogelijk embryo's door het mengsel in het filter te decanteren.
- Was de embryo's op het filter 3 − 4x met meer water of totdat de bleek geur verdwijnt. Verwijder het filter uit het apparaat en was de embryo's op een andere schone plaat met water. Giet het water uit de nieuwe plaat waar de embryo's op staan.
- Bereid een glazen glijbaan door het te bedekken met twee lagen vinyl tape in het midden, die een rechthoek vormen. Knip een rechthoekige pool uit de tape met behulp van een scheermesje. Plaats een dunne strook dubbelzijdige tape naar het bovenste uiteinde van het zwembad, dit is waar de embryo's worden geplaatst zoals afgebeeld in Figuur 1.
- Gebruik fijn Tang, selecteer individueel 5 − 10 embryo's bij 15 h AEL en plaats ze op de dubbelzijdige tape met de rugzijde naar boven gericht. Voeg insectener's Saline19 toe aan de dissectie pool om de embryo's te beschermen tegen uitdroging (Figuur 1).
4. dissectie en kleuring
- Met behulp van een glazen naald onder een ontleed Microscoop (tabel van de materialen), snijd door de middellijn van een enkel embryo aan het oppervlak van zijn posterieure naar zijn voorste uiteinde. Vervolgens sleept u het embryo uit het vitelline membraan van de tape naar het glas (boxed in Figuur 1). Zorg dat u de inwendige weefsels van het embryo niet beschadigt.
- Draai de epitheliale weefsels uit het midden en bevestig de epidermale rand op het oppervlak van de glazen glijbaan (Figuur 1, inzet).
- Gebruik een buis-aangesloten naald met een tip opening van ~ 300 μm (bereid door het breken van de dunne punt van een dissectie naald), aspiraat of blaaslucht te ontkoppelen en verwijderen van de ruglangstracheale stammen evenals eventuele overgebleven darmen.
- Gebruik 4% Paraformaldehyde (PFA) in fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) om de embryo's 5 minuten op RT te fixeren. was de embryo's 3x met PBS.
- Beits de embryo's met 1 μL anti-mierikswortelperoxidase antilichaam, geconjugeerd met cyanine 3 kleurstof (anti-HRP Cy3) (tabel met materialen) in 200 μL PBS gedurende 1 uur. was de embryo's na KLEURING met PBS 3x.
Opmerking: de kleurstof van anti-HRP kan worden gewijzigd op basis van de lipofiele kleurstoffen van keuze voor injectie.
5. vullen van de injectie micropipet
- Warmte lipofiele kleurstoffen (5 mg/mL DiO of DiD, tabel van de materialen) tot 60 °c in een 1:10 mengsel van ethanol: plantaardige olie voor gebruik.
- Bereid een olie-opgeloste kleurstof glijbaan voor de injectie micropipet. Plaats de micro pipet in de capillaire houder (Figuur 2, #1). Stel met behulp van de micro manipulator (tabel met materialen) de micro pipet in op de kleurstof glijbaan. Pas vervolgens het werkgebied aan om de micro pipet op de kleurstof te plaatsen (afbeelding 2, #2).
- Gebruik voor het vullen van de micro pipet een micro injector (tabel met materialen) (afbeelding 2, #3). Verzamel de kleurstof in de micro pipet door de Pi (injectiedruk) in te stellen tussen 200 − 500 hpa (hectopascal), de Ti (injectie tijd) tussen 0,1 − 0,5 s en Pc (compensatie druk) tot 0 hpa gedurende 5 min (Figuur 2, #4).
- Zodra de kleurstof is verzameld, verwijdert u de kleurstof glijbaan en plaatst u het monster op de Microscoop-fase. Verhoog vervolgens de Pc tot een bereik van 20 − 60 hpa voordat u de micropipet in het monster verlaagt om besmetting van PBS door capillaire werking te voorkomen.
6. kleurstof injectie in neuronen
- Zoek het embryo in het midden met behulp van de microscoop met 10x objectief objectief (tabel met materialen) en lijn de micro Pipet uit met het embryo.
Opmerking: de grootte van de kleurstof druppel kan worden aangepast door de Pi of de grootte van de opening van de micropipet punt te wijzigen. De druppel moet 10 − 20 μm zijn, wat ongeveer de breedte van 1 spier is. - Verander de objectief lens in een water onderdompeling 40x lens (tabel met materialen) en dompel de lens in PBS om het embryo te zien.
- Gebruik fluorescentiemicroscopie om de neuronale morfologie gemarkeerd door anti-HRP Cy3 te controleren en de injectieplaats te bepalen.
- Gebruik tijdens de injectie brightfield microscopie om de kleurstof druppel te zien. Wanneer het embryo scherp is, verander dan de positie van de micropipet om voorzichtig contact te maken met de punt van de axon van belang (bijv. aCC, RP3).
- Druppel de kleurstof in een rechter buik (a2 − A6) Hemi-segment op het neuromusculaire knooppunt van aCC of RP3 (Figuur 3) met ofwel DiD of DiO, met behulp van de neuronen gekenmerkt door anti-HRP Cy3. Met de handbediening (muis; Figuur 2, 5) laat de kleurstof los en verwijder de micro pipet na het neerzetten van de kleurstof met de micro manipulator en ga naar de volgende injectieplaats.
Opmerking: in tegenstelling tot andere kleurstoffen (bijv., Lucifer geel, calcein) die zich in naburige cellen verspreiden door middel van tussenruimte kruisingen, lipofiele kleurstoffen associëren met celmembranen en niet overdragen aan de buren. Vanwege de relatief grote omvang van de kleurstof druppel, leidt deze techniek echter ook tot het labelen van de samenwerking spieren (Figuur 3A).
- Inincuberen van het monster bij RT voor 1 h na kleurstof-druppel vóór beeldvorming.
Opmerking: het protocol kan hier worden onderbroken voor montage en het monster kan 's nachts bij 4 °C worden bewaard. Lipofiele kleurstoffen kunnen ook worden geleverd met behulp van Iontoforese, als een intracellulaire direct-gekoppelde (DC) versterker direct beschikbaar is20.
7. beeldvorming met een confocale Microscoop
- Verwijder de dubbelzijdige tape en vinyl tape van de glazen glijbaan met behulp van een tang.
- Maak een afdekkap (22 x 22 mm2 No. 1 afdekglas) met een kleine hoeveelheid vacuüm vet (tabel van de materialen) op de vier hoeken en zorgvuldig plaats op het monster, het vermijden van luchtbellen. Verwijder eventuele overtollige PBS met behulp van taak wissers.
- Duw de Afdekstrook omlaag om de werkafstand tussen de objectief lens en het monster aan te passen. Sluit de randen van de Afdekstrook volledig af met nagellak.
- Beeld bij 10x en 100x vergroting met behulp van een confocale Microscoop.
- Gebruik ImageJ-software voor het verwerken van RAW-beelden van de Microscoop (tabel met materialen).
Opmerking: observatie moet beginnen binnen 10 min na montage voor de beste beelden. Anders zal de kleurstof bij RT zich verspreiden naar plaatsen naast de injectieplaats die een ongewenste achtergrond voorbeeld vorming creëren. Om de diffusie van de kleurstof te vertragen, kan het monster een paar uur bij 4 °C worden bewaard.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Een representatief beeld van de aCC en RP3 motorneuronen wordt getoond in Figuur 3C om de Multicolor labeling van motorneuronen bij 15 h AEL aan te tonen. Hun dendritische morfologieën zijn grotendeels invariant tussen embryo's. Het kleurings patroon dat is verkregen met anti-HRP-antilichaam wordt grijs weergegeven. Een kleine druppeltje van DiO of deed werd afgezet op de NMJ van spier 1 of 6/7, respectievelijk. Figuur 4 toont het vermogen om he...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Het gebruik van kleurstof labeling voor het bestuderen van neuronale morfologie heeft verschillende voordelen ten opzichte van genetische cel-labeling technieken. De kleurstof etiketterings techniek kan de hoeveelheid tijd die nodig is voor het labelen en beeldvorming van de morfologieën van motorische neuronen minimaliseren. De kleurstof labeling proces is vrij snel als het duurt minder dan 2 h en stelt ons in staat om de omtrek van neuronale projecties definiëren. Als alternatief kan men de aCC motor neuron visualisere...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs hebben niets te onthullen.
Dankbetuigingen
Wij danken de leden van het Kamiyama Lab voor hun commentaar op het manuscript. Dit werk werd ondersteund door een NIH R01 NS107558 (naar M.I., K.B., en D.K.).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| 10x objectieflens | Nikon | Plan | |
| 40x water-immersielens | Nikon | NIR Apo | |
| Capillaire buis | Frederick Haer&Co | 27-31-1 | |
| Confocale microscoop | Andor | N/A | Dragonfly Spinning disk confocal unit |
| Dekglas | Corning | 22x22 mm Vierkant #1 | |
| DiD | ThermoFisher | V22886 | |
| DiI | ThermoFisher | V22888 | |
| DiO | ThermoFisher | V22887 | |
| Dissectiemicroscoop | Nikon | N/A | SMZ-U |
| Dubbelzijdig plakband | Scotch | 665 | |
| Dow Corning High-Vacuum Grease | Fisher Sci. | 14-635-5D | |
| Dumont #5 Pincet | Fine Science Tools | 11252-20 | |
| Eicollecage | FlyStuff | 59-100 | |
| FemtoJet 5247 | Eppendorf | discontinued | FemtoJet 4i (Cat No. 5252000021) |
| ImageJ | NIH | Beeldverwerkingssoftware | |
| Micromanipulator | Sutter | MP-225 | |
| Micropipetbeveler | Sutter | BV-10-B | |
| Naaldtrekker | Narishige | PC-100 | |
| Nutri-Fly Druiven Agar Poeder Premix Pakketten | FlyStuff | 47-102 | |
| Nylon Netfilter | Millipore | ||
| Paraformaldehyde 16% Oplossing, EM-kwaliteit | Electron Microscopy Sciences | 15710 | Alle EM-kwaliteiten |
| PBS | Roche | 11666789001 | Verkocht op sigmaaldrich, verpakt in dozen van 10x oplossing |
| Photo-Flo 200 | Kodak | 146 4510 | Bevochtigingsmiddel |
| Staande fluorescentiemicroscoop | Nikon | N/A | Eclipse Ci met een LED-lichtbron |
| Vinyl Elektrotape | Scotch | 6143 | |
| VWR Cell Strainers | VWR | 10199-659 | |
| Gist | FlyStuff | 62-103 | Actieve drooggist (RED STAR) |
Referenties
- Arzan Zarin, A., Labrador, J. P. Motor axon guidance in Drosophila. Seminars in Cell and Developmental Biology. 85, 36-47 (2019).
- Nose, A. Generation of neuromuscular specificity in Drosophila: novel mechanisms revealed by new technologies. Frontiers in Molecular Neuroscience. 5, 62(2012).
- Kim, M. D., Wen, Y., Jan, Y. N. Patterning and organization of motor neuron dendrites in the Drosophila larva. Developmental Biology. 336 (2), 213-221 (2009).
- Manning, L., et al. A resource for manipulating gene expression and analyzing cis-regulatory modules in the Drosophila CNS. Cell Reports. 2 (4), 1002-1013 (2012).
- Featherstone, D. E., Chen, K., Broadie, K. Harvesting and preparing Drosophila embryos for electrophysiological recording and other procedures. Journal of Visualized Experiments. (27), e1347(2009).
- Chen, K., Featherstone, D. E., Broadie, K. Electrophysiological recording in the Drosophila embryo. Journal of Visualized Experiments. (27), e1348(2009).
- Doe, C. Q. Temporal Patterning in the Drosophila CNS. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 33, 219-240 (2017).
- Homem, C. C., Knoblich, J. A. Drosophila neuroblasts: a model for stem cell biology. Development. 139 (23), 4297-4310 (2012).
- Urbach, R., Technau, G. M. Neuroblast formation and patterning during early brain development in Drosophila. Bioessays. 26 (7), 739-751 (2004).
- Carrero-Martínez, F. A., Chiba, A. Cell Adhesion Molecules at the Drosophila Neuromuscular Junction. The Sticky Synapse: Cell Adhesion Molecules and Their Role in Synapse Formation and Maintenance. Umemori, H., Hortsch, M. , Springer. New York. 11-37 (2009).
- Ritzenthaler, S., Suzuki, E., Chiba, A. Postsynaptic filopodia in muscle cells interact with innervating motoneuron axons. Nature Neuroscience. 3 (10), 1012-1017 (2000).
- Kohsaka, H., Takasu, E., Nose, A. In vivo induction of postsynaptic molecular assembly by the cell adhesion molecule Fasciclin2. Journal of Cell Biology. 179 (6), 1289-1300 (2007).
- Kohsaka, H., Nose, A. Target recognition at the tips of postsynaptic filopodia: accumulation and function of Capricious. Development. 136 (7), 1127-1135 (2009).
- Landgraf, M., Bossing, T., Technau, G. M., Bate, M. The origin, location, and projections of the embryonic abdominal motorneurons of Drosophila. Journal of Neuroscience. 17 (24), 9642-9655 (1997).
- Kamiyama, D., Chiba, A. Endogenous activation patterns of Cdc42 GTPase within Drosophila embryos. Science. 324 (5932), 1338-1340 (2009).
- Furrer, M. P., Vasenkova, I., Kamiyama, D., Rosado, Y., Chiba, A. Slit and Robo control the development of dendrites in Drosophila CNS. Development. 134 (21), 3795-3804 (2007).
- Kamiyama, D., et al. Specification of Dendritogenesis Site in Drosophila aCC Motoneuron by Membrane Enrichment of Pak1 through Dscam1. Developmental Cell. 35 (1), 93-106 (2015).
- Campos-Ortega, J. A., Hartenstein, V. The embryonic development of Drosophila melanogaster. , Springer-Verlag. Berlin, Germany. (1985).
- Drosophila Ringer's solution. Cold Spring Harbor Protocols. 2007 (4), (2007).
- Rickert, C., Kunz, T., Harris, K. -L., Whitington, P., Technau, G. Labeling of single cells in the central nervous system of Drosophila melanogaster. Journal of Visualized Experiments. (73), e50150(2013).
- Fujioka, M., et al. Even-skipped, acting as a repressor, regulates axonal projections in Drosophila. Development. 130 (22), 5385-5400 (2003).
- Sink, H., Rehm, E. J., Richstone, L., Bulls, Y. M., Goodman, C. S. sidestep encodes a target-derived attractant essential for motor axon guidance in Drosophila. Cell. 105 (1), 57-67 (2001).
- Furrer, M. P., Kim, S., Wolf, B., Chiba, A. Robo and Frazzled/DCC mediate dendritic guidance at the CNS midline. Nature Neuroscience. 6 (3), 223-230 (2003).
- Landgraf, M., Jeffrey, V., Fujioka, M., Jaynes, J. B., Bate, M. Embryonic origins of a motor system: motor dendrites form a myotopic map in Drosophila. PLoS Biology. 1 (2), 41(2003).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
