Methodenartikel

Verduidelijken en beeldvorming Candida albicans Biofilms

20K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/60718

⸱

6 maart 2020

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Biological Sciences, Carnegie Mellon University, 2Department of Pharmacology, Second Military Medical University

In dit artikel

Samenvatting

Om de interne kenmerken van Candida albicans biofilms te bekijken en te kwantificeren, bereiden we vaste intacte exemplaren voor die worden verduidelijkt door refractieve indexmatching. Vervolgens kan optische sectioning microscopie worden gebruikt om driedimensionale beeldgegevens te verkrijgen, hoewel de volledige dikte van de biofilm.

Samenvatting

De microbiële schimmel Candida albicans kan een verandering ondergaan van evenredige kolonisatie naar virulentie die sterk is gecorreleerd met zijn vermogen om over te schakelen van gist-vorm groei naar hyphal groei. Cellen die dit proces initiëren, worden zowel aan- als aan elkaar verbonden, met als gevolg de ontwikkeling van een biofilmkolonie. Dit komt vaak niet alleen voor op slijmvliesweefseloppervlakken bij schimmelinfecties, maar ook op medische implantaten zoals katheters. Het is algemeen bekend dat biofilmcellen resistent zijn tegen schimmeldodende geneesmiddelen, en dat cellen die uit de biofilm worden vergoten, kunnen leiden tot gevaarlijke systemische infecties. Biofilms variëren van zwaar doorschijnend tot ondoorzichtig als gevolg van refractieve heterogeniteit. Daarom zijn schimmelbiofilms moeilijk te bestuderen door optische microscopie. Om interne structurele, cellulaire en subcellulaire functies te visualiseren, verduidelijken we vaste intacte biofilms door stapsgewijze oplosmiddeluitwisseling tot een punt van optimale brekingsindexmatching. Voor C. albicans biofilms wordt voldoende duidelijkheid bereikt met methylsalicylaat (n = 1.537) om confocale microscopie van top tot basis mogelijk te maken in biofilms van 600 μm met weinig demping. In dit visualisatieprotocol schetsen we fasecontrastrefractometrie, de groei van laboratoriumbiofilms, fixatie, kleuring, oplosmiddeluitwisseling, de installatie voor confocale fluorescentiemicroscopie en representatieve resultaten.

Inleiding

Candida albicans is een microbiële schimmel die meestal commensal is bij de mens. Het is van fundamenteel belang voor biologen omdat het organisme meerdere morfologieën heeft. Bijvoorbeeld, in reactie op bepaalde milieusignalen of stressoren, gist-vorm ontluikende cellen zal overschakelen naar filamenteuze groei als septating ketens van zeer langwerpige cellen bekend als hyphae. De overgang is belangrijk als een voorbeeld van fenotypische expressie van een overgang tussen een eencellig en meercellig genexpressieprogramma. Ook C. albicans is van biomedisch belang omdat het organisme een bekende opportunistische ziekteverwekker is. Het is verantwoordelijk voor slijmvliesschimmelinfecties zoals spruw (orale candidiasis), urogenitale infecties, en een oorzaak van gevaarlijke invasieve of systemische infecties bij immunologisch verzwakte patiënten.

Het potentieel van dit organisme voor virulentie is nauw verbonden met zijn meervoudige morfotypes en andere aspecten van zijn genetische veelzijdigheid1,2,3,4. Kiembuisextensie, de eerste zichtbare fase van de overgang naar hyphalgroei, treedt met voldoende snelheid op om verzwolgen C. albicans cellen in staat te stellen uit phagocyten te breken en zo te ontsnappen aan een vroege fase van de cellulaire immuunrespons van de gastheer5. Bovendien wordt filamentatie voorafgegaan en gepaard gegaan met een grote toename van cel-cel-cel-en-cel-naar-oppervlakte hechting die te wijten is aan gereguleerde expressie van verschillende klassen van celwand eiwitten bekend als adhesinsen6,7,8,9. Onder een breed scala van omstandigheden resulteert de combinatie van therapietrouw en filamentatie in een dramatische verschuiving van planktonische, eencellige groei naar oppervlaktegerelateerde koloniale groei die een biofilm vormt. C. albicans biofilms kunnen ontwikkelen op gemeenschappelijke geïmplanteerde medische hulpmiddelen zoals veneuze katheters. Verspreide infecties kunnen het gevolg zijn wanneer dergelijke biofilms beginnen te bud off gist-vorm cellen en vergoten ze in circulerend bloed. Meerdere studies hebben aangetoond dat biofilmcellen beter bestand zijn tegen schimmeldodende geneesmiddelen dan planktoncellen10,11, wat deels te wijten kan zijn aan verlaagd metabolisme12. Bovendien kan de hoge algehele aanhankelijkheid van een biofilm de verankering bieden die nodig is voor een efficiënte invasieve groei van hyphae in gastheerweefsel1.

Optische verduidelijking van C. albicans biofilms door brekingsindex matching heeft een grote invloed gehad op ons vermogen om de structuur van deze microbiële gemeenschap te visualiseren en relaties tussen genexpressie en fenotype te ontdekken. Biofilms die in het laboratorium worden gekweekt op testoppervlakken onder vloeibaar kweekmedium gedurende 48 uur, verschijnen als een witachtige coating die dicht genoeg en dik genoeg is om ondoorzichtig te zijn (figuur 1). Daarom zijn veel interessante fenotypische kenmerken van de biofilm aan het zicht onttrokken. De 24 h wilde type biofilms geteeld in YPD, RPMI-1640, of Spider medium op 37 ° C bereik tot 300 μm dik, met 48 h biofilms vaak bereiken 500 μm. De dekking is te wijten aan lichtverstrooiing, die ontstaat door refractieve heterogeniteit: de schimmelcelwand is refractiever dan het omringende medium en het cytoplasma iets refractiever dan de celwand. De resulterende hoge optische dichtheid van een native biofilm verduistert alle structuren meer dan 30 μm diep wanneer bekeken met een conventionele microscoop of zelfs een confocale scanner (Figuur 2). Echter, een grote mate van verduidelijking kan worden bereikt door het infiltreren van vaste biofilms met een hoge brekingsindex vloeistof die ongeveer overeenkomt met de refractievan de grote cellulaire bestanddelen. Na verduidelijking kan beeldvorming bij submicron-resolutie worden uitgevoerd door confocale microscopie door de gehele dikte van bijna elke C. albicans biofilm13. In wilde type specimens, is het gemakkelijk om te zien dat biofilms bestaan uit lange verstrengelde hyphae, clusters van gekiemde gist-vorm cellen of pseudohyphal cellen, lege ruimten, en een bepaalde hoeveelheid extracellulaire matrix. Bovendien zijn biofilms over het algemeen gestratificeerd, met ruimtelijk variante morfologische verschillen in celtype, celdichtheid en de aanwezigheid van ontluikende of vertakkende cellen. Veel variaties in een of meer van deze kenmerken zijn waargenomen in biofilms ontwikkeld door mutant stammen14,15. Daarnaast tonen verslaggeversstammen in situ ruimtelijke verschillen in genexpressie16,9,13. De verrassende mate van verduidelijking verkrijgbaar met deze relatief eenvoudige en goedkope aanpak maakt het ook mogelijk om te zien dat veel biofilms apicalhyphae en basale invasieve hyphae uit te breiden tot millimeter afstanden.

In dit visualisatieprotocol demonstreren we de bevestiging, etikettering, verduidelijking en beeldvorming van een C. albicans biofilm met behulp van een eenvoudige celwandmarker als vlek. De oorsprong van de huidige versie van het protocol is de verbeterde helderheid die we waarnamen toen formaldehyde-vaste biofilms werden geïnfiltreerd met 97% glycol methacrylaat (GMA), die vervolgens werd gepolymeriseerd om de biofilm in te bedden in een hard plastic met een matig hoge brekingsindex (n = 1,49). Vervolgens hebben we conventionele fasecontrastmicroscopie en een reeks brekingsreferentievloeistoffen gebruikt om het contrastpunt (maximale transparantie) van de biofilm(figuur 3) nauwkeuriger te bepalen. Voor C. albicans biofilms gebeurde dit in de buurt van n = 1.530, wat verrassend hoog was gezien het feit dat een dichte eiwitstructuur zoals haarkeratine slechts iets refractiever is (1.54–1,55). Hoewel het aan de bovenkant van het optimale bereik in figuur 3,hebben we methylsalicylaat (olie van wintergroen, n = 1.537) in het huidige protocol, omdat het al lang gebruikt als een verhelderende agent voor microscopie in de embryologie en histologie, het heeft een lage toxiciteit en lage dampdruk, en het gaf uitstekende resultaten in onze proeven met behulp van matige-NA olie onderdompeling optica.

Hier moeten vier punten worden gemaakt:

(1) Op enkele uitzonderingen na is de ideale situatie in de microscopie dat de brekingsindex van het monster gelijk moet zijn aan de brekingsindex van de objectievelensonderdompelingsvloeistof 17,18,13. Voor driedimensionale (3D) beeldvormingsstudies waarbij diep scherpstellen noodzakelijk is, is dit altijd belangrijk.

(2) Ons experimenteel resultaat voor optimale clearing (n = 1.525–1.535) is iets hoger dan standaard onderdompelingsoliën (n = 1.515, 1.518) en schendt derhalve punt (1) en introduceert dus een bron van sferische aberratie bij het gebruik van standaard olieonderdompelingsoptiek. Een oplossing voor dit probleem is het gebruik van een doelstelling ontworpen voor een onderdompeling sindex in het hogere bereik. Door de heropleving van de belangstelling voor beeldvorming van gerooide specimens komen speciale doelstellingen met de benodigde correctie beschikbaar. De andere oplossing is om de index van het verhelderende medium aan te passen tot 1.515 of 1.518 door toevoeging van een kleine hoeveelheid butanol (n = 1.399) voor optimale olieonderdompelingprestaties en de licht aangetaste helderheid te accepteren.

(3) Microscopie van intacte biofilms (en andere specimens op deze schaal) vereist een aanzienlijke werkafstand om de dikte van het monster aan te passen. Dit is een belangrijke praktische overweging. Een lange werkafstand beperkt de optiek tot een matig numeriek diafragma (NA = 0,6–1,25), wat de resolutie beperkt, maar ook de ernst van de sferische aberratie beperkt.

(4) De optimale brekingsindex ter verduidelijking kan voor andere soorten vaste specimens anders zijn. Specimens moeten dienovereenkomstig worden getest aan de hand van fasecontrast en een reeks refractieve referentievloeistoffen voor index, zoals aangegeven in figuur 3.

Protocol

1. Groei van biofilmculturen

Let op: Candida albicans is een menselijke ziekteverwekker. Bij sommige instellingen vereist de cultuur van dit organisme BSL-2 containment.

  1. Streep geselecteerde stam uit op een gistextract-peptone-dextrose (YPD) agarplaat en groei 48 uur bij 30 °C.
  2. Selecteer enkele kolonies van de plaat om 5 mL YPD-medium in te enten in 15 mL kweekbuizen voor nachtelijke aërobe groei (carrouselrotator, 52-55 rpm) bij 30 °C.
  3. Bepaal de celdichtheid met behulp van een 40- tot 50-voudige verdunning van de nachtcultuur. Bereken de verdunningsfactor die nodig is om de celdichtheid te brengen tot 3 x 106 cel/mL voor siliconensubstrata, of 0,6-1,2 x 106 cellen/mL voor afdekglasoppervlakken die zijn behandeld met concanavalin-A (ConA) of tarwekiemagglutinine (WGA) (zie Discussie).
  4. Voor biofilmgroei in een 12-putplaat(figuur 1),moet u 2,0 mL steriel filamentatiemedium in elke put voorzien en de plaat opwarmen tot 37 °C in een bevochtigde couveuse. Een verscheidenheid aan media zal filamentatie veroorzaken, sterker bij een verhoogde temperatuur (37 °C) en met toegevoegd serum. Foetale runderserum (FBS) wordt aanbevolen. Aanbevolen media zijn YPD, Spider-Mannitol of RPMI-1640.
  5. Met steriele pincet, plaats een voorbereide substratum in elke put in de opgewarmde plaat en verjagen bubbels. Voeg het intmateriaal van de nachtelijke cultuur toe om de celdichtheid te bereiken die in stap 1.3 in elke put wordt aanbevolen. Een goed zonder inoculum dient als een visuele blanco en controle tegen besmetting.
  6. Plaats de plaat op een orbitale mixer van 60 rpm in een bevochtigde luchtincubator van 37 °C gedurende 90 min om tijd vrij te maken voor celhechting. Verwijder na 90 min de medium en niet-aangesloten cellen, was met steriele medium of fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) en plaats ingeënte substrata in kweekgerechten of een andere multiwellplaat met voorverwarmde filamentatiemedium. Met multiwell platen is het erg handig om een tweede plaat te gebruiken voor de wasstap en een derde plaat met 2,0 mL voorverwarmd medium per put om de gewassen ingeënte substrata te ontvangen. Steriliseer pincet voorafgaand aan elke overdracht.
  7. Breng de plaat terug naar de 37 °C bevochtigde ambient-air incubator en laat de biofilms tot 48 uur groeien met orbitale menging van 60 rpm voor beluchting. Er zou in elke cultuur weinig planktonachtige groei moeten zijn, tenzij de zich ontwikkelende biofilm gistvormcellen afwerpt. Een biofilm die op deze manier wordt geteeld, is te zien in figuur 1.

2. Monsterverwerking voor beeldvorming

LET OP: Aldehyde fixatiefen zijn vluchtig en gevaarlijk. Bereid fixatieve verdunningen in een rookkap, niet in een bioveiligheidskast. Plaats geen fixatiefs in couveuses die worden gebruikt voor levende cellen. Werk met verdunde fixatiefen in overdekte gerechten in een rookkap of een goed geventileerde benchtop. Gooi fixatiefs en post-fix wash oplossingen als gevaarlijk afval.

  1. Bereid verse fixatieve, 4% formaldehyde of paraformaldehyde in PBS, optioneel met maximaal 2% glutaraldehyde. Formaline verdund tot 4% kan worden gebruikt voor routinewerk.
    LET OP: Glutaraldehyde in het bijzonder zal breedband autofluorescentie verhogen en kan de fluorescentie van uitdrukbare tags zoals dTomato verzachten.
  2. Verwijder het kweekmedium uit het monster en vervang door PBS om serumeiwitten weg te verdunnen, of breng de biofilm op het substratum gedurende enkele minuten over op PBS.
  3. Breng het monster over in fixatieve en stel de afgedekte schotel op een langzame orbitale mixer voor 20 min. Verleng de periode bij het verwerken van dikkere exemplaren (zie Discussie). Voldoende fixatief volume moet worden toegevoegd aan elk gerecht om alle biofilm groei onder te dompelen, met inbegrip van een aan de binnenkant van de schotel.
  4. Verwijder de fixatieve en vul de schotel met PBS om de resterende fixatieve te wassen. Gooi de fixatieve als gevaarlijk afval. Herhaal verschillende korte termijn wasbeurten, dan langere wasbeurten om tijd te laten voor de resterende fixatieve te verspreiden uit de biofilm of agar blok. De wasperiode is afhankelijk van de toegestane tijd voor fixatie (zie Discussie).
  5. De benodigde hoeveelheid vlek is afhankelijk van de biofilmmassa. Verwijder alle biofilm uit niet-specimen gebieden van de cultuur schotel voorafgaand aan vlekken, of breng het vaste exemplaar in een nieuwe schotel voorafgaand aan vlekken. Laat de biofilm niet uitlekken of drogen.  Houd het ondergedompeld in PBS.
  6. Voeg de vlek toe aan de schotel (zie Discussie) en zet de overdekte schotel 's nachts op een langzame orbitale mixer (zie Discussie). Bescherm tegen licht.
  7. In de ochtend, verwijder de kleuroplossing en vul de schotel met PBS om de ongebonden vlek te verdunnen. Zet de gerechten op langzame orbitale mixer om te destainvoor enkele uren.

3. Verduidelijkingsprotocol: Biofilms over Impermeant Substrata

  1. Verduidelijkte biofilms zijn visueel moeilijk te onderscheiden. Markeer daarom, indien gewenst, één kant van elk substratum met een kras om de kant aan te wijzen voor inenting.
  2. Gebruik gelabelde lange Pasteur pipetten voor alle daaropvolgende afval- en oplosmiddeloverdrachten om kruisbesmetting van de oplosmiddelen te voorkomen.
  3. Breng met behulp van pincet de vaste biofilm over van PBS naar 5 mL van 50:50 PBS:methanol in een 20 mL glazen flacon met de biofilm naar boven gericht. Meng handmatig met orbitale beweging met intervallen van 1 min gedurende 5 minuten (zie Discussie).
  4. Verwijder het oplosmiddel in een afvalfles, voorzichtig om contact tussen de pipet en biofilm, of de biofilm en flacon te voorkomen. Voorzichtig bijvullen met 3 mL nette methanol. Meng handmatig met orbitale beweging met intervallen van 1 min gedurende 3 minuten.
  5. Verwijder het oplosmiddel tot een afvalfles en vul onmiddellijk bij met 5 mL methanol. Meng handmatig met orbitale beweging met intervallen van 1 min gedurende 5-10 min. Verwijder het oplosmiddel in de afvalfles en vul onmiddellijk bij met 3 mL methanol. Biofilms zien er op dit moment vaak ondoorzichtiger uit dan hun eerste verschijning.
  6. Verwijder het oplosmiddel in de afvalfles en vul de flacon onmiddellijk bij met 5 mL van 50:50 methanol:methylsalicylaat. Meng handmatig met orbitale beweging met intervallen van 1 min gedurende 5-10 min. De biofilm moet semitransparant zijn in dit gemengde oplosmiddel.
  7. Verwijder het oplosmiddel tot een afvalfles. Vul de flacon voorzichtig bij met 3 mL nette methylsalicylaat (MS). Meng handmatig met orbitale beweging met intervallen van 1 min gedurende 3 minuten.
  8. Verwijder het oplosmiddel aan de afvalfles en vul onmiddellijk bij met 5 mL nette MS. Meng handmatig met orbitale beweging met intervallen van 5-10 min. Op dit punt moet de biofilm transparant zijn. Verwijder het oplosmiddel aan de afvalfles en vul de flacon onmiddellijk bij met 3 mL nette MS. De verwerkte biofilm is stabiel in dit oplosmiddel.
  9. Voor biofilms op agar (zie Bespreking) breid alle periode van uitwisselingstijd uit om water en oplosmiddelverspreiding hoewel agar toe te staan. De benodigde perioden kunnen worden geschat met behulp van een low-power ontleden microscoop met darkfield verlichting om het oplosmiddel vooraf in de agar te bekijken. Het protocol bereikt goede verduidelijking en geen grote krimpeffecten wanneer 2% agar wordt gebruikt, maar de verduidelijkte agar zal condenseren als geperst tijdens de behandeling met pincet. Het gebruik van een spatel wordt aanbevolen.

4. Imaging Setup voor Confocalmicroscopie

  1. De volgende stappen zijn voor het gebruik van een omgekeerde microscoop. Gebruik een oplosmiddelbestendige schotel met een dekselglazen bodem om het omgekeerde exemplaar op het microscoopstadium te houden (zie Discussie).
  2. Bereid afstandhouders voor op ondersteuning van het omgekeerde exemplaar. Gebruik kleine rechthoeken gesneden uit microscoopdia's (1.000 μm dik), afdekglazen (170 μm) of 13 mm siliconenringen (330 μm, zie Tabel met materialen),die naar behoefte kunnen worden gestapeld. Presoak de ringen in methylsalicylaat voor 1 uur om focus drift als gevolg van zwelling te minimaliseren.
  3. Voor een biofilm op een siliconen vierkant van medische kwaliteit, omkeren het vierkant (dat wil zeggen, zet het biofilm naar beneden) en zet het op een spacer in een pool van methylsalicylaat in de schotel (Figuur 2). Zorg ervoor dat eventuele bubbels onder het monster te voorkomen.
  4. Monteer de schotel stevig op het podium van de microscoop en maak olie ondergedompeld contact met het doel (zie Discussie).
  5. Pas de hoeveelheid MS in de schotel aan, zodat de meniscus het monster stevig op de spacer houdt door oppervlaktespanning. Plaats een druppel MS op de top van het omgekeerde vierkante onderlaag om lichtverstrooiing van de matte afwerking te verminderen en bedek de schotel met een glasplaat om verdamping te beperken. Wacht enkele minuten tot het monster zich op de afstandhouders vestigt voordat u zich laat zien.
  6. Gebruik doorgegeven licht om het gezichtsveld visueel te inspecteren en de huidige focuspositie ten opzichte van de apicale en basale gebieden van de omgekeerde biofilm te lokaliseren. Stel de condensor verhelderende numerieke diafragma (INA) tot een minimum (sluit de condensor iris) om het contrast te verhogen, anders zal de verduidelijkte biofilm bijna onzichtbaar zijn. Schakel de doorgegeven lichtbron uit wanneer u klaar bent.
  7. Schakel over op confocale fluorescentie en stel de onderste en bovengrenzen in van de seriefocusafbeeldingsstapel die nodig is om de biofilm te overspannen. Opwaartse focus drive stappen, die wordt aanbevolen, zal eerst tonen verdreven cellen die zijn neergestreken op de cover glas en zeer lange apicalhyphae die rusten op het glas. Aan de bovenkant van de reeks moeten de stichterscellen aan de basis van de biofilm aan het substratum worden gezien. Stel de pinholediameter, de pixelafstand in het afbeeldingsvlak en de toename van de focusstap in met behulp van de algemene criteria die in de discussie zijn beschreven.

Resultaten

Biofilms zoals die in figuur 1 zijn zwaar doorschijnend tot ondoorzichtig, maar worden routinematig verduidelijkt en weergegeven door gebruik te maken van het bovenstaande protocol. Figuur 2 toont de sterke demping van fluorescentie met focusdiepte in een vaste biofilm in PBS, vergeleken met dezelfde biofilm na indexmatching. Zoals blijkt uit figuur 3, kan met behulp van seriële miscible oplosmiddelen van toenemende brekingsindex het maximum in helderheid snel worden geschat. Dit wordt verfijnd door conventionele fase contrast microscopie om het punt van minimaal contrast (maximale transparantie) te vinden. Het is duidelijk dat dit optimale niet wordt bereikt door homogene indexmatching. Dit komt omdat subcellulaire structuren enigszins verschillen in refractieve index. In dit geval vond contrastomkering plaats in de celwand bij een iets lagere oplosmiddelindex dan in het cytoplasma. Voor Candida albicans biofilms komt het optimale in de buurt van n = 1.530. De 48 h wild type en cak1 DX mutant biofilms in figuur 4A waren 500 μm in dikte, maar de gistcellen aan de basis werden bijna net zo scherp afgebeeld als de apicale cellen. Evenzo, zoals blijkt uit figuur 4C, was de verzwakking van fluorescentie niet sterk gecorreleerd met focusdiepte. Figuur 5 toont invasieve hyphae in agar, honderden micrometers onder een oppervlakte biofilm. Volwassen invasieve hyphae produceren consequent laterale ontluikende gist proximale aan de septa in de hyphal keten, waardoor aanleiding tot subkolonies van gist-achtige cellen op regelmatige tijdstippen langs een invasieve hypha.

figure-results-1
Figuur 1: Biofilm culturen voorafgaand aan verduidelijking. Een 24 uur biofilm gekweekt uit een isolaat van een aangevuld efg1 ∙/∙ stam van C. albicans in een 12-putplaat op een siliconenvierkant in RPMI-1640 vloeibaar medium aangevuld met 10% FBS. De steriele blanco is in goed C4.  Inset toont gesneden dwarsdoorsnede van 96-hr wild-type biofilm geteeld in een 6-put plaat op een 3,75 mm agar basis in hetzelfde medium met invasieve hyphae. Beide panelen zijn op dezelfde schaal. Schaalbalk = 2,0 mm. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

figure-results-2
Figuur 2: Verbetering van diepe beeldvorming door indexmatching. De figuur toont sideview projecties van confocale beeldstapels van een 48 h wild type biofilm die werd vastgesteld en gekleurd met ConA-Alexafluor 594. (A) Het exemplaar werd afgebeeld in PBS met behulp van een 63x 1.0 NA directe water-onderdompeling doelstelling. De demping was ernstig bij een focusdiepte van 30 μm. (B) Na verduidelijking door protocolstappen 3.3–3.8 werd dezelfde biofilm in methylsalicylaat afgebeeld met minimale demping met behulp van een doelstelling van 40x 0,85 NA-olieonderdompeling. Na achtergrondaftrekking en sideview projectie van de 3D-beeldstapels, werden de 40x-gegevens ruimtelijk opnieuw geschaald om de 63x-gegevens voor vergelijking te evenaren. (C) Schematisch diagram met omgekeerde montage van het gewiste exemplaar (van MS) door overdracht aan MS in een zwart-geanodiseerde aluminium schotel met een gecementeerde cover glazen bodem (zie Discussie). Schaalbalk = 50 μm. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

figure-results-3
Figuur 3: Fase contrast refractometrie toont contrast omkering van cellulaire functies in het bereik van optimale index matching. De vaste biofilms op dekkingsglazen werden geruild van PBS in methanol, dan in xyleen (n = 1.496). Deze biofilms werden vervolgens uitgewisseld elk van xyleen in een set van refractive index referentie vloeistoffen (Serie E, Cargille Laboratories, zie Tabel met materialen) en visueel onderzocht side-by-side om de index bereik geven hoogste transparantie te bepalen. (bovenste paneel) De contrastbeelden van de fase: Één biofilm werd serieel geruild tussen xyleen en een smalle reeks verwijzingsvloeistoffen in dat bereik. Na elke uitwisseling, hetzelfde veld werd verplaatst en bekeken hoewel een cover glas met behulp van een 40x 0,85 NA Ph2 olie onderdompeling fase contrast doelstelling en Ph2 condensor. Alle beelden werden opgenomen met dezelfde lamp instelling en camera belichting om nauwkeurig weer te geven veranderingen. Bij toenemende index wordt contrastomkering voor het eerst gezien bij n = 1.530 voor de celwand, gevolgd door cytoplasma bij n = 1.535. Schaalbalk = 10 μm. (onderste paneel) Grafiek met de minimale gemiddelde helderheid van biofilm op het punt van maximale transparantie. Sterke verstrooiing van licht in de biofilm zorgt ervoor dat de gemiddelde helderheid het lege veld overschrijdt. Geïsoleerde cellen lijken donkerder dan het lege veld, tot contrastomkering in het bereik 1.530–1.535. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

figure-results-4
Figuur 4: Diepe beeldvorming van mutant en wild type C. albicans biofilms. Een wilde soort stam (DAY185) en een celcyclus gerelateerde eiwit kinase verminderde expressie stam (cak1 DX)14 werden geteeld op 37 ° C voor 48 uur op siliconen substrata in vloeibare YPD medium. De biofilms werden gefixeerd, bevlekt met ConA-Alexafluor 594, en verduidelijkt met behulp van het oplosmiddel uitwisseling protocol in methylsalicylaat. De 3D confocale microscopie toonde aan dat beide biofilms ~500 μm dik waren. Afbeeldingsgegevens zijn omgezet naar een 32-bits indeling in ImageJ of Fiji (https://imagej.nih.gov/ij/ of http://fiji.sc), vervolgens verwerkt met de functie Achtergrond aftrekken met een rolkogelstraal van 50 pixels, waarbij drempelwaarde wordt bereikt om negatieve pixels op nul in te stellen, opnieuw te snijden en maximale intensiteitsprojectie te gebruiken om zijaanweergaven te produceren. (A) Axiale en side-view projecties: Het wilde type biofilm groeide tot een dikte van 502 μm zoals te zien in de zijaanzicht projectie van de 558-vlak confocale beeldstapel. Schaalbalk = 100 μm. (linkerpanelen) 40-vlak axiale projecties van top (boven) naar basis (onder) tonen de variatie in celtypen in verschillende lagen van de biofilm. Dit voorbeeld toonde karakteristieke wilde type structuur: aanhangende cellen aan de basis geven aanleiding tot hyphae die opstijgen in een dichte middelste zone van pseudohyphal en gist-achtige cellen. Boven de midzone, hyphae weer opgedoken en gaf aanleiding tot clusters van ontluikende gist. De lange hyphae gezien in de apicale zone waarschijnlijk uitgebreid tot de cultuur medium in de levende biofilm, maar gevouwen over op het oppervlak van de biofilm tijdens de verwerking van het monster. De cak1 DX biofilm groeide uit tot een dikte van 500 μm zoals te zien in de zijaanzichtprojectie van de beeldstapel van 556 vlak. Deze mutant, waarvan bekend is dat filamenteuze groei ondergaan in de afwezigheid van inducerende spanningen14, produceerde een dramatisch andere architectuur. Zoals te zien in zowel de zijaanzicht en axiale projecties (rechterpanelen), veel vertakkende cellen gaf aanleiding tot radiale uitwassen. (B) Voorbeelden van vertakking hyphae in de cak1 DX biofilm. Schaalbalk = 10 μm. (C) Fluorescentie demping met diepte in de verduidelijkte wilde type biofilm werd gekwantificeerd door het maskeren van achtergrondpixels, dan computing het gemiddelde digitale signaal voor alle niet-achtergrond pixels in elk beeld vlak. Met uitzondering van apicalhyphae die helder zijn getagd door de lectine, was er geen sterke dempingstrend met focusdiepte. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

figure-results-5
Figuur 5: Invasieve hyphae in agar. C. albicans hyphae in een oppervlakte biofilm zal doordringen een agar substratum tot millimeter afstanden (zie figuur 1). Na verduidelijking kunnen invasieve structuren naar beneden worden bekeken, hoewel de biofilm, of omhoog vanaf de onderkant van de agar. Deze laatste vraagt om meer werkafstand. Als alternatief, na fixatie, maar voorafgaand aan kleuring en oplosmiddel uitwisseling, de agar kan verticaal worden gesneden met een scalpel of scheermesje in 1-2 mm platen die vervolgens kunnen worden gedraaid op een zijde en direct in het zijaanzicht na kleuring en verduidelijking. Deze procedure wordt aanbevolen. In deze projectie van een vierkant gezichtsveld van 213 μm werd een regenboogkleurschaal gebruikt om de axiale positie over een bereik van 75 μm te coderen: blauwe kenmerken zijn dichtbij en rode kenmerken zijn dieper in het vlak van de pagina. Deze weergave toont aan dat lange hyphae knop uit laterale gist-vorm cellen met semireguliere intervallen die aanleiding geven tot subkolonies. Schaalbalk = 50 μm. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Discussie

Vooruitgang in fluorescentie microscopie in optische sectie, resolutie, snelheid, vermijden of compensatie van aberratie, multichannel acquisitie, en in rekenkracht, hebben geleid tot een heropleving in de beeldvorming intacte exemplaren. Voor vaste exemplaren hebben zowel klassieke als nieuwe verduidelijkings- en uitbreidingsmethoden een grote impact gehadop 19,20,21,22,23,24. In dit geval hebben we een snelle en eenvoudige op oplosmiddelgebaseerde indexmatchingbenadering toegepast om de structuur van schimmelbiofilms te bestuderen die sterk doorschijnend tot ondoorzichtig zijn.

De voorgaande protocollen zijn getest met een reeks exemplaren. In ons laboratorium worden Candida albicans biofilms meestal geteeld op 14 mm vierkanten gesneden uit een vel siliconenrubber van medische kwaliteit (zie Tabel met materialen). Dit substratum wordt gebruikt omdat de groei op PDMS (poly-dimethylsiloxane) ondergedompeld in vloeibare cultuur medium is vastgesteld als een belangrijk in vitro model voor infecties in verband met medische implantaten, met name inwonende katheters. Gestreste cellen die filamentatie initiëren, hechten zich snel aan niet-polaire oppervlakken zoals PDMS. In de praktijk geven gebruikte vierkanten die zijn gereinigd en opnieuw gesteriliseerd in een autoclave (droge cyclus) de meest consistente biofilms voor een bepaalde stam. Biofilms worden ook vaak geteeld op cover glazen, in cover glas bodem cultuur gerechten, in standaard bacteriologische kwaliteit polystyreen gerechten, en op agar. Omdat C. albicans cellen niet goed hechten aan glas, moet de cover bril worden behandeld met een lectine dat celwand polysachariden zal binden. We passen 40 μL van 1 mg/mL ConA of WGA in steriel water aan op elk dekslipoppervlak. Na het drogen worden de afdekglazen behandeld met 40 μL van 1% glutaraldehyde gedurende 3 min om het eiwit te crosslinken tot een onoplosbare film. Ze worden vervolgens gewassen met steriel gedestilleerd water om de fixatieve en oplosbare lectine en luchtgedroogd te verwijderen. Indien nodig worden de behandelde afdekglazen of gerechten gedurende 10 min opnieuw gesteriliseerd onder een kiemdodende UV-lamp.

De dikte van het monster heeft invloed op de vereiste incubatietijd in de protocollen. Fixatieve diffusie in een 300 μm biofilm vergt enkele minuten om te equilibraten. Deze periode neemt toe als het kwadraat van het monster dikte, en moet worden uitgebreid tot een uur of meer voor zeer dikke biofilms of agar blok exemplaren die kunnen worden 2-3 mm dik. De evenwichtstijd voor kleuring hangt ook af van de dikte van het monster zoals beschreven voor de bevestiging en washout. Echter, omdat de lectines diffuus langzamer dan de low-MW fixatiefen, vooral binnen een agar gel, vlekken moeten worden verlengd 's nachts. Hetzelfde moet worden gedaan voor het washout van overtollige vlek.

Vlekken van verschillende soorten kunnen in de protocollen worden opgenomen. We gebruiken een celwandvlek voor structurele beeldvorming, meestal Calcofluor White M2R (Fluor. Brightener #28) of een lectine met kleurstof, zoals ConA-Alexafluor 594 of WGA-Alexafluor 594. Er moet aandacht worden besteed aan de valency van het eiwit. De ConA tetramer kan crosslinking van zeer flexibele hyphae veroorzaken in het apicale gebied van een biofilm. Dit is minder duidelijk met de WGA dimer. De canonieke specifieke kenmerken van deze markers zijn Calcofluor voor chitine, ConA voor manneusresten en WGA voor N-acetyl-D-glucosamine en sialic acid residues.

Omdat het oplosmiddeluitwisselingsprotocol is ingedeeld uit PBS of water dat methanol in methylsalicylaat is, moeten monstercontainers oplosmiddelbestendig zijn. Methylsalicylaat (MS) zal snel polystyreen plasticware verzachten en langzaam andere kunststoffen verzachten. Het protocol stappen tot het gebruik van de nette methanol kan worden uitgevoerd in plasticware, maar op dat punt in het protocol schakelen we over het algemeen over naar standaard 20 mL glas scintillatie flesjes met oplosmiddelbestendige schroefdoppen. De flesjes zijn handig voor biofilms op siliconen vierkante substrata, omdat de pleinen kunnen worden opgehaald en overgebracht met behulp van fijne pincet. Ook kan een flacon worden afgevoerd en bijgevuld met het vlakke vierkant dat op het binnenste gebogen oppervlak rust, zodat de biofilm geen contact maakt met het glas. Het substratum moet biofilm-up zijn wanneer het in het rechtopstaande flesje wordt ondergedompeld. De flesjes zijn uitstekend geschikt voor langdurige monsteropslag.

In het verduidelijkingsprotocol minimaliseren meer gesorteerde oplosmiddeluitwisselingsstappen het risico op vervorming van het monster als gevolg van oplosmiddelmengeffecten. Voor snelheid en gemak in het basisprotocol zijn er vier stappen: 1) stap 3.3, PBS tot 50:50 PBS:methanol; 2) stappen 3.4 en 3.5, PBS:methanol tot nette methanol, 3) stap 3.6, nette methanol tot 50:50 methanol:MS; en 4) stappen 3.7 en 3.8, methanol:MS tot nette MS. Methanol zorgt voor de overgangsmiscibility. Omdat water en MS echter bijna immiscible zijn, is het van essentieel belang dat al het water door methanol wordt verplaatst vóór de introductie van ms. Evenzo, omdat methanol zeer vluchtig is, is het belangrijk om alle methanol door MS te verplaatsen. Anders is het voortgezette de voortzetting van de voortzetting van de verdamping van restmethanol zal refractieve indexvariaties in het monster veroorzaken. Binnen de vier stappen volgorde, het herhalen van de tweede en vierde stappen door het toevoegen van een andere verandering van netjes oplosmiddel, of zelfs een derde verandering, is raadzaam. Voor bijzonder kwetsbare exemplaren kunnen oplosmiddelveranderingen in kleinere procentstappen worden geformuleerd.

Met agar blok specimens, stappen 3.4 en 3.5 (nette methanol) kan leiden tot het verschijnen van zoutkristallen in de agar als gevolg van de onoplosbaarheid van resterende PBS zouten in de methanol. Dit kan worden vermeden door gedestilleerd water (DW) te gebruiken in de eerste gemengde oplosmiddelstap in plaats van PBS om zouten te verdunnen tijdens de wateruitwisseling:methanol. De alternatieve oplosmiddeluitwisselingssequentie voor vaste biofilms bestaat dan uit de volgende stappen: 1) stap 3.3, breng het monster van PBS over naar 50:50 DW:methanol (laat extra tijd voor verspreiding via agar); 2) stap 3.4, breng het monster van 50:50 DW:methanol over in nette methanol (herhaal 2x met methanol zoals in stap 3.5); 3) stap 3.6, breng het specimen over van methanol naar 50:50 methanol:methylsalicylaat; en 4) stap 3.7, breng het exemplaar van 50:50 methanol: MS naar nette MS (herhaal 2x met MS zoals in stap 3.8).

Omdat methylsalicylaat polystyreen plasticware snel verzacht, gebruiken we een geanodiseerde aluminium schotel met een dekselglazen bodem om de verduidelijkte biofilm op het podium van een omgekeerde microscoop te houden. Het afdekglas wordt op zijn plaats gehouden met behulp van UV-uithardend optisch cement (Norland Optical Adhesive #61, zie Tafel van Materialen). Op voorwaarde dat de MS wordt verwijderd aan het eind van de dag door het wassen van de schotel met isopropanol gevolgd door zeepwater en spoelen, zal de gecementeerde deksel glas dienen voor vele maanden.

Objectieve lensselectie is van cruciaal belang bij grootschalige beeldvorming van verduidelijkte specimens vanwege het belang van het minimaliseren van sferische aberratie en de noodzaak van voldoende werkafstand. We hebben ervaring met drie doelstellingen in deze studies. In de omgekeerde microscoop setup, gebruiken we een lange werkafstand, matige numerieke diafragma (NA) objectieve olie ondergedompeld onder de cover glas met de biofilm ondergedompeld in methylsalicylaat in de schotel boven het deksel glas. Het grootste deel van ons werk is gedaan met een Zeiss Universal serie achromatische doelstelling, type 461708, 40x 0.85NA Oel 160/1.5, gebruikt met een negatieve 160 mm brandpuntsafstand adapter voor nominale oneindig-conjugaat (IC) compatibiliteit. Deze doelstelling is oorspronkelijk ontworpen voor olie ondergedompeld bekijken door middel van 1,5 mm microscoop dia's met 0,35 mm werkafstand25. Bij gebruik met een standaard afdekglas (0,17 mm) is de werkafstand veel groter: 1,5 + 0,35–0,17 = 1,68 mm = 1.680 μm. We maken ook gebruik van een nieuwe Zeiss multi-onderdompeling doelstelling, type 420852, 25x 0.8NA LD LCI Plan-apochromat met een werkafstand van meer dan 540 μm, met de onderdompeling correctie ingesteld op de hoge kant van 'olie'. Deze doelstelling wordt zeer gecorrigeerd en produceert een prachtig beeld. Op een rechtopstaande microscoopstandaard hebben we gebruik gemaakt van een nieuwe Nikon multi-immersion doelstelling, type MRD71120, 10x 0.5NA CFI Plan-apochromat met een werkafstand van meer dan 5.000 μm (5 mm), ook met de onderdompelingscorrectie ingesteld op de hoge kant van 'olie' (n = 1.518). Hoewel deze doelstelling een lagere NA heeft dan de anderen, heeft het het voordeel dat het direct onderdompelbaar is in methylsalicylaat.

Om de gegevensverwerving in termen van snelheid en resolutie te optimaliseren, moeten confocale microscoopinstellingen idealiter voldoen aan zowel transversale als axiale Nyquist-bemonsteringsdichtheid18. Stel de confocale pinholediameter nominaal in op 1 Airy-eenheid. In vergrote coördinaten,

dP (μm) = 1,22 x vergroting x (emissiegolflengte in μm) / NA

Transversale bemonstering (pixelafstand) mag de resolutielimiet van Abbe niet overschrijden (1/2). In objectspaördinaten

∙x, ∙y = (emissiegolflengte in nm) / (4 NA)

Axiale bemonstering (focustoename) mag de omgekeerde axiale bandbreedte niet overschrijden,

∙z = (onderdompelingsindex) x (emissiegolflengte in nm) / (NA2)

Het confocale optische systeem breidt de bandbreedte van de microscoop uit en scherpt zowel de transversale als axiale resolutie met ten minste 1/√2.

Voor de 40x 0.85 NA doelstelling die we het vaakst gebruiken, zie tabel 1 voor de resultaten van deze formules voor een 600 nm emissiegolflengte (Alexa Fluor 594).

Formulex 1/√2set (typisch)
dP (μm)34,5 μm-25 of 50 μm
∙x, ∙y176 nm125 nm161 nm
∙z1200 nm848 nm900 nm

Tabel 1: Confocale pinhole diameter, transversale bemonstering, en axiale bemonstering waarden voor een 600 nm emissie golflengte.

Met behulp van een spin-disk confocale scanner met deze instellingen en een 1.392 x 1.040 pixel scan veld, gegevens van biofilm exemplaren kunnen worden verkregen met een redelijke snelheid en resolutie. Typische 3D-afbeeldingsstapels met één kleur draaien 0,35 tot 1,55 GB.

Verduidelijkingsmedia bij breed gebruik omvatten een aanzienlijk brekingsindexbereik. Door darkfield verlichting en visuele inspectie, vonden we dat vaste C. albicans biofilms waren het meest transparant boven n = 1,5. Dit werd verfijnd door fase contrast microscopie naar n = 1.530–1.535. Om een aantal praktische redenen gebruiken we methylsalicylaat (n = 1.537) als de uiteindelijke index die overeenkomt met oplosmiddel. Hoewel oplosmiddeluitwisseling het risico van modelvervorming of andere artefacten met zich meebrengt, hebben cellen in vaste, verduidelijkte specimens vergelijkbare cellichaamsafmetingen, hyphadiameter en interseptale lengteafmetingen als levende specimens.

Veel variaties in het oplosmiddeluitwisselingsproces zijn mogelijk (bijvoorbeeld met behulp van een ander overgangsoplosmiddel, of een ander eindoplosmiddel). Methanol werd gekozen vanwege zijn hoge polariteit en snelle diffusie, maar ethanol bleek beter te behouden rode fluorescerende eiwitten (RFP) quantum opbrengst26 als een overgangsoplosmiddel. Methylsalicylaat werd geselecteerd voor zijn index, matige polariteit, lage dampdruk en compatibiliteit met veel vlekken, kleurstoffen en fluorescerende eiwitten. Echter, een laatste oplosmiddel met iets lagere index, of een mengsel van methylsalicylaat en een lagere index oplosmiddel, zoals butanol, kan beter dienen.

Onverwacht, de mogelijkheid om te zien door middel van een biofilm onthult niet alleen de gelaagde interne kenmerken, maar helpt ook bij het bekijken van de oorsprong van uitgebreide structuren, zoals lange, onverstrengelde apicalhyphae en invasieve basale hyphae op bepaalde substrata. Opportunistische virulentie in C. albicans hangt af van zijn genetische veelzijdigheid (d.w.z. omschakeling naar hyphal groei, upregulatie van celsubstratum en cel-cel aanhankelijkheid, generatie van osmolyten voor cel ontluikende en verlenging, en het gebruik van alternatieve voedingsstoffen). Hyphal extensie maakt breakout van individuele C. albicans cellen uit fagocytische immuuncellen, maar is ook essentieel voor invasie. Biofilm hechting en hyphal verstrengeling lijken te bieden het oppervlak verankering die nodig is voor hyphae om efficiënt binnen te vallen een substratum. Wanneer dat substratum gastheerweefsel is, kan verhoogde virulentie het gevolg zijn.

Beeldvorming intacte biofilms maakt een groot aantal informatieve experimenten met behulp van reporter stammen voor genexpressie, model weefsel substrata, en de opname van andere organismen zoals bacteriën gevonden in natuurlijke biofilms. Zelfs in het eenvoudigste geval van zuiver structurele beeldvorming met een celwandvlek, worden in situ fenotypes onthuld die vervolgens kunnen worden gekwantificeerd en genetisch geanalyseerd.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben geen concurrerende belangen te onthullen.

Dankbetuigingen

Dit onderzoek werd gedeeltelijk ondersteund door NIH subsidies R01 AI067703, R21 AI100270, en R21 AI135178 aan A.P. Mitchell. De auteurs zijn Greenfield 'Kip' Sluder dankbaar voor het verstrekken van de lange werkafstand olie onderdompeling doelstelling gebruikt in dit werk, en daniel Shiwarski voor confocale microscopie met directe methyl salicylate onderdompeling.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Biogevaarlijk afvalcontainer
Bioveiligheidskabinet met germicide UV-lamp
Calcofluor White M2R (2,5 mg/mL in methanol)
Concanavalin A - Alexafluor-594 of ander conjugaat
Gedestilleerd waterDW
Gedestilleerd water, steriel
Ethanol, absoluutEtOH
Foetaal bovien serum (FBS), steriel
Fixeermiddel afvalfles in secundaire beveiliging
Formaldehyde 20% in water, ampullenElectron Microscopy Sciences
Formaldehyde alternatieven: paraformaldehyde poeder, formaline 37%Electron Microscopy Sciences
Zuigkap
Glutaraldehyde 25% in water, ampullenElectron Microscopy Sciences
Incubator - 30 °C, met roterende mixer (60 rpm) voor kweekbuisjes
Incubator - 37 °C, met orbitale mixer voor kweekplaten
Isopropanol 70%iPrOH 70%
Langgolf (365 nm) UV-lamp, 5 WCole-Parmer Scientificvoor het harden van NOA-61 cement
Medisch grad siliciumblad, 0,060" (1,52 mm) dikBentec Medical, Inc., http://bentecmed.com/Niet-versterkte medische grad siliciumblading
Methanol 99,9%MeOH
Methyl salicylaat 99%MS
Millipore Swinnex 13 mm witte silicium ring gasketsMillipore Corp.SX0001301
Norland UV-hardende optische lijm - type NOA-61Edmund Optics, Inc., https://www.edmundoptics.comNOA-61
Orbitale mixer, tafelmodel
Fosfaat-gebufferd zout oplossing (PBS), steriel
Brekingsindex standaard vloeistoffen, n = 1,500 tot 1,640 (29 vloeistoffen, 0,005 increment)Cargille Laboratories, https://cargille.comSerie ECedar Grove, NJ 07009, USA
RPMI-1640 basismedium, HEPES gebufferd, steriel
Scintillatievialen, 20 mL - Wheaton, Urea cap PE kegelkapvoeringFisher Scientific Co.03-341-25Hvoor monsterverwerking en opslag
Solvent afvalfles in secundaire beveiliging
Spider medium met mannitol, steriel (1% Difco voedingsbouillon, 0,2% K2HPO4, 1% D-Mannitol)
Wheat germ agglutinin - Alexafluor-594 of ander conjugaat
Gist-pepton-dextrose (YPD) agar platen, steriel (1% gist extract, 2% Bacto peptone, 2% dextrose, 2% Bacto agar)
YPD medium, vloeibaar, steriel (1% gist extract, 2% Bacto peptone, 2% dextrose)

Referenties

  1. Desai, J. V., et al. Coordination of Candida albicans invasion and infection functions by phosphoglycerol phosphatase Rh2. Pathogens. 4, 573-589 (2015).
  2. Miramón, P., Lorenz, M. C. A feast for Candida: Metabolic plasticity confers an edge for virulence. PLoS Pathogens. 13 (2), 1006144(2017).
  3. Bonhomme, J., et al. Contribution of the glycolytic flux and hypoxia adaptation to efficient biofilm formation by Candida albicans. Molecular Microbiology. 80, 995-1013 (2011).
  4. Ramírez-Zavala, B., et al. The Snf1-activating kinase Sak1 is a key regulator of metabolic adaptation and in vivo fitness of Candida albicans. Molecular Microbiology. 104, 989-1007 (2017).
  5. Westman, J., Moran, G., Mogavero, S., Hube, B., Grinstein, S. Candida albicans hyphal expansion causes phagosomal membrane damage and luminal alkalinization. mBio. 9, 01226(2018).
  6. Finkel, J. S., Mitchell, A. P. Genetic control of Candida albicans biofilm development. Nature Reviews Microbiology. 9, 109-118 (2011).
  7. Finkel, J. S., et al. Portrait of Candida albicans adherence regulators. PLoS Pathogens. 8, 1002525(2012).
  8. de Groot, P. W., Bader, O., de Boer, A. D., Weig, M., Chauhan, N. Adhesins in human fungal pathogens: glue with plenty of stick. Eukaryotic Cell. 12, 470-481 (2013).
  9. Lagree, K., Mitchell, A. P. Fungal Biofilms: Inside Out. Microbiology Spectrum. 5, (2017).
  10. Hawser, S. P., Douglas, L. J. Resistance of Candida albicans biofilms to antifungal agents in vitro. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 39, 2128-2131 (1995).
  11. Chandra, J., et al. Biofilm formation by the fungal pathogen Candida albicans: development, architecture, and drug resistance. Journal of Bacteriology. 183, 5385-5394 (2001).
  12. LaFleur, M. D., Kumamoto, C. A., Lewis, K. Candida albicans biofilms produce antifungal-tolerant persister cells. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 50, 3839-3846 (2006).
  13. Lagree, K., Desai, J. V., Finkel, J. S., Lanni, F. Microscopy of fungal biofilms. Current Opinion in Microbiology. 43, 100-107 (2018).
  14. Woolford, C. A., et al. Bypass of Candida albicans filamentation/biofilm regulators though diminished expression of protein kinase Cak1. PLoS Genetics. 12, 1006487(2016).
  15. Huang, M. Y., Woolford, C. A., May, G., McManus, C. J., Mitchell, A. P. Circuit diversification in a biofilm regulatory network. PLoS Pathogens. 15 (5), 1007787(2019).
  16. Ganguly, S., et al. Zap1 control of cell-cell signaling in Candida albicans biofilms. Eukaryotic Cell. 10, 1448-1454 (2011).
  17. Frisken, G. S., Lanni, F. Experimental test of an analytical model of aberration in an oil-immersion objective lens used in three-dimensional light microscopy. Journal of the Optical Society of America. 8, Reprinted in 9, 154-166, 1992 1601-1613 (1991).
  18. Lanni, F., Keller, H. E. Microscope principles and optical systems. Imaging, A Laboratory Manual. Yuste, R. M. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. 1-55 (2011).
  19. Chung, K., et al. Structural and molecular interrogation of intact biological systems. Nature. 497, 332-337 (2013).
  20. Tomer, R., Ye, L., Hsueh, B., Deisseroth, K. Advanced CLARITY for rapid and high-resolution imaging of intact tissues. Nature Protocols. 9, 1682-1697 (2014).
  21. Richardson, D. S., Lichtman, J. W. Clarifying tissue clearing. Cell. 162, 246-257 (2015).
  22. Chen, F., Tillberg, P. W., Boyden, E. S. Expansion microscopy. Science. 347, 543-548 (2015).
  23. Zhao, Y., et al. Nanoscale imaging of clinical specimens using pathology-optimized expansion microscopy. Nature Biotechnology. 35, 757-764 (2017).
  24. Gao, R., et al. Cortical column and whole brain imaging with molecular contrast and nanoscale resolution. Science. 363, (2019).
  25. Carl Zeiss. Optical Systems for the Microscope publication 41-101-e. Carl Zeiss. , Oberkochen, West Germany. archive CZO-Mi 823, ed. 1967 48(1971).
  26. Oldham, M., Sakhalkar, H., Oliver, T., Johnson, G. A., Dewhirst, M. Optical clearing of unsectioned specimens for three-dimensional imaging via optical transmission and emission tomography. Journal of Biomedical Optics. 13 (2), 021113(2008).

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

BiofilmklaringMethylsalicylaatConfocale MicroscopieOplosmiddeluitwisselingBiofilmfixatieBiofilmkleuringFasecontrastrefractometrieOrbitale MengenBeeldbewerking

Gerelateerde artikelen