De borstklier is een tweelaagse structuur, bestaande uit buitenste myoepitheel en binnenste luminale epitheelcellen. Gepresenteerd is een protocol voor de voorbereiding van organoïden met behulp van differentiële trypsinisatie. Deze efficiënte methode stelt onderzoekers in staat om deze twee celtypen afzonderlijk te manipuleren om vragen over hun rol in de vorm en functie van de borstklier te onderzoeken.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Generatie van Mozaïek Borstorganoïden door Differentiële Trypsinization
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Organoïden bieden zelforganiserende, driedimensionale weefselstructuren die fysiologische processen samenvatten in het gemak van een gerecht. De murine borstklier bestaat uit twee verschillende epitheelcelcompartimenten, die verschillende functies vervullen: de buitenste, contractiele myoepitheelcompartiment en het binnenste, secretoire luminaircompartiment. Hier beschrijven we een methode waarmee de cellen bestaande uit deze compartimenten worden geïsoleerd en vervolgens gecombineerd om hun individuele afstamming bijdragen aan borstklier morfogenese en differentiatie te onderzoeken. De methode is eenvoudig en efficiënt en vereist geen geavanceerde scheidingstechnologieën zoals fluorescentie geactiveerde celhet sorteren. In plaats daarvan oogsten en verwerken we het weefsel enzymatisch, zaaien we het epitheel op aanhangende weefselkweekgerechten en gebruiken we differentiële trypsinisatie om myoepitheel te scheiden van luminale cellen met ~90% zuiverheid. De cellen worden vervolgens verguld in een extracellulaire matrix waar ze zich organiseren in tweelaagse, driedimensionale (3D) organoïden die kunnen worden gedifferentieerd om melk te produceren na 10 dagen in de cultuur. Om de effecten van genetische mutaties te testen, kunnen cellen worden geoogst uit wilde type of genetisch gemanipuleerde muismodellen, of ze kunnen genetisch worden gemanipuleerd voorafgaand aan de 3D-cultuur. Deze techniek kan worden gebruikt om mozaïekorganoïden te genereren die het mogelijk maken om de genfunctie specifiek in het luminale of myoepitheelcompartiment te onderzoeken.
Inleiding
De borstklier (MG) is een boomachtige, buisvormige epitheelstructuur ingebed in een adipocyte rijke stroma. Het tweelaagse buisepitheel bestaat uit een buitenste, basale laag contractiele, myoepitheelcellen (MyoECs) en een binnenste laag van luminale, secretoire epitheelcellen (LEC's), die een centraal lumenomringen 1. Tijdens de lactatie wanneer de buitenste MyoECs contract om melk te persen uit de binnenste alveolar LECs, de MG ondergaat tal van veranderingen die onder de controle van groeifactoren (bijvoorbeeld, EGF en FGF) en hormonen (bijvoorbeeld progesteron, insuline, en prolactine). Deze veranderingen veroorzaken de differentiatie van g....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
Alle hier beschreven methoden zijn goedgekeurd door het Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) van de University of California, Santa Cruz.
1. Dag 1: Borstkliervertering
- Bereid je voor om de MG's te oogsten van volwassen vrouwelijke muizen van 10-14 weken oud.
- Voer de oogst uit op een open bank onder aseptische omstandigheden.
- Steriliseren alle chirurgische benodigdheden, kurk planken, en pinnen door autoclaving en weken in 70% alcohol voor 20 minuten voorafgaand aan de operatie.
- Verdovende dieren met natriumpentobarbital (2X verdovingsdosis van 0,06 mg/g lichaamsgewicht) geleverd via int....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Het hier gepresenteerde protocol beschrijft een methode voor het onderzoeken van specifieke afstammingsbijdragen van borstepitheelcellen door gebruik te maken van mozaïekorganoïden. Om primaire murinecellen voor organoïden te verkrijgen, moet het epiklierepitheel van de borstklier eerst worden geïsoleerd van de omringende adipocyterijke stroma(figuur 1). Dit proces wordt hier kort beschreven en wordt ook beschreven in een eerder gepubliceerde studie
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Hier wordt een methode gepresenteerd waarin wordt beschreven hoe onderzoekers 3D-organoïde culturen kunnen genereren met behulp van primaire MG-cellen. Het verschil tussen deze en andere protocollen is dat we een methode om de twee, verschillende MG celcompartimenten te scheiden detail: de buitenste basale MyoECs en innerlijke LECs. Onze methode maakt gebruik van een twee-staps trypsin-EDTA (0,05%) behandeling die we differentiële trypsinisatienoemen 19. Deze procedure stelt onderzoekers in staat .......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs hebben niets te onthullen.
Dankbetuigingen
Wij danken Ben Abrams voor technische bijstand en kernondersteuning van de University of California, Santa Cruz (UCSC) Institute for the Biology of Stem Cells (IBSC). Wij danken Susan Strome en Bill Saxton voor het gebruik van hun Solamere Spinning Disk Confocal Microscope. Dit werk werd gedeeltelijk ondersteund door subsidies aan UCSC van het Howard Hughes Medical Institute via het James H. Gilliam Fellowships for Advanced Study-programma (S.R.), van het NIH (NIH GM058903) voor het initiatief voor het maximaliseren van de ontwikkeling van studenten (H.M.) en van de National Science Foundation voor een graduate research fellowship (O.C. DGE 1339067) en door een beurs ....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| 15 ml High-Clarity Polypropylene Conical Tube (BD Falcon) | Fisher Scientific | 352096 | |
| 24 well ultra-low attachment plate (Corning) | Fisher Scientific | CLS3473-24EA | |
| 35 mm TC-treated Easy-Grip Style Cell Culture Dish (BD Falcon) | Fisher Scientific | 353001 | |
| 50 ml High-Clarity polypropylene conical tube (BD Falcon) | Fisher Scientific | 352098 | |
| 60 mm TC-treated Easy-Grip Style Cell Culture Dish (BD Falcon) | Fisher Scientific | 353004 | |
| 70 µM nylon cell strainer (Corning) | Fisher Scientific | 08-771-2 | |
| Antibiotic-Antimycotic (100X) | Thermo Fisher Scientific | 15240062 | Pen/Strep also works |
| B27 supplement without vitamin A (50x) | Thermo Fisher Scientific | 12587010 | |
| B6 ACTb-EGFP mice | The Jackson Laboratory | 003291 | |
| BD Insulin syringe 0.5 mL | Thermo Fisher Scientific | 14-826-79 | |
| Class 2 Dispase (Roche) | Millipore Sigma | 4942078001 | |
| Class 3 Collagenase | Worthington Biochemical | LS004206 | |
| Corning Cell Recovery solution | Fisher Scientific | 354253 | Follow the guidelines for use – Extraction of Three-Dimensional Structures from Corning Matrigel Matrix |
| Corning Costar Ultra-Low Attachment 6-well | Fisher Scientific | CLS3471 | |
| Dexamethasone | Millipore Sigma | D4902-25MG | |
| DMEM/F12, no phenol red | Thermo Fisher Scientific | 11039-021 | |
| DNase (Deoxyribonuclease I) | Worthington Biochemical | LS002007 | |
| Donkey anti-Goat 647 | Thermo Fisher Scientific | A21447 | Use at 1:500, Lot: 1608641, stock 2 mg/mL, RRID:AB_2535864 |
| Donkey anti-Mouse 647 | Jackson ImmunoResearch | 715-606-150 | Use at 1:1000, Lot: 140554, stock 1.4 mg/mL |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium: Nutrient Mixture F-12 (DMEM/F12) | Thermo Fisher Scientific | 11330-057 | |
| Dulbecco's phosphate-buffered saline (DPBS) | Thermo Fisher Scientific | 14190-250 | Without Mg2+/Ca2+ |
| EGF | Fisher Scientific | AF-100-15-100ug | |
| Fetal Bovine Serum | VWR | 97068–085 | 100% US Origin, premium grade, Lot: 059B18 |
| Fluoromount-G (Southern Biotech) | Fisher Scientific | 0100-01 | Referred to as mounting media in text |
| Gentamicin | Thermo Fisher Scientific | 15710064 | |
| Glycine | Fisher Scientific | BP381-5 | |
| Goat anti-WAP | Santa Cruz Biotech | SC-14832 | Use at 1:250, Lot: J1011, stock 200 µg/mL, RRID:AB_677601 |
| Hoechst 33342 | AnaSpec | AS-83218 | Use 1:2000, stock is 20mM |
| Insulin | Millipore Sigma | I6634-100mg | |
| KCl | Fisher Scientific | P217-500 | |
| KH2PO4 | Fisher Scientific | P285-500 | |
| KRT14–CreERtam | The Jackson Laboratory | 5107 | |
| Matrigel Growth Factor Reduced (GFR); Phenol Red-Free; 10 mL | Fisher Scientific | CB-40230C | Lot: 8204010, stock concentration 8.9 mg/mL |
| MillexGV Filter Unit 0.22 µm | Millipore Sigma | SLGV033RS | |
| Millicell EZ SLIDE 8-well glass, sterile | Millipore Sigma | PEZGS0816 | These chamber slides are great for gasket removal but other brands can work well (e.g. Lab Tek II). |
| Mouse anti-SMA | Millipore Sigma | A2547 | Use at 1:500, Lot: 128M4881V, stock 5.2 mg/mL, RRID:AB_476701 |
| N-2 Supplement (100x) | Thermo Fisher Scientific | 17502048 | |
| NaCl | Fisher Scientific | S671-3 | |
| NaH2PO4 | Fisher Scientific | S468-500 | |
| Nrg1 | R&D | 5898-NR-050 | |
| Ovine Pituitary Prolactin | National Hormone and Peptide Program | Purchased from Dr. Parlow at Harbor-UCLA Research and Education Institute | |
| Paraformaldahyde | Millipore Sigma | PX0055-3 | |
| Pentobarbital | Millipore Sigma | P3761 | |
| R26R-EYFP | The Jackson Laboratory | 6148 | |
| Rho inhibitor Y-27632 | Tocris | 1254 | |
| R-spondin | Peprotech | 120-38 | |
| Sodium Hydroxide | Fisher Scientific | S318-500 | |
| Sterile Filtered Donkey Serum | Equitech-Bio Inc. | SD30-0500 | |
| Sterile Filtered Donkey Serum | Equitech-Bio Inc. | SD30-0500 | |
| Triton X-100 | Millipore Sigma | x100-500ML | Laboratory grade |
| Trypsin EDTA 0.05% | Thermo Fisher Scientific | 25300-062 |
Referenties
- Macias, H., Hinck, L. Mammary gland development. Wiley Interdisciplinary Reviews in Developmental Biology. 1 (4), 533-557 (2012).
- Daniel, C. W., De Ome, K. B., Young, J. T., Blair, P. B., Faulkin, L. J. Jr
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
