De borstklier is een tweelaagse structuur, bestaande uit buitenste myoepitheel en binnenste luminale epitheelcellen. Gepresenteerd is een protocol voor de voorbereiding van organoïden met behulp van differentiële trypsinisatie. Deze efficiënte methode stelt onderzoekers in staat om deze twee celtypen afzonderlijk te manipuleren om vragen over hun rol in de vorm en functie van de borstklier te onderzoeken.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Generatie van Mozaïek Borstorganoïden door Differentiële Trypsinization
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Organoïden bieden zelforganiserende, driedimensionale weefselstructuren die fysiologische processen samenvatten in het gemak van een gerecht. De murine borstklier bestaat uit twee verschillende epitheelcelcompartimenten, die verschillende functies vervullen: de buitenste, contractiele myoepitheelcompartiment en het binnenste, secretoire luminaircompartiment. Hier beschrijven we een methode waarmee de cellen bestaande uit deze compartimenten worden geïsoleerd en vervolgens gecombineerd om hun individuele afstamming bijdragen aan borstklier morfogenese en differentiatie te onderzoeken. De methode is eenvoudig en efficiënt en vereist geen geavanceerde scheidingstechnologieën zoals fluorescentie geactiveerde celhet sorteren. In plaats daarvan oogsten en verwerken we het weefsel enzymatisch, zaaien we het epitheel op aanhangende weefselkweekgerechten en gebruiken we differentiële trypsinisatie om myoepitheel te scheiden van luminale cellen met ~90% zuiverheid. De cellen worden vervolgens verguld in een extracellulaire matrix waar ze zich organiseren in tweelaagse, driedimensionale (3D) organoïden die kunnen worden gedifferentieerd om melk te produceren na 10 dagen in de cultuur. Om de effecten van genetische mutaties te testen, kunnen cellen worden geoogst uit wilde type of genetisch gemanipuleerde muismodellen, of ze kunnen genetisch worden gemanipuleerd voorafgaand aan de 3D-cultuur. Deze techniek kan worden gebruikt om mozaïekorganoïden te genereren die het mogelijk maken om de genfunctie specifiek in het luminale of myoepitheelcompartiment te onderzoeken.
Inleiding
De borstklier (MG) is een boomachtige, buisvormige epitheelstructuur ingebed in een adipocyte rijke stroma. Het tweelaagse buisepitheel bestaat uit een buitenste, basale laag contractiele, myoepitheelcellen (MyoECs) en een binnenste laag van luminale, secretoire epitheelcellen (LEC's), die een centraal lumenomringen 1. Tijdens de lactatie wanneer de buitenste MyoECs contract om melk te persen uit de binnenste alveolar LECs, de MG ondergaat tal van veranderingen die onder de controle van groeifactoren (bijvoorbeeld, EGF en FGF) en hormonen (bijvoorbeeld progesteron, insuline, en prolactine). Deze veranderingen veroorzaken de differentiatie van gespecialiseerde structuren, longblaasjes, die melk synthetiseren en afscheiden tijdens lactatie1. De borstepithelia kan experimenteel worden gemanipuleerd met behulp van technieken waarbij ofwel epitheliale weefselfragmenten, cellen, of zelfs een enkele basale cel worden getransplanteerd in gastheer borstvetpads, vooraf gerooid van endogene borstparenchyma, en mag uitgroeien tot een volledige, functionele epitheelboom2,3,4,5. Transplantatie is een krachtige techniek, maar het is tijdrovend en onmogelijk als een mutatie resulteert in vroege embryonale letaliteit (voorafgaand aan E14) die de redding van transplanteerbare borstanlage voorkomt. Verder willen onderzoekers vaak onderzoek doen naar de rollen van de twee verschillende compartimenten, die zijn afgeleid van stamgebonden voorlopercellen. Hoewel Cre-lox-technologie differentiële genetische manipulatie van MyoECs en LEC's mogelijk maakt, is dit ook een tijdrovende en dure onderneming. Sinds de jaren vijftig hebben onderzoekers dus in vitro borstorganoïden gebruikt als een relatief eenvoudige en efficiënte manier om vragen over de structuur van het borstweefsel en functie6,7aan te pakken.
In vroege protocollen die de isolatie en de cultuur van primaire borstepitheelcellen beschrijven, vonden de onderzoekers dat een demembraanmatrijmat (BME), die uit een plasmastolsel en kippenembryouittreksel wordt samengesteld, voor mg fragmenten nodig was die op een schotel worden gekweekt6. In de volgende decennia werden extracellulaire matrices (EPM's, collageen en geleiachtige eiwitmatrix, uitgescheiden door Engelbreth-Holm-Swarm murine sarcoomcellen) ontwikkeld om de 3D-cultuur te vergemakkelijken en de in vivo omgeving7,8,,9,10beter na te bootsen. Kweekcellen in 3D-matrices onthulddoor meerdere criteria (morfologie, genexpressie en hormoonresponsiviteit) dat een dergelijke micro-omgeving betere modellen in vivo fysiologische processen9,10,11,12. Onderzoek met primaire murinecellen identificeerde belangrijke groeifactoren en morfogenen die nodig zijn voor het uitgebreide onderhoud en de differentiatie van organoïden13. Deze studies hebben het podium voor het protocol hier gepresenteerd, en voor de cultuur van menselijke borstcellen als 3D-organoïden, dat is nu een modern klinisch instrument, waardoor de ontdekking van geneesmiddelen en drugs testen op patiënt monsters14. Over het algemeen benadrukt organoïde kweekde de zelforganisatiecapaciteiten van primaire cellen en hun bijdragen aan morfogenese en differentiatie.
Hier gepresenteerd is een protocol om de cultuur murine epithelia die kan worden gedifferentieerd in melkproducerende acini. Een differentiële trypsinisatietechniek wordt gebruikt om de MyoECs en LEC's te isoleren die de twee verschillende MG-celcompartimenten omvatten. Deze gescheiden celfracties kunnen dan genetisch worden gemanipuleerd om de genfunctie te overexpresseren of neer te halen. Omdat afstamming-intrinsieke, zelforganisatie is een aangeboren eigenschap van borstepitheelcellen15,16,17, recombining deze celfracties kunnen onderzoekers om tweelaagse, mozaïek organoïden te genereren. We beginnen met enzymatisch verteren van het vetweefsel, en vervolgens het uitbroeden van de borstfragmenten op een weefsel kweekschotel voor 24 uur (Figuur 1). De weefselfragmenten vestigen zich op polystyreengerechten als tweelaagse fragmenten met hun in vivo organisatie: buitenste myoepitheellaag rond binnenarmatuurlagen. Deze cellulaire organisatie zorgt voor de isolatie van de buitenste MyoECs door trypsin-EDTA (0,05%) behandeling voor 3-6 min gevolgd door een tweede ronde trypsin-EDTA (0,05%) behandeling die de resterende binnenste LEC's losmaakt(figuur 2). Zo worden deze celtypen met verschillende trypsinegevoeligheid geïsoleerd en vervolgens gemengd en verguld in ECM(figuur 3). De cellen ondergaan zelforganisatie om tweelagige bollen te vormen, bestaande uit een buitenste laag MyoECs rond innerlijke LEC's. Lumenvorming treedt op als de cellen groeien in een medium met een cocktail van groeifactoren (zie recepten voor Growth Medium)13. Na 5 dagen kunnen organoïden worden onderscheiden in melkproducerende acini door over te schakelen op Alveologenesis Medium (zie recepten en figuur 3F)en nog 5 dagen geïncubeerd. Als alternatief zullen organoïden blijven uitbreiden en vertakken in Growth Medium gedurende ten minste 10 dagen. Organoïden kunnen worden geanalyseerd met behulp van immunofluorescentie(figuur 3D-F)of vrijgegeven uit de ECM met behulp van een hersteloplossing (zie Tabel met materialen)en geanalyseerd via andere methoden (bijvoorbeeld immunoblot, RT-qPCR).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
Alle hier beschreven methoden zijn goedgekeurd door het Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) van de University of California, Santa Cruz.
1. Dag 1: Borstkliervertering
- Bereid je voor om de MG's te oogsten van volwassen vrouwelijke muizen van 10-14 weken oud.
- Voer de oogst uit op een open bank onder aseptische omstandigheden.
- Steriliseren alle chirurgische benodigdheden, kurk planken, en pinnen door autoclaving en weken in 70% alcohol voor 20 minuten voorafgaand aan de operatie.
- Verdovende dieren met natriumpentobarbital (2X verdovingsdosis van 0,06 mg/g lichaamsgewicht) geleverd via intraperitoneale injectie met een 0,5 mL insulinespuit.
- Controleer het niveau van anesthesie door de tenen van het dier te knijpen om te controleren op een reflexrespons en begin het protocol pas nadat het dier volledig is verdoofd.
- Plaats het dier op zijn rug, speld zijn aanhangsels aan het kurkbord en veeg zijn buik en borst af met ethanol.
- Om de #2, 3, 4 en 5 MG's van één muis te oogsten (d.w.z. 8 MG's, figuur 1A),de middellijn tussen de twee achterpoten te identificeren en een kleine incisie (1 cm) op de buikhuid te maken met een scherpe schaar, strek de snede vervolgens uit tot de nek18.
- Volg door het maken van kleine bezuinigingen lateraal naar de benen en armen om het mogelijk te maken voor het vrijkomen van de huid met behulp van een wattenstaafje. Trek de huid weg en strek het strak voordat u hem aan één kant vastmaakt(figuur 1B, stap 1)18. Verwijder de MG's door eronder te snijden en verwijder de lymfeklieren uit de #4 klieren(figuur 1B, stappen 2, 3)18. Herhaal de procedure aan de andere kant van het lichaam.
- Verzamel het MG-weefsel in 50 mL van 4 °C Dulbecco's Modified Eagle's Media (DMEM)/Nutrient Mixture F12 (F12) aangevuld met 5% foetaal runderserum (FBS) en 1X Antibioticum-Antimycotisch (Anti-Anti)18.
- Hak de klieren in een schotel van 35 mm of op een keramische plaat met behulp van een scheermesje of weefselchopper. Draai de plaat om de vijf handmatige karbonades of elke ronde op de weefselhakselaar totdat de weefselstukken gemakkelijk door een micropipettip van 1 mL kunnen passen (~ 0,1 mm/fragment, figuur 1C).
- Vertoter de MG's in Digestie Medium (zie tabel 1) gedurende 14 uur in een 6 goed lage hechtingsschaal bij 37 °C, 5% CO2.
2. Dag 2: Isolatie van borstepitheelweefselfragmenten
- Na 14 uur van de spijsvertering, voorzichtig mengen door pipetteren het verteerd weefsel 10X met behulp van een 1 mL micropipette af te breken eventuele resterende stroma of vetweefsel, ervoor te zorgen dat noch bubbels of overtollige mechanische kracht worden gegenereerd.
OPMERKING: Als er onvolledige spijsvertering na 14 uur, kan dit te wijten zijn aan de accumulatie van geschuwd DNA. Voeg in dit geval 1 μL van 1 mg/mL deoxyribonuclease I (DNase I) per 2 mL digestiemedium toe. Incubeer nog eens 30 min bij 37 °C, 5% CO2. - Verzamel weefsel in een buis van 15 mL en spoel de goed gebruikte voor de spijsvertering met 2-3 mL weefselkweek graad 1X Dulbecco's Fosfaat buffered Saline (DPBS) vrij van Ca2 + en Mg2 +. Centrifuge bij 600 x g gedurende 10 min.
- Evacueer de supernatant met de lipidelaag en het medium en zet de pellet vervolgens opnieuw op in 5 mL DPBS en schakel over op een nieuwe 15 mL-buis. Centrifuge bij 600 x g gedurende 10 min.
- Tijdens de centrifugatie plaats een 70 μm nylon cel zeef in een 50 mL buis en prewet de zeef met behulp van 10 mL van 37 °C DMEM/F12.
- Hersuspendeer weefselfragmenten van protocol stap 2.4 met 5 mL DPBS en geef de suspensie door een prewet 70 μm nylon celzeef om stromalcellen en enkele cellen te verwijderen(figuur 1D).
- Verzamel de weefselfragmenten op de celzeef. Spoel 4X af met 10 mL van 37 °C DMEM/F12 (figuur 1D).
LET OP: Onvolledige spoeling zal resulteren in culturen besmet met niet-epitheelcellen. - Laat de weefselfragmenten los door het zeeftabblad met gehandschoende vingers vast te houden, de zeef over een weefselkweekschaal van 60 mm om te keren en 1 mL aliquots van Maintenance Medium (zie tabel 1)door de onderkant van de zeef 4X (figuur 1E )te laten gaan.
- Controleer de zeef op weefselfragmentresten, die met het blote oog zichtbaar zullen zijn, en spoel de zeef 1X meer af met 1 mL Onderhoudsmedium als er nog fragmenten aan de zeef kleven. De gespoelde weefselfragmenten moeten nu vrij zijn van stromalcellen.
- Onderzoek snel de 60 mm schotel met de MG-fragmenten uit protocolstap 2.9 onder een omgekeerde microscoop (4X of 10X-doelstelling, figuur 1F). Een typische voorbereiding van acht MG's levert ~500 fragmenten op. Kijk voor enkele cellen of vetdruppels en of er vervuilende cellen.
OPMERKING: Als er vervuilende cellen zijn, herhaal tu de filtratiestap door het medium en de fragmenten uit de 60 mm schotel te verzamelen met behulp van een 5 mL pipet en het fragment opnieuw te filteren door middel van een verse zeef van 70 μm, herhalenprotocolstappen 2.6, 2.8-2.10. - Incubeer 24 uur bij 37 °C, 5% CO2, waardoor het weefselfragment zich kan hechten en tweelaagse fragmenten kan genereren (figuur 2A).
OPMERKING: Als de fragmenten niet zijn verrekend door 24 uur, blijven uitbroeden totdat nageleefd. Als de fragmenten niet goed hechten, zal de scheiding van de celcompartimenten niet werken. Als onderzoekers zich zorgen maken over hechting, kunnen de weefselkweekplaten worden behandeld om fragmentgehechtheid te bevorderen (bijvoorbeeld poly-L-lysine).
3. Dag 3: Differentiële trypsinisatie van myoepitheel- en luminale epitheelcellen
- Om MyoECs van LECs te scheiden, de media van de schotel te legen, 1x te spoelen met 1 mL DPBS en 1 mL verse trypsin-EDTA (0,05%) toe te voegen en de spijsvertering zorgvuldig te controleren onder een omgekeerde microscoop (10X of 20X doelstelling, figuur 2B,C,F). Het onthechting van de buitenste MyoEC-laag vereist 3-6 min, afhankelijk van trypsin-EDTA (0,05%) Kracht.
LET OP: Zie figuur 2 voor representatieve afbeeldingen die dit proces weergeven. Onder brightfield verlichting, de MyoECs verschijnen afgerond en hebben een helderder uiterlijk in vergelijking met de LECs, die blijven gehecht in het midden en donkerder lijken. - Verzamel de MyoEC-fractie in een 15 mL-buis met 2 mL 10% FBS/DPBS. Zonder de LECs te storen, spoel de 60 mm schotel voorzichtig af met 2 mL DPBS en gooi vervolgens de DPBS(figuur 2H-I) weg.
OPMERKING: Het gebruikelijke herstel voor MyoECs is binnen een bereik van (3,5 x 106-1,5 x 106),afhankelijk van de grootte van de MG's. - Als u de LEC-fractie wilt verwijderen, voegt u 1 mL trypsin-EDTA (0,05%) toe aan de schotel opnieuw en incubeer 7-15 min, zorgvuldig te controleren om overdigestie te voorkomen. Doof de trypsin-EDTA (0,05%) op de schotel met 2 mL van 10% FBS/DPBS. Verzamel de LEC-fractie in een nieuwe 15 mL buis.
OPMERKING: Het gebruikelijke herstel voor LECs is binnen een bereik (2 x 106-4,2 x 106)afhankelijk van de grootte van de MG's. Routinematig is de zuiverheid van beide fracties zoals uitgeschreven door immunohistochemie ~ 90%19 (Figuur 2E). - Centrifugeer elke fractie gedurende 5 min bij 300 x g om de trypsin-EDTA (0,05%) te verwijderen. Resuspend de pellet in 250 μL onderhoudsmedium en tel elke celpopulatie met behulp van een hemocytometer of geautomatiseerde celteller. Plaats de cellen op ijs tijdens het tellen.
OPMERKING: Als genetische manipulatie van de celfracties gewenst is, kunnen primaire cellen worden gekweekt op lage hechtingsschalen en besmet zijn met lentivirus20.
4. Dag 3: Celfracties combineren en insluiten in een extracellulaire matrix
OPMERKING: Zodra de MyoEC- en LEC-fracties zijn verzameld en geteld, kunnen ze worden gecombineerd. De typische MyoEC/LEC ratio is 1:3 (Figuur 3A)19. Verschillende studies kunnen worden uitgevoerd. Om bijvoorbeeld mozaïekstudies uit te voeren, kunnen breuken worden gegenereerd uit wilde type (WT) en gemuteerde (Mut) muizen en gecombineerd (MyoEC/LEC: WT/WT; WT/Mut; Mut/WT; Mut/mut)21, of breuken kunnen worden gecombineerd met behulp van verschillende verhoudingen van MyoECs /LEC's19.
- Bereken op basis van celtellingen het aantal putten (8 putkamer, zie Materiaaltabel)die moeten worden voorbereid op 12.000 cellen/putten (bijvoorbeeld 3.000 MyoECs:9.000 LECs).
- Leg de basislaag voor 3D-cultuur vast door 90 μL van 50% ECM (50% ECM/50% DMEM/F12, zonder fenolrood - zie de Tabel met Materialen) aan elke put toe te voegen. Zorg ervoor dat er geen bubbels en de putten gelijkmatig zijn gecoat. Om de basislaag te stollen, broedt u de glijbanen uit bij 37 °C, 5% CO2 gedurende 30 min.
OPMERKING: De ECM moet ijskoud blijven tot deze stap, anders zal het voortijdig polymeriseren en leiden tot ongelijke basiscoating en polymerisatie. Met behulp van een basis ecm verbetert organoïde groei in een enkel vlak, die helpt beeld vast te leggen. Dit verkrijgt ook een snellere organoïde groei en gebruikt minder ECM22. - Bereid tijdens polymerisatie de celmixen voor. Pellet de MyoEC en LEC fracties op 300 x g voor 5 min en opnieuw opschorten elke celfractie in 10% ECM/90% Groei Medium, zodat elke put heeft 100 μL (zie tabel 1 voor hoe groei medium te maken).
OPMERKING: Voor het gemak van voorbereiding, repliceren putten met behulp van dezelfde cel mixen. Deze kunnen worden gecombineerd en bereid in één buis (bijvoorbeeld vier putten van dezelfde celmix kunnen worden bereid in 400 μL van 10% ECM/90% Growth Medium). - Voeg 100 μL van elke celmix toe in 10% ECM/90% Groeimedium aan elke put en laat organoïden genoegen nemen met 20 min bij 37 °C, 5% CO2.
- Zodra de cellen zijn neergestreken, voeg voorzichtig 100 μL growth medium toe door zachtjes de kamerwand van elke put af te stampen. Bebroed de dia's bij 37 °C, 5% CO2 (zie figuur 3A voor de totale samenstelling van elke put).
OPMERKING: De Rho Kinase-remmer, R-spondine en Nrg1 zijn factoren die als belangrijk zijn geïdentificeerd voor de langetermijncultuur van organoïden die zijn gekweekt uit zowel primaire mammarycellen als menselijke borstkankercellen13,14. Bovendien verlengen de stamcelfactoren B27 en N2 de tijd dat organoïden gekweekt kunnen worden. - Beeldcellen om de 24 uur om hun groei te volgen en het groeimedium elke 2-3 dagen voorzichtig te vernieuwen met behulp van 100 μL/well(figuur 3B-E).
OPMERKING: Gebruik extreme zorg bij het vernieuwen van het medium. Kantel de kamerdia's om het medium op een hoek van de putten te verzamelen. Verwijder ≤100 μL van het medium en vul voorzichtig aan om de ECM-laag ongestoord te laten. - Als onderzoekers geïnteresseerd zijn in het onderzoeken van lactatie/alveologenese, schakel dan op dag 5 over op Het Medium alveologenes (zie tabel 1)en blijft het medium elke 2-3 dagen vernieuwen tot dag 10 (figuur 3F) of verder door te worden doorgezeleer met behulp van hersteloplossing (zie de Tabel met materialen)13.
OPMERKING: Op dit punt kunnen organoïden van de ECM worden geïsoleerd door bij 4 °C te broeden bij 400 μL van 4 °C hersteloplossing (zie Tabel met materialen voor protocol- en reagensinfo).
5. Dag 5 of 10: Bevestiging en immunovlekken de organoïden
- Verwijder het medium voorzichtig door voorzichtig pipetteren uit de media (een lamp pipet werkt het beste). Spoel elke put af met 200 μL 1x Dulbecco's Fosfaatbufferde Zoutoplossing (DPBS, zie recepten).
- Bevestig de organoïden met koude (4 °C) 4% (w/v) paraformaldehyde (PFA, zie recepten) gedurende 10 min bij kamertemperatuur.
LET OP: PFA is gevaarlijk. Draag persoonlijke beschermingsmiddelen (labjas, handschoenen en veiligheidsbril). Deze stap moet worden uitgevoerd in een rookkap.
OPMERKING: De ECM wordt opgelost door de PFA-behandeling. Onvolledige ECM-verwijdering kan leiden tot achtergrondkleuring wanneer de organoïden worden geanalyseerd door immunofluorescentie. - Verwijder de PFA van 4% en voeg aan elke put 200 μL van 0,2% (w/v) glycine/DPBS (zie tabel 1)toe. Incubeer de glijbanen op kamertemperatuur gedurende 30 min of 4 °C 's nachts op een schommelende oppervlak ingesteld op een langzame instelling.
OPMERKING: De organoïden kunnen 1-3 dagen in DPBS bij 4 °C worden opgeslagen voor de volgende stap. - Permeabilize de organoïden met Behulp van DPBS + 0,25% Triton X-100 (PBST, zie tabel 1) gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur.
- Blokkeer de organoïden met 5% ezelsserum (DS) (of ander serum dat overeenkomt met de soort van het secundaire antilichaam) in DPBS gedurende 1 uur op een schommelend oppervlak.
LET OP: Deze stap kan 's nachts worden uitgevoerd bij 4 °C op een schommeloppervlak. - Bereid primaire antilichamen voor in 1% DS/DPBS. Gebruik 125-200 μL voor elke put. Immunostaining uitvoeren door de organoïden in het primaire antilichaam 's nachts bij 4 °C op een schommelend oppervlak uit te broeden.
6. Dag 11: Volledige immunofluorescentie
- Was elke put 2X met 200 μL PBST voor 5 min. Voeg secundair eis toe in 1% DS/DPBS met 125-200 μL voor elke put. Incubeer op kamertemperatuur op een schommeloppervlak gedurende 45 min.
- Was elke put 2X met 200 μL PBST per put.
- Besmet de kernen met behulp van Hoechst DNA kleurstof in DPBS (1:2,000 in DPBS) voor 5 min bij kamertemperatuur.
- Verwijder alle vloeistof links op de put door zachtjes te zuigen met een vacuüm.
- Verwijder voorzichtig de kamers en pakking, plaats een druppel (~ 30 μL) montagemedia (zie Tabel met materialen)op elke put en decoverslip, waarbij u ervoor zorgt dat bellen worden verwijderd. Laat de glijbaan 1-2 dagen drogen in een donkere ruimte. Seal met duidelijke nagellak. Beeld de organoïden op een confocale microscoop(figuur 3E-F).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Het hier gepresenteerde protocol beschrijft een methode voor het onderzoeken van specifieke afstammingsbijdragen van borstepitheelcellen door gebruik te maken van mozaïekorganoïden. Om primaire murinecellen voor organoïden te verkrijgen, moet het epiklierepitheel van de borstklier eerst worden geïsoleerd van de omringende adipocyterijke stroma(figuur 1). Dit proces wordt hier kort beschreven en wordt ook beschreven in een eerder gepubliceerde studie
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Hier wordt een methode gepresenteerd waarin wordt beschreven hoe onderzoekers 3D-organoïde culturen kunnen genereren met behulp van primaire MG-cellen. Het verschil tussen deze en andere protocollen is dat we een methode om de twee, verschillende MG celcompartimenten te scheiden detail: de buitenste basale MyoECs en innerlijke LECs. Onze methode maakt gebruik van een twee-staps trypsin-EDTA (0,05%) behandeling die we differentiële trypsinisatienoemen 19. Deze procedure stelt onderzoekers in staat ...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs hebben niets te onthullen.
Dankbetuigingen
Wij danken Ben Abrams voor technische bijstand en kernondersteuning van de University of California, Santa Cruz (UCSC) Institute for the Biology of Stem Cells (IBSC). Wij danken Susan Strome en Bill Saxton voor het gebruik van hun Solamere Spinning Disk Confocal Microscope. Dit werk werd gedeeltelijk ondersteund door subsidies aan UCSC van het Howard Hughes Medical Institute via het James H. Gilliam Fellowships for Advanced Study-programma (S.R.), van het NIH (NIH GM058903) voor het initiatief voor het maximaliseren van de ontwikkeling van studenten (H.M.) en van de National Science Foundation voor een graduate research fellowship (O.C. DGE 1339067) en door een beurs (A18-0370) van het UC-Cancer Research Coordinating Committee (LH).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| 15 ml High-Clarity Polypropylene Conical Tube (BD Falcon) | Fisher Scientific | 352096 | |
| 24 well ultra-low attachment plate (Corning) | Fisher Scientific | CLS3473-24EA | |
| 35 mm TC-treated Easy-Grip Style Cell Culture Dish (BD Falcon) | Fisher Scientific | 353001 | |
| 50 ml High-Clarity polypropylene conical tube (BD Falcon) | Fisher Scientific | 352098 | |
| 60 mm TC-treated Easy-Grip Style Cell Culture Dish (BD Falcon) | Fisher Scientific | 353004 | |
| 70 µM nylon cell strainer (Corning) | Fisher Scientific | 08-771-2 | |
| Antibiotic-Antimycotic (100X) | Thermo Fisher Scientific | 15240062 | Pen/Strep also works |
| B27 supplement without vitamin A (50x) | Thermo Fisher Scientific | 12587010 | |
| B6 ACTb-EGFP mice | The Jackson Laboratory | 003291 | |
| BD Insulin syringe 0.5 mL | Thermo Fisher Scientific | 14-826-79 | |
| Class 2 Dispase (Roche) | Millipore Sigma | 4942078001 | |
| Class 3 Collagenase | Worthington Biochemical | LS004206 | |
| Corning Cell Recovery solution | Fisher Scientific | 354253 | Follow the guidelines for use – Extraction of Three-Dimensional Structures from Corning Matrigel Matrix |
| Corning Costar Ultra-Low Attachment 6-well | Fisher Scientific | CLS3471 | |
| Dexamethasone | Millipore Sigma | D4902-25MG | |
| DMEM/F12, no phenol red | Thermo Fisher Scientific | 11039-021 | |
| DNase (Deoxyribonuclease I) | Worthington Biochemical | LS002007 | |
| Donkey anti-Goat 647 | Thermo Fisher Scientific | A21447 | Use at 1:500, Lot: 1608641, stock 2 mg/mL, RRID:AB_2535864 |
| Donkey anti-Mouse 647 | Jackson ImmunoResearch | 715-606-150 | Use at 1:1000, Lot: 140554, stock 1.4 mg/mL |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium: Nutrient Mixture F-12 (DMEM/F12) | Thermo Fisher Scientific | 11330-057 | |
| Dulbecco's phosphate-buffered saline (DPBS) | Thermo Fisher Scientific | 14190-250 | Without Mg2+/Ca2+ |
| EGF | Fisher Scientific | AF-100-15-100ug | |
| Fetal Bovine Serum | VWR | 97068–085 | 100% US Origin, premium grade, Lot: 059B18 |
| Fluoromount-G (Southern Biotech) | Fisher Scientific | 0100-01 | Referred to as mounting media in text |
| Gentamicin | Thermo Fisher Scientific | 15710064 | |
| Glycine | Fisher Scientific | BP381-5 | |
| Goat anti-WAP | Santa Cruz Biotech | SC-14832 | Use at 1:250, Lot: J1011, stock 200 µg/mL, RRID:AB_677601 |
| Hoechst 33342 | AnaSpec | AS-83218 | Use 1:2000, stock is 20mM |
| Insulin | Millipore Sigma | I6634-100mg | |
| KCl | Fisher Scientific | P217-500 | |
| KH2PO4 | Fisher Scientific | P285-500 | |
| KRT14–CreERtam | The Jackson Laboratory | 5107 | |
| Matrigel Growth Factor Reduced (GFR); Phenol Red-Free; 10 mL | Fisher Scientific | CB-40230C | Lot: 8204010, stock concentration 8.9 mg/mL |
| MillexGV Filter Unit 0.22 µm | Millipore Sigma | SLGV033RS | |
| Millicell EZ SLIDE 8-well glass, sterile | Millipore Sigma | PEZGS0816 | These chamber slides are great for gasket removal but other brands can work well (e.g. Lab Tek II). |
| Mouse anti-SMA | Millipore Sigma | A2547 | Use at 1:500, Lot: 128M4881V, stock 5.2 mg/mL, RRID:AB_476701 |
| N-2 Supplement (100x) | Thermo Fisher Scientific | 17502048 | |
| NaCl | Fisher Scientific | S671-3 | |
| NaH2PO4 | Fisher Scientific | S468-500 | |
| Nrg1 | R&D | 5898-NR-050 | |
| Ovine Pituitary Prolactin | National Hormone and Peptide Program | Purchased from Dr. Parlow at Harbor-UCLA Research and Education Institute | |
| Paraformaldahyde | Millipore Sigma | PX0055-3 | |
| Pentobarbital | Millipore Sigma | P3761 | |
| R26R-EYFP | The Jackson Laboratory | 6148 | |
| Rho inhibitor Y-27632 | Tocris | 1254 | |
| R-spondin | Peprotech | 120-38 | |
| Sodium Hydroxide | Fisher Scientific | S318-500 | |
| Sterile Filtered Donkey Serum | Equitech-Bio Inc. | SD30-0500 | |
| Sterile Filtered Donkey Serum | Equitech-Bio Inc. | SD30-0500 | |
| Triton X-100 | Millipore Sigma | x100-500ML | Laboratory grade |
| Trypsin EDTA 0.05% | Thermo Fisher Scientific | 25300-062 |
Referenties
- Macias, H., Hinck, L. Mammary gland development. Wiley Interdisciplinary Reviews in Developmental Biology. 1 (4), 533-557 (2012).
- Daniel, C. W., De Ome, K. B., Young, J. T., Blair, P. B., Faulkin, L. J. Jr The in vivo life span of normal and preneoplastic mouse mammary glands: a serial transplantation study. Proceedings of the National Academy of Science U S A. 61 (1), 53-60 (1968).
- Ip, M. M., Asch, B. B. Methods in Mammary Gland Biology and Breast Cancer Research. , Kluwer Academic/Plenum Publishers. (2000).
- Shackleton, M., et al. Generation of a functional mammary gland from a single stem cell. Nature. 439 (7072), 84-88 (2006).
- Stingl, J., et al. Purification and unique properties of mammary epithelial stem cells. Nature. 439 (7079), 993-997 (2006).
- Lasfargues, E. Y. Cultivation and behavior in vitro of the normal mammary epithelium of the adult mouse. II. Observations on the secretory activity. Experimental Cell Research. 13 (3), 553-562 (1957).
- Simian, M., Bissell, M. J. Organoids: A historical perspective of thinking in three dimensions. Journal of Cell Biology. 216 (1), 31-40 (2017).
- Orkin, R. W., et al. A murine tumor producing a matrix of basement membrane. Journal of Experimental Medicine. 145 (1), 204-220 (1977).
- Lee, E. Y., Parry, G., Bissell, M. J. Modulation of secreted proteins of mouse mammary epithelial cells by the collagenous substrata. Journal of Cell Biology. 98 (1), 146-155 (1984).
- Lee, E. Y., Lee, W. H., Kaetzel, C. S., Parry, G., Bissell, M. J. Interaction of mouse mammary epithelial cells with collagen substrata: regulation of casein gene expression and secretion. Proceedings of the National Academy of Science U S A. 82 (5), 1419-1423 (1985).
- Bissell, M. J., Barcellos-Hoff, M. H. The influence of extracellular matrix on gene expression: is structure the message? Journal of Cell Science. 8 (Suppl), 327-343 (1987).
- Petersen, O. W., Ronnov-Jessen, L., Howlett, A. R., Bissell, M. J. Interaction with basement membrane serves to rapidly distinguish growth and differentiation pattern of normal and malignant human breast epithelial cells. Proceedings of the National Academy of Science U S A. 89 (19), 9064-9068 (1992).
- Jarde, T., et al. Wnt and Neuregulin1/ErbB signalling extends 3D culture of hormone responsive mammary organoids. Nature Commununications. 7, 13207(2016).
- Sachs, N., et al. A Living Biobank of Breast Cancer Organoids Captures Disease Heterogeneity. Cell. 172 (1-2), 373-386 (2018).
- Daniel, C. W., Strickland, P., Friedmann, Y. Expression and functional role of E- and P-cadherins in mouse mammary ductal morphogenesis and growth. Developmental Biology. 169 (2), 511-519 (1995).
- Runswick, S. K., O'Hare, M. J., Jones, L., Streuli, C. H., Garrod, D. R. Desmosomal adhesion regulates epithelial morphogenesis and cell positioning. Nature Cell Biology. 3 (9), 823-830 (2001).
- Chanson, L., et al. Self-organization is a dynamic and lineage-intrinsic property of mammary epithelial cells. Proceedings of the National Academy of Science U S A. 108 (8), 3264-3269 (2011).
- Honvo-Houeto, E., Truchet, S. Indirect Immunofluorescence on Frozen Sections of Mouse Mammary Gland. Journal of Visualized Experiments. (106), e53179(2015).
- Macias, H., et al. SLIT/ROBO1 signaling suppresses mammary branching morphogenesis by limiting basal cell number. Developmental Cell. 20 (6), 827-840 (2011).
- Welm, B. E., Dijkgraaf, G. J., Bledau, A. S., Welm, A. L., Werb, Z. Lentiviral transduction of mammary stem cells for analysis of gene function during development and cancer. Cell Stem Cell. 2 (1), 90-102 (2008).
- Smith, P., et al. VANGL2 regulates luminal epithelial organization and cell turnover in the mammary gland. Scientific Reports. 9 (1), 7079(2019).
- Lee, G. Y., Kenny, P. A., Lee, E. H., Bissell, M. J. Three-dimensional culture models of normal and malignant breast epithelial cells. Nature Methods. 4 (4), 359-365 (2007).
- Campbell, J. J., Davidenko, N., Caffarel, M. M., Cameron, R. E., Watson, C. J. A multifunctional 3D co-culture system for studies of mammary tissue morphogenesis and stem cell biology. PLoS One. 6 (9), e25661(2011).
- Labarge, M. A., Garbe, J. C., Stampfer, M. R. Processing of human reduction mammoplasty and mastectomy tissues for cell culture. Journal of Visualized Experiments. (71), e50011(2013).
- Marlow, R., Dontu, G. Modeling the breast cancer bone metastatic niche in complex three-dimensional cocultures. Methods in Molecular Biology. 1293, 213-220 (2015).
- Koledova, Z., Lu, P. A 3D Fibroblast-Epithelium Co-culture Model for Understanding Microenvironmental Role in Branching Morphogenesis of the Mammary Gland. Methods in Molecular Biology. 1501, 217-231 (2017).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
