Methodenartikel

Kwantificerende levergrootte bij larvale zebravissen met behulp van Brightfield Microscopie

DOI:

10.3791/60744

⸱

2 februari 2020

 ,  ,  , 
1Department of Pathology, Department of Oncological Sciences, and Huntsman Cancer Institute, University of Utah School of Medicine

* These authors contributed equally

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hier demonstreren we een methode voor het kwantificeren van levergrootte bij larve zebravissen, die een manier bieden om de effecten van genetische en farmacologische manipulaties op levergroei en ontwikkeling te beoordelen.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

In verschillende transgene zebravismodellen van hepatocellulair carcinoma (HCC) kunnen hepatomegaly worden waargenomen tijdens vroege larvestadia. Het kwantificeren van de larve levergrootte bij zebravis HCC-modellen biedt een middel om snel de effecten van geneesmiddelen en andere manipulaties op een oncogene-gerelateerd fenotype te beoordelen. Hier laten we zien hoe ze zebravislarven kunnen fixeren, de weefsels rond de lever ontleden, levers fotograferen met behulp van heldere microscopie, levergebied meten en resultaten analyseren. Dit protocol maakt een snelle, nauwkeurige kwantificering van de levergrootte mogelijk. Aangezien deze methode het meten van levergebied omvat, kan het verschillen in levervolume onderschatten, en de aanvullende methodologieën zijn vereist om tussen veranderingen in celgrootte en veranderingen in celaantal te onderscheiden. De dissectie techniek hierbeschreven is een uitstekend hulpmiddel om de lever, darm en alvleesklier te visualiseren in hun natuurlijke posities voor talloze downstream toepassingen, waaronder immunofluorescentie kleuring en in situ hybridisatie. De beschreven strategie voor het kwantificeren van de grootte van de larvelever is van toepassing op vele aspecten van leverontwikkeling en regeneratie.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hepatocellulair carcinoma (HCC) is de meest voorkomende primaire maligniteit van de lever1 en de derde belangrijkste oorzaak van kankergerelateerde sterfte2. Om mechanismen van hepatocarcinogenese beter te begrijpen en potentiële HCC-therapieën te identificeren, hebben wij en anderen transgene zebravis ontwikkeld waarin hepatocyte-specifieke expressie van oncogenes zoals β-catenine3,4, Kras(V12)5,6, Myc7of Yap18 leidt tot HCC bij volwassen dieren. Bij deze zebravis wordt leververgroting al op 6 dagen na de bevruchting (dpf) opgemerkt, waardoor een facile-platform wordt geboden voor het testen van de effecten van geneesmiddelen en genetische veranderingen op oncogene aangedreven leverbegroeiing. Nauwkeurige en nauwkeurige meting van de grootte van de larvelever is essentieel voor het bepalen van de effecten van deze manipulaties.

Levergrootte en -vorm kunnen semi-kwantitatief worden beoordeeld in vaste zebravislarven door CY3-SAlabeling 9 of in levende zebravislarven met behulp van hepatocyte-specifieke fluorescerende verslaggevers en fluorescentie ontledenmicroscopie5,6. Deze laatste methode is relatief snel en het gebrek aan precisie kan worden aangepakt door het gebied van elke lever te fotograferen en te meten met behulp van beeldverwerkingssoftware7,10. Het kan echter technisch uitdagend zijn om alle levende larven uniform te positioneren in een experiment zodanig dat tweedimensionaal levergebied een nauwkeurige weergave is van levergrootte. Een soortgelijke techniek voor het kwantificeren van de levergrootte omvat het gebruik van lichtplaatfluorescentiemicroscopie om larve levervolume8te kwantificeren, die nauwkeuriger kan zijn voor het detecteren van grootteverschillen wanneer de lever niet-uniform in verschillende dimensies wordt uitgebreid. Fluorescentie-geactiveerde celsortering (FACS) kan worden gebruikt om het aantal fluorescerende gelabelde hepatocyten en andere leverceltypes in larvelevers8,11te tellen. Bij deze methode worden larvelevers samengevoegd en gescheiden, zodat informatie over individuele levergrootte en -vorm verloren gaat. In combinatie met een andere levergroottebepalingsmethode maakt FACS differentiatie mogelijk tussen verhoogd celgetal (hyperplasie) en verhoogde celgrootte (hypertrofie). Al deze methoden maken gebruik van dure fluorescentietechnologie (microscoop of celsorteerder) en, met uitzondering van CY3-SA-etikettering, vereisen etikettering van hepatocyten met een fluorescerende verslaggever.

Hier beschrijven we in detail een methode voor het kwantificeren van zebravissen larve lever gebied met behulp van bright-field microscopie en beeldverwerking software3,12,13,14. Dit protocol maakt nauwkeurige kwantificering van het gebied van individuele levers ter plaatse mogelijk zonder het gebruik van fluorescentiemicroscopie. Tijdens het analyseren van levergrootte, verblinden we de beeldidentiteit om de vooringenomenheid van onderzoekers te verminderen en wetenschappelijke strengheid te verbeteren15.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dierstudies worden uitgevoerd volgens procedures die zijn goedgekeurd door het Institutioneel Comité voor dierenverzorging en -gebruik (IACUC) van de Universiteit van Utah.

1. Vaststelling van larven

  1. Op 3-7 dagen na de bevruchting (dpf), euthanaseren larven met tricaine methaansulfonaat (0,03%) en verzamel tot 15 larven in een buis van 2 mL met behulp van een glazen pipet- en pipetpomp.
  2. Was larven twee maal met 1 mL koude (4 °C) 1x fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) op ijs. Verwijder voor elke wasbeurt zoveel mogelijk vloeistof uit de buis met een glazen pipet- en pipetpomp en voeg vervolgens 1 mL koude PBS toe aan de buis.
  3. Verwijder zoveel PBS mogelijk met behulp van een glazen pipet en pipet pomp, en voeg 1 mL koud (4 °C) 4% paraformaldehyde (PFA) in PBS.
    LET OP: PFA is een irriterende en vermoedelijke kankerverwekkende stof. Handschoenen moeten worden gedragen bij het hanteren van PFA, en geconcentreerde oplossingen moeten worden behandeld in een chemische rookkap.
  4. Incubeer op 4 °C ten minste 's nachts (maar tot enkele maanden) met zacht schommelen.

2. Ontleden weefsels rond lever

  1. Verwijder larven uit PFA door 3x te spoelen met 1 mL koude (4 °C) PBS en schommel gedurende 5 min tussen spoelingen door.
    LET OP: Het is goed om de gespoelde larven in PBS een dag of twee bij 4 °C te houden.
  2. Pipeter verschillende larven in PBS in een put van een 9-goed ronde-bodem glazen schotel.
  3. Verwijder de huid omringende lever.
    1. Gebruik fijne tangen om larve op zijn rug te houden (buik omhoog), grijpen aan weerszijden van het hoofd zo voorzichtig mogelijk. Gebruik dan zeer fijne tangen in je andere hand om de huid te grijpen net boven het hart.
    2. Trek de huid diagonaal naar beneden naar de staart van de vis en de onderkant van de schotel aan de linker- of rechterkant van de vis. Herhaal dit voor de andere kant (rechts of linkerkant).
    3. Doorgaan grijpen flappen van de huid en trekken naar beneden / terug totdat alle van de huid en melanophores bovenliggendof in de buurt van de lever zijn verwijderd.
  4. Verwijder dooier, indien aanwezig.
    1. Voor 5-6 dpf larven, til dooier af in een stuk door het houden van de vis met fijne tangen op zijn rug en met behulp van de zeer fijne tangen om de dooier zachtjes prik.
    2. Voor 3-4 dpf larven, schraap de dooier af in stukken. Houd de vis met fijne tangen op zijn rug en gebruik de zeer fijne tangen om de dooier aaien, vanaf de ventrale kant.
  5. Plaats ontleedlarven in verse koude PBS met behulp van een glazen pipet en pipet pomp.

3. Beeldvorming

  1. Om larven te monteren, giet een paar mL van 3% methylcellulose op het deksel van een schone plastic petrischaal.
  2. Gebruik een glazen pipet en pipetpomp om larven toe te voegen aan de methylcellulose, en voeg zo weinig MOGELIJK PBS toe met de larven.
  3. Onder een ontledende microscoop bij lage vergroting, gebruik fijne tangen om de vissen te oriënteren, zodat ze tot aan hun rechterkant, naar links.
    LET OP: Zorg ervoor dat de vissen perfect zijn gericht op hun kant of de lever metingen kunnen niet nauwkeurig zijn.
  4. Maak een foto van elke vis.
    1. Bevestig dat de te fotograferen vis perfect is uitgelijnd, met het ene oog direct op het andere oog. Gebruik indien nodig fijne tangen om licht op kop of staart van vissen te tikken om de oriëntatie aan te passen. Als de staart van vissen is gebogen, verwijder de staart door het krachtig met kracht te knijpen om het te verwijderen zodat de vissen plat legt.
    2. Zoom in op hoge vergroting en focus op de lever, ervoor te zorgen dat de lever omtrek is duidelijk zichtbaar.
    3. Maak een afbeelding vast en sla het bestand op.
    4. Herhaal voor alle vissen, ervoor te zorgen dat de vergroting is hetzelfde voor elke foto.
    5. Maak een foto van een micrometer met dezelfde vergroting (zie figuur 2H).

4. Beeldanalyse

  1. Meet het gebied van de lever van elke vis met behulp van beeldverwerkingssoftware.
    1. Blind alle lever foto's om potentiële onderzoeker bias te voorkomen en wetenschappelijke strengheid te bevorderen15. Deze stap kan handmatig worden gedaan door een ander lablid of met behulp van een computerprogramma(Aanvullend Materiaal). Wijzig de naam van bestanden willekeurig en maak een "randomisatiebestand" met een lijst met de oorspronkelijke bestandsnamen en bijbehorende geblindeerde bestandsnamen.
    2. Open gerandomiseerde bestanden in volgorde, te beginnen met bestand 1.
    3. Kies de vrije hand selecties tool en schets elke lever.
    4. Druk op Ctrl-M om het gebied van elke lever te meten.
    5. Voor levers die niet nauwkeurig kunnen worden gemeten, voegt u een tijdelijke aanduidingmeting in (zeer klein of zeer groot, zodat deze later gemakkelijk kan worden uitgesloten).
    6. Sla de metingen op in een tekstbestand ('meetbestand').
  2. Blind en analyseren van gegevens
    1. Open "meetbestand" en "randomisatiebestand" in een spreadsheetprogramma.
    2. Voeg een nieuwe kolom in het "meetbestand" in en voeg de oorspronkelijke bestandsnamen voor de geblindeerde bestanden toe met behulp van het "randomisatiebestand". Sla dit bestand op als 'ongeblindeerd meetbestand'.
    3. Sorteer gegevens op oorspronkelijke bestandsnaam.
    4. Zorg ervoor dat u levermetingen uitsluit waarvoor foto's ontoereikend waren (zie figuur 2A–G).
    5. Zet indien nodig meetwaarden om in gewenste schaal (mm2, bijvoorbeeld).
      1. Open de schaalbalk in de beeldverwerkingssoftware.
      2. Gebruik het rechte lijngereedschap om 1 mm te meten op de schaalbalk. De beeldverwerkingssoftware meet in dezelfde eenheden als de levers (pixels), waardoor een conversiefactor wordt gegeven.
      3. Gebruik de conversiefactor om metingen om te zetten in het "ongeblindeerde meetbestand".
    6. Met behulp van het spreadsheetprogramma of het plakken van gegevens in een wetenschappelijke grafiek- en statistieksoftware, bepaal je gemiddelde en standaarddeviatie en bereken je p-waarde(s).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Transgene zebravissen die hepatocyte-specifieke geactiveerde β-catenine uitdrukken (Tg (fabp10a:pt-β-cat) zebravis)3 en niet-transgene controle broers en zussen werden geëuthanaseerd op 6 dpf en lever gebied werd gekwantificeerd met behulp van brightfield microscopie en beeldverwerking software. Transgene zebravissen hebben de levergrootte aanzienlijk vergroot (0,0006 cm2)in vergelijking met hun niet-transgene broers en zussen (0,0004 cm2, p < 0,000...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Kwantificering van levergrootte is cruciaal in studies gericht op het begrijpen van leverontwikkeling, regeneratie en oncogenese. Het hier beschreven protocol is een relatief snelle, gemakkelijke en goedkope techniek voor levergroottekwantificering bij larve zebravissen. Het uitoefenen van de nodige voorzichtigheid tijdens het uitvoeren van bepaalde aspecten van het protocol kan helpen bij een grotere nauwkeurigheid van de resultaten en verminderde frustratie.

Een goede fixatie van de larven i...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

We willen maurine Hobbs en de Gecentraliseerde Zebrafish Animal Resource (CZAR) aan de Universiteit van Utah erkennen voor het verstrekken van zebravishouderij, laboratoriumruimte en apparatuur om delen van dit onderzoek uit te voeren. Uitbreiding van de CZAR wordt gedeeltelijk ondersteund door NIH grant # 1G20OD018369-01. We willen ook Rodney Stewart, Chloe Lim, Lance Graham, Cody James, Garrett Nickum en het Huntsman Cancer Institute (HCI) Zebrafish Facility bedanken voor de opvang van zebravissen. We willen Kenneth Kompass bedanken voor hulp bij r-programmering. Dit werk werd mede gefinancierd door subsidies van de Huntsman Cancer Foundation (in combinatie met subsidie P30 CA042014 toegekend aan Huntsman Cancer Institute) (KJE) en NIH/NCI R01CA22570 (KJE).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Camera voor dissectiemicroscoopLeica, bijvoorbeeld
DissectiemicroscoopLeica, bijvoorbeeld
Fijne (Dumont #5) pincetFine Science Tools11254-20
Glazen pipettenVWR14672-608
BeeldanalysesoftwareImage J/FIJIImageJ/FIJI kan gratis worden gedownload: https://imagej.net/Welcome
MethylcelluloseSigmaM0387
ParaformaldehydeSigma AldrichP6148
Fosfaatgebufferd zoutoplossingVerschillende leveranciers
PipetpompenVWR53502-233
Kunststof petrischalenUSA Scientific Inc2906
Pyrex 9-well glasbakje met ronde bodemVWR89090-482
Software voor het verblinden van bestandenR projectR kan gratis worden gedownload: https://www.r-project.org/
Wetenschappelijke grafiek- en statistieksoftwareGraphPad Prism
SpreadsheetprogrammaMicrosoft Excel
Tricaine methaansulfonaat (Tricaine-S)Western Chemical200-226
Zeer fijne (Dumont #55) pincetFine Science Tools11255-20

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Lin, D. -C., et al. Genomic and Epigenomic Heterogeneity of Hepatocellular Carcinoma. Cancer Research. 77 (9), 2255-2265 (2017).
  2. Ghouri, Y. A., Mian, I., Rowe, J. H. Review of hepatocellular carcinoma: Epidemiology, etiology, and carcinogenesis. Journal of Carcinogenesis. 16, 1(2017).
  3. Evason, K. J., et al. Identification of Chemical Inhibitors of β-Catenin-Driven Liver Tumorigenesis in Zebrafish. PLoS Genetics. 11 (7), 1005305(2015).
  4. Kalasekar, S. M., et al. Heterogeneous beta-catenin activation is sufficient to cause hepatocellular carcinoma in zebrafish. Biology Open. 8 (10), (2019).
  5. Nguyen, A. T., et al. A high level of liver-specific expression of oncogenic Kras(V12) drives robust liver tumorigenesis in transgenic zebrafish. Disease Models & Mechanisms. 4 (6), 801-813 (2011).
  6. Nguyen, A. T., et al. An inducible kras(V12) transgenic zebrafish model for liver tumorigenesis and chemical drug screening. Disease Models & Mechanisms. 5 (1), 63-72 (2012).
  7. Li, Z., et al. A transgenic zebrafish liver tumor model with inducible Myc expression reveals conserved Myc signatures with mammalian liver tumors. Disease Models & Mechanisms. 6 (2), 414-423 (2013).
  8. Cox, A. G., et al. Yap reprograms glutamine metabolism to increase nucleotide biosynthesis and enable liver growth. Nature Cell Biology. 18 (8), 886-896 (2016).
  9. Sadler, K. C., Amsterdam, A., Soroka, C., Boyer, J., Hopkins, N. A genetic screen in zebrafish identifies the mutants vps18, nf2 and foie gras as models of liver disease. Development. 132 (15), Cambridge, England. 3561-3572 (2005).
  10. Huang, X., Zhou, L., Gong, Z. Liver tumor models in transgenic zebrafish: an alternative in vivo approach to study hepatocarcinogenes. Future Oncology. 8 (1), London, England. 21-28 (2012).
  11. Yan, C., Yang, Q., Gong, Z. Tumor-Associated Neutrophils and Macrophages Promote Gender Disparity in Hepatocellular Carcinoma in Zebrafish. Cancer Research. 77 (6), 1395-1407 (2017).
  12. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  13. Rueden, C. T., et al. ImageJ2: ImageJ for the next generation of scientific image data. BMC Bioinformatics. 18 (1), 529(2017).
  14. Schindelin, J., Rueden, C. T., Hiner, M. C., Eliceiri, K. W. The ImageJ ecosystem: An open platform for biomedical image analysis. Molecular Reproduction and Development. 82 (7-8), 518-529 (2012).
  15. Landis, S. C., et al. A call for transparent reporting to optimize the predictive value of preclinical research. Nature. 490 (7419), 187-191 (2012).
  16. Dai, W., et al. High fat plus high cholesterol diet lead to hepatic steatosis in zebrafish larvae: a novel model for screening anti-hepatic steatosis drugs. Nutrition & Metabolism. 12, 42(2015).
  17. Kim, S. -H., Speirs, C. K., Solnica-Krezel, L., Ess, K. C. Zebrafish model of tuberous sclerosis complex reveals cell-autonomous and non-cell-autonomous functions of mutant tuberin. Disease Models & Mechanisms. 4 (2), 255-267 (2011).
  18. Delous, M., et al. Sox9b is a key regulator of pancreaticobiliary ductal system development. PLoS Genetics. 8 (6), 1002754(2012).
  19. Shin, D., Lee, Y., Poss, K. D., Stainier, D. Y. R. Restriction of hepatic competence by Fgf signaling. Development. 138 (7), Cambridge, England. 1339-1348 (2011).
  20. Yin, C., Evason, K. J., Maher, J. J., Stainier, D. Y. R. The basic helix-loop-helix transcription factor, heart and neural crest derivatives expressed transcript 2, marks hepatic stellate cells in zebrafish: analysis of stellate cell entry into the developing liver. Hepatology. 56 (5), Baltimore, Md. 1958-1970 (2012).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Liver Size QuantificationBrightfield MicroscopyZebrafish LarvaeTissue DissectionImage AnalysisPFA FixationMethylcellulose MountingFreehand SelectionScale Bar CalibrationHepatocellular Carcinoma

Gerelateerde artikelen