Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Beoordeling van de geheugenfunctie bij pilocarpine-geïnduceerde epileptische muizen

7.8K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/60751

⸱

4 juni 2020

 ,  ,  , 
1Department of Pharmacology, Department of Biomedicine & Health Sciences, Catholic Neuroscience Institute, Institute of Aging and Metabolic Diseases, College of Medicine, The Catholic University of Korea

In dit artikel

Samenvatting

Dit artikel presenteert experimentele procedures voor het beoordelen van geheugenstoornissen bij pilocarpine-geïnduceerde epileptische muizen. Dit protocol kan worden gebruikt om de pathofysiologische mechanismen van epilepsie-geassocieerde cognitieve achteruitgang te bestuderen, wat een van de meest voorkomende comorbiditeiten bij epilepsie is.

Samenvatting

Cognitieve stoornissen is een van de meest voorkomende comorbiditeiten in temporale kwab epilepsie. Om epilepsie-geassocieerde cognitieve achteruitgang samen te vatten in een dierlijk model van epilepsie, genereerden we met pilocarpine behandelde chronische epileptische muizen. We presenteren een protocol voor drie verschillende gedragstests met behulp van deze epileptische muizen: nieuwe objectlocatie (NL), nieuwe objectherkenning (NO) en patroonscheiding (PS) tests om leren en geheugen voor respectievelijk plaatsen, objecten en contexten te evalueren. We leggen uit hoe je het gedragsapparaat instelt en experimentele procedures voor de NL-, NO- en PS-tests aans te bieden na een open veldtest die de basale motorische activiteiten van de dieren meet. We beschrijven ook de technische voordelen van de NL- en NO- en PS-tests met betrekking tot andere gedragstests voor het beoordelen van de geheugenfunctie bij epileptische muizen. Tot slot bespreken we mogelijke oorzaken en oplossingen voor epileptische muizen die niet 30 s van goed contact met de objecten maken tijdens de kennismakingssessies, wat een cruciale stap is voor succesvolle geheugentests. Zo biedt dit protocol gedetailleerde informatie over het beoordelen van epilepsie-geassocieerde geheugenstoornissen met behulp van muizen. De NL- en PS-tests zijn eenvoudige, efficiënte tests die geschikt zijn voor de evaluatie van verschillende soorten geheugen bij epileptische muizen.

Inleiding

Epilepsie is een chronische aandoening die wordt gekenmerkt door spontane terugkerende aanvallen1,,2,3. Omdat repetitieve aanvallen structurele en functionele afwijkingen in de hersenen1,2,3,abnormale epileptische aanvalactiviteit kunnen veroorzaken, kan abnormale aanvalsactiviteit bijdragen aan cognitieve disfunctie, wat een van de meest voorkomende epilepsie-geassocieerde comorbiditeiten is4,5,6. In tegenstelling tot de chronische epileptische aanvallen, die van voorbijgaande aard en kortstondig zijn, kunnen cognitieve stoornissen gedurende het leven van epileptische patiënten voortduren, waardoor hun kwaliteit van leven verslechtert. Daarom is het belangrijk om de pathofysiologische mechanismen van epilepsie-geassocieerde cognitieve achteruitgang te begrijpen.

Verschillende experimentele diermodellen van epilepsie zijn gebruikt om de leer- en geheugentekorten aan te tonen die gepaard gaan met chronische epilepsie7,8,9,10,11,12. Zo zijn het Morris waterdoolhof, contextuele angstconditionering, hole-board, novel object location (NL) en nieuwe objectherkenning (NO) tests vaak gebruikt om geheugendisfunctie in temporale kwab epilepsie (TLE) te beoordelen. Omdat de hippocampus een van de primaire regio's is waarin TLE pathologie vertoont, worden gedragstests die hippocampusafhankelijke geheugenfunctie kunnen evalueren vaak bij voorkeur geselecteerd. Echter, gezien het feit dat aanvallen kunnen leiden tot afwijkende hippocampale neurogenese en bijdragen aan epilepsie-geassocieerde cognitieve achteruitgang10, gedragsparadigma's voor het testen van dentate pasgeboren neuronale functie (dat wil zeggen, ruimtelijke patroon scheiding, PS)8,13 kan ook waardevolle informatie over de cellulaire mechanismen van geheugenstoornissen in epilepsie.

In dit artikel demonstreren we een batterij geheugentests, NL, NO en PS, voor epileptische muizen. De tests zijn eenvoudig en gemakkelijk toegankelijk en vereisen geen geavanceerd systeem.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

Alle experimentele procedures werden goedgekeurd door de Ethische Commissie van de Katholieke Universiteit van Korea en werden uitgevoerd in overeenstemming met de National Institutes of Health Guide for the Care and Use of Laboratory Animals (NIH Publications No. 80-23).

1. Nieuwe objectlocatietest (NL)

  1. Bereid epileptische C57BL/6 of transgene muizen 4-6 weken na pilocarpine injectie.
    OPMERKING: Acute aanvallen werden veroorzaakt door intraperitoneale (IP) pilocarpine injectie, volgens het protocol beschreven in ons vorige rapport14.
  2. Breng de epileptische muizen van de kweekruimte naar de gedragsruimte een dag voordat de gedragstests beginnen. Laat de muizen 's nachts minstens 12 uur wennen.
  3. In de gedragsruimte, scheid individuele muizen in nieuwe kooien voor enkele huisvesting. Schrijf de informatie voor elk dier op de kooikaart en bewaar de dieren in dezelfde kooien tijdens de gedragstesten. Meerdere kooien kunnen tegelijkertijd worden overgedragen met behulp van een kar.
  4. Op de volgende dag, begin 3 dagen van gewenning sessies (H1-H3) in de vroege ochtend. Acclimatiseren de dieren aan het weinig licht in hun huis kooien voor ten minste 30 min.
  5. Bereid een open velddoos met buitenafmetingen van 44 x 44 x 31 cm en binnenafmetingen van 43 x 43 x 30,5 cm. Plaats op dag 1 van de gewenning (H1) een verlichtingsmeter in het midden van de open veldbox en pas de verlichting aan 60 lux aan.
  6. Spray de vloer en muren van de open velddoos met 70% ethanol en veeg af met een schone papieren handdoek om mogelijke reuksignalen te verwijderen. Wacht dan minstens 1 min tot de resterende alcohol volledig is gedroogd.
  7. Evalueer de bewegingsactiviteit van elke muis door een open veldtest uit te voeren.
    1. Als u het gedrag van elke experimentele muis wilt vastleggen en bijhouden, gebruikt u videotrackingsoftware voor dieren (zie Tabel met materialen).
    2. Zodra de videotrackingsoftware is geopend, kalibreer u de grootte van de open veldbox. Stel vervolgens de zone in voor het volgen. Stel 3 s latentie en 15 minuten acquisitietijd in om te voorkomen dat de handen van een onderzoeker worden gevolgd. Voeg de informatie over elke experimentele muis (groep, geslacht, leeftijd, enz.) in.
    3. Plaats vervolgens voorzichtig een experimentele muis in de open velddoos met uitzicht op de muur. Doe dit door het op het deksel van de kooi te plaatsen om behandeling-bijbehorende spanning en bezorgdheid te minimaliseren. Laat vervolgens de muis los in de buurt van de muur van de open veldbox die het verst is van waar de objecten zich tijdens de kennismakingssessie zullen bevindt (stap 1.9.3.).
      OPMERKING: Zodra de muis zich in de open veldbox bevindt, detecteert de muistrackingsoftware deze automatisch en begint deze met opnemen. Voor een optimale tracking van de verkenning kan de camera direct boven de open veldbox worden geplaatst.
    4. Na 15 minuten opnemen, breng het dier terug naar zijn kooi door het op het kooideksel te plaatsen. Reinig de open velddoos met 70% ethanolspray en veeg af met een schone papieren handdoek tussen de proeven door. Herstel het felle licht en meet de totale afstand van het dier verplaatst met behulp van de video tracking software volgens de instructies van de fabrikant.
      1. Open de videotrackingsoftware en videoclips. Klik vervolgens op Analyse om de totale verplaatste afstand te berekenen op basis van de kalibratie van de grootte van het open veldvak.
  8. Voer op dag 2 en dag 3 de gewenningssessies (H2, H3) uit door stap 1.3 tot en met 1.7 te herhalen.
  9. Voer op dag 4 de kennismakingssessie (F1) uit.
    1. In het schemerige licht, plaats elke muis in het lege open veld gedurende 3 min. Na die korte revalidatiesituatie, breng het dier terug naar zijn huiskooi.
    2. Tijdens de gewenning, grondig reinigen van de objecten met 70% ethanol en veeg ze naar beneden met een papieren handdoek. Wacht minstens 1 min voor de resterende alcohol volledig te drogen.
    3. Plaats twee identieke objecten (rubberen poppen, object A) in de open veldarena op 5 cm afstand van de aangrenzende muren. Bevestig de objecten met dubbelzijdige tape. Introduceer de experimentele muis in de open velddoos, met uitzicht op de muur die het verst van de objecten verwijderd is.
    4. Laat gratis verkenning gedurende 20 minuten en meet handmatig de tijd die wordt besteed aan het verkennen van beide objecten met behulp van twee stopwatches. Zodra de muis de minimale verkenningstijd (30 s) voor beide objecten heeft bereikt, stop je de F1-sessie en breng je het dier naar zijn thuiskooi. Als de muis de objecten binnen 20 minuten niet binnen 20 minuten verkent, verwijdert u de muis uit het open veldvak en sluit u deze uit voor verdere sessies.
    5. Nadat het dier uit de open velddoos is gehaald, maak je de vloer en wanden van de doos grondig schoon met 70% ethanolspray en veeg je ze af met een papieren handdoek.
      OPMERKING: Meet de tijd waarop de muis de objecten aanraakt met zijn snorharen, snuiten of voorpoten. Kwantificeer niet als verkennende tijd elk gedrag waarbij de snuit van het dier niet naar het object wijst, zoals op het object zitten, langs het object gaan of rusten met het achterste uiteinde dat naar het object wijst.
  10. Voer op dag 5 de NL testsessie uit.
    1. Breng de muis van zijn thuiskooi naar het open veld gebied voor rehabituation voor 3 min. Breng het dier dan terug naar zijn thuiskooi.
    2. Tijdens de gewenning, grondig reinigen van de objecten met 70% ethanol en veeg ze naar beneden met een papieren handdoek. Wacht minstens 1 min voor de resterende alcohol volledig te drogen.
    3. Beweeg een object (rubberpop, object A) naar de diagonale positie, op 5 cm afstand van de aangrenzende muren. Bevestig het object met dubbelzijdige tape. Breng de experimentele muis op zijn kooideksel naar het open veld en plaats deze tegenover de muur van de open velddoos.
      OPMERKING: Tegenwicht tegenwicht tegen de locatie van het object verplaatst om eventuele aangeboren voorkeur voor een bepaalde richting te verminderen. Wijzig bijvoorbeeld de locatie van het voorkeursobject van de kennismakingssessie voor de helft van de proefdieren en verplaats voor de rest van de dieren het object met minder voorkeur uit de kennismakingssessie.
    4. Sta 10 minuten gratis exploratie en opnemen met een video tracking systeem. Meet de tijd die wordt besteed aan het verkennen van elk object met behulp van twee stopwatches en bereken de discriminatieratio als
      figure-protocol-1
      OPMERKING: Meet de tijd waarop de muis de objecten aanraakt met zijn snorharen, snuiten of voorpoten. Kwantificeer niet als verkennende tijd elk gedrag waarbij de snuit van het dier niet naar het object wijst, zoals op het object zitten, langs het object gaan of rusten met het achterste uiteinde dat naar het object wijst.
    5. Pak de staart van de experimentele muis en plaats deze op het deksel van de kooi om over te stappen op zijn thuiskooi. Laat de muis 3 dagen lang (dagen 6-8) rusten met vrije toegang tot voedsel en water.
    6. Zodra het dier is verwijderd uit de open veld doos, grondig reinigen van de vloer en muren van de doos met 70% ethanol spray en veeg naar beneden met een papieren handdoek.

2. Nieuwe objectherkenningstest (NO)

  1. Voer op dag 9 een gewenningssessie van 15 minuten uit door stappen 1.2–1.7 te herhalen.
  2. Voer op dag 10 de kennismakingssessie (F1) uit.
    1. Bij weinig licht plaatst u de muis gedurende 3 minuten in het lege open veld. Na het rehabitueren van de muis naar het open veld gebied, tijdelijk terug te keren naar zijn huis kooi.
    2. Tijdens de gewenning, grondig reinigen van de objecten met 70% ethanol en veeg naar beneden met een papieren handdoek. Wacht minstens 1 min minuten voordat de resterende alcohol volledig is drooggelegd.
    3. Plaats twee identieke voorwerpen (50 mL plastic buizen gevuld met 40 mL water, object B) in het open veld op 5 cm afstand van de aangrenzende muren. Bevestig de objecten met dubbelzijdige tape. Introduceer de experimentele muis in de open velddoos tegenover de muur die het verst van de objecten verwijderd is.
    4. Aangezien het dier in de NO-test wordt blootgesteld aan de twee verschillende objecten (50 mL plastic buis gevuld met 40 mL water, object B; glazen Coplin pot, object C) in de NO-test, tegenwicht bieden aan het object tijdens de F1-sessie. Presenteer bijvoorbeeld twee identieke objecten (glazen Coplin potten, object C) voor de helft van de dieren in de groep.
    5. Laat gratis verkenning gedurende 20 minuten en meet handmatig de tijd die wordt besteed aan het verkennen van beide objecten met behulp van twee stopwatches. Zodra de muis de minimale verkenningstijd (30 s) voor beide objecten heeft bereikt, stop je de F1-sessie en breng je het dier naar zijn thuiskooi. Als de muis de objecten binnen 20 minuten niet binnen 20 minuten verkent, verwijdert u deze uit het open veldvak en sluit u deze uit voor verdere sessies.
    6. Nadat het dier uit de open velddoos is gehaald, maak je de vloer en wanden van de doos grondig schoon met 70% ethanolspray en veeg je ze af met een papieren handdoek.
      OPMERKING: Meet de tijd waarop de muis de objecten aanraakt met zijn snorharen, snuiten of voorpoten. Kwantificeer niet als verkennende tijd elk gedrag waarbij de snuit van het dier niet naar het object wijst, zoals op het object zitten, langs het object gaan of rusten met het achterste uiteinde dat naar het object wijst.
  3. Voer de volgende dag (dag 11) de NO-testsessie uit.
    1. Breng de muis van zijn thuiskooi naar het open veld voor revalidatie voor 3 minuten, en breng het dier terug naar zijn thuiskooi.
    2. Tijdens de gewenning, grondig reinigen van de objecten met 70% ethanol en veeg naar beneden met een papieren handdoek. Wacht minstens 1 min voor de resterende alcohol volledig te drogen.
    3. Vervang een object (50 mL plastic buis gevuld met 40 mL water, object B) door een ander object (glazen Coplin pot, object C) 5 cm afstand van de aangrenzende muren. Bevestig de objecten met dubbelzijdige tape. Breng de experimentele muis op het kooideksel naar het open veld en plaats deze met uitzicht op de muur. Tegenwicht tegenwicht de objecten samen gepresenteerd tijdens de NO-test. Vervang bijvoorbeeld een glazen Coplin-pot (object C) door een 50 mL plastic buis gevuld met 40 mL water (object B) voor de muizen die tijdens de kennismakingssessie zijn blootgesteld aan de twee glazen Coplin-potten (object C).
      OPMERKING: Counterbalancing de locatie van het vervangen object kan ook worden uitgevoerd om de potentiële aangeboren voorkeur voor een bepaalde richting te verminderen. Wijzig bijvoorbeeld voor elk cohort van de dieren die aan de verzameling van twee objecten (object B of object C) zijn blootgesteld, het voorkeursobject in de kennismakingssessie voor de helft van de proefdieren en voor de rest van de dieren het object dat minder voorkeur heeft in de vertrouwdheidssessie.
    4. Laat 10 minuten gratis exploratie en opnemen met behulp van een video tracking systeem. Meet de tijd die wordt besteed aan het verkennen van elk object met behulp van twee stopwatches en bereken de discriminatieratio.
      OPMERKING: Meet de tijd waarop de muis de objecten aanraakt met zijn snorharen, snuiten of voorpoten. Kwantificeer niet als verkennende tijd elk gedrag waarbij de snuit van het dier niet naar het object wijst, zoals op het object zitten, langs het object gaan of rusten met het achterste uiteinde dat naar het object wijst.
    5. Pak de staart van de experimentele muis en plaats deze op het kooideksel voor overdracht naar zijn thuiskooi. Laat de muis 3 dagen lang (dagen 12-14) rusten met vrije toegang tot voedsel en water.
    6. Zodra het dier is verwijderd uit de open veld doos, grondig reinigen van de vloer en muren van de open veld doos met 70% ethanol spray en veeg naar beneden met een papieren handdoek.

3. Patroonscheidingstest (PS)

  1. Voer op dag 15 de eerste kennismakingssessie (F1) uit voor de PS-test.
    1. Breng de muis van zijn huiskooi naar het open veld gebied voor rehabituation voor 3 min, en dan terug te keren naar zijn huis kooi.
    2. Tijdens de gewenning, grondig reinigen van de objecten en de roosterde vloerplaat met 70% ethanol en veeg naar beneden met een papieren handdoek. Wacht minstens 1 min voor de resterende alcohol volledig te drogen.
    3. Plaats de vloerplaat (42,5 x 42,5 x 0,5 cm) met het brede rooster (5,5 x 5,5 cm) in de open veldbox en plaats twee identieke voorwerpen (plastic T-flasken gevuld met 50 mL water, object D) in het open veld op 5 cm afstand van de aangrenzende wanden. Bevestig de objecten met dubbelzijdige tape. Introduceer de experimentele muis in de open velddoos tegenover de muur die het verst van de objecten verwijderd is.
    4. Aangezien het dier in de PS-test wordt blootgesteld aan twee verschillende voorwerpen (plastic T-kolf gevuld met 50 mL water, object D; glazen fles, object E) in de PS-test, moet u het object compenseren tijdens de F1- en F2-sessies. Presenteer bijvoorbeeld twee identieke objecten (glazen flessen, object E) op de brede roostervloer voor de helft van de dieren in de groep.
    5. Laat gratis verkenning gedurende 20 minuten toe en meet handmatig de tijd die wordt besteed aan het verkennen van beide objecten met behulp van twee stopwatches. Zodra de muis het minimale exploratietijdtotaal (30 s) voor beide objecten heeft bereikt, stopt u de F1-sessie en breng het dier naar zijn kooi thuis. Als de muis de objecten binnen 20 minuten niet binnen 20 minuten verkent, verwijdert u deze uit het open veldvak en sluit u deze uit voor verdere sessies.
      OPMERKING: Meet de tijd waarop de muis de objecten aanraakt met zijn snorharen, snuiten of voorpoten. Kwantificeer niet als verkennende tijd elk gedrag waarbij de snuit van het dier niet naar het object wijst, zoals op het object zitten, langs het object gaan of rusten met het achterste uiteinde dat naar het object wijst.
    6. Na afloop van de eerste kennismakingssessie (F1) maak je de objecten en de vloerplaat grondig schoon met 70% ethanolspray en haal je ze uit de open veldbox.
  2. Voer de volgende dag (dag 16) de tweede kennismakingssessie (F2) uit voor de PS-test.
    1. Breng de muis van zijn huiskooi naar het open veld gebied voor rehabituation voor 3 min, en dan terug te keren naar zijn huis kooi.
    2. Tijdens de gewenning, grondig reinigen van de objecten en roosterde vloerplaat met 70% ethanol en veeg naar beneden met een papieren handdoek. Wacht minstens 1 min voor de resterende alcohol volledig te drogen.
    3. Plaats de vloerplaat (42,5 x 42,5 x 0,5 cm) met het smalle rooster (2,75 x 2,75 cm) in de open veldbox en plaats twee identieke voorwerpen (glazen flessen, object E) in het open veld op 5 cm afstand van de aangrenzende wanden. Bevestig de objecten met dubbelzijdige tape. Introduceer de experimentele muis in de open velddoos tegenover de muur die het verst van de objecten verwijderd is.
    4. Voor tegenwicht, presenteren twee identieke objecten (plastic T-kolven gevuld met 50 mL water, object D) op de smalle roostervloer.
    5. Laat gratis verkenning gedurende 20 minuten en meet handmatig de tijd die wordt besteed aan het verkennen van beide objecten met behulp van twee stopwatches. Zodra de muis het minimale exploratietijdtotaal (30 s) voor beide objecten heeft bereikt, stopt u de F2-sessie en breng het dier naar zijn kooi thuis. Als de muis de objecten binnen 20 minuten niet binnen 20 minuten verkent, verwijdert u deze uit het open veldvak en sluit u deze uit voor verdere sessies.
      OPMERKING: Meet de tijd waarop de muis de objecten aanraakt met zijn snorharen, snuiten of voorpoten. Kwantificeer niet als verkennende tijd elk gedrag waarbij de snuit van het dier niet naar het object wijst, zoals op het object zitten, langs het object gaan of rusten met het achterste uiteinde dat naar het object wijst.
    6. Na afloop van de tweede kennismakingssessie (F2) maak je de objecten en vloerplaat grondig schoon met 70% ethanolspray en haal je ze uit de open veldbox.
  3. Voer de volgende dag (dag 17) de PS-testsessie uit.
    1. Breng de muis van zijn huiskooi naar het open veld gebied voor rehabituation voor 3 min, en dan terug te keren naar zijn huis kooi.
    2. Tijdens de gewenning, grondig reinigen van de objecten en roosterde vloerplaat met 70% ethanol en veeg naar beneden met een papieren handdoek. Wacht minstens 1 min voor de resterende alcohol volledig te drogen.
    3. Plaats de vloerplaat met het smalle rooster (2,75 x 2,75 cm) in de open veldbox en plaats twee verschillende objecten (plastic T-kolf gevuld met 50 mL water, object D; glazen fles, object E) op de vloerplaat op 5 cm afstand van de aangrenzende muren. Bevestig de objecten met dubbelzijdige tape. Breng de experimentele muis op het kooideksel naar het open veld en plaats deze met uitzicht op de muur.
    4. Tegenwicht tegenwicht de objecten samen gepresenteerd tijdens de PS-test. Plaats bijvoorbeeld elk object (object D, object E) op de smalle rastervloer om van het object E een nieuw object in deze context te maken. Tegenwicht tegenwicht tegen de locatie van object D of object E (een nieuw object op het smalle vloerpatroon) kan ook worden uitgevoerd om de kans op een aangeboren voorkeur voor een bepaalde richting te verkleinen. Vervang bijvoorbeeld het voorkeursobject uit de tweede kennismakingssessie voor de helft van de proefdieren en vervang voor de rest van de dieren het minder geprefereerde object uit de tweede kennismakingssessie.
    5. Laat 10 minuten gratis exploratie en opnemen met behulp van een video tracking systeem. Meet de tijd die wordt besteed aan het verkennen van elk object met behulp van twee stopwatches en bereken de discriminatieratio.
      OPMERKING: Meet de tijd waarop de muis de objecten aanraakt met zijn snorharen, snuiten of voorpoten. Kwantificeer niet als verkennende tijd elk gedrag waarbij de snuit van het dier niet naar het object wijst, zoals op het object zitten, langs het object gaan of rusten met het achterste uiteinde dat naar het object wijst.
    6. Pak de staart van de experimentele muis en plaats deze op het kooideksel voor overdracht naar zijn thuiskooi.

4. Cresyl violette kleuring

  1. Verdoof het dier na het voltooien van alle gedragstests door een cocktail (4:0,5) ketamine (50 mg/mL) en xylazine (23,3 mg/mL) opgelost in zoutoplossing te injecteren bij een dosis van 110 mL/kg lichaamsgewicht (IP; 1 mL-spuit; 26 G naald). Controleer op de diepte van anesthesie door het ontbreken van een reactie op een teensnuifje.
  2. Zodra het dier diep verdoofd is, voert u transcardiale perfusie uit met 4% paraformaldehyde om de hersenen te repareren15.
  3. Nadat de transcardiale perfusie is voltooid, onthoofd het dier met een schaar15. Verwijder vervolgens de schedel met behulp van een irisschaar om de hersenen bloot te leggen. Nadat de hersenen is geïsoleerd, postfix het in 4% paraformaldehyde 's nachts, gevolgd door cryoprotectie in 30% sacharose in 0,01 M fosfaat-gebufferde zoutoplossing.
  4. Maak coronale secties (30 μm) van de snap-bevroren hersenen met behulp van een cryostat.
  5. Monteer de hersenweefsels op dia's en voer een reeks hydratatiestappen uit van 100% ethanol tot kraanwater door 3 min sequentieel te wassen in 100%, 95%, 90%, 80%, 70% ethanol.
  6. Incubeer het weefsel dia's in 0,1% cresyl violet oplossing gedurende 15 min.
  7. Verwijder overmatige vlek door het onderdompelen van de weefselglijbanen in 95% ethanol/0,1% glaciale azijnzuur, en vervolgens de weefsels uitdrogen met oplossingen van 100% ethanol, 50% ethanol/50% xyleen, en 100% xyleen.
  8. Coverslip het weefsel glijbanen met behulp van een commercieel verkrijgbaar xyleen montagemedium.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Een algemeen experimenteel schema en setup voor de evaluatie van de cognitieve functie worden weergegeven in figuur 1. Zes weken na de introductie van door pilocarpine geïnduceerde acute aanvallen werden muizen onderworpen aan de NL-, NO- en PS-tests in die volgorde gescheiden door 3 dagen rusttijden tussen de tests (figuur 1A). Voor de NL-test werden tijdens de kennismakingssessie (F1) twee identieke objecten in het open veld geplaatst en de volgende dag werd é...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Dit werk beschrijft experimentele procedures voor het evalueren van cognitieve functie bij muizen met chronische epilepsie. Veel verschillende gedragstestparadigma's worden gebruikt om leer- en geheugenfuncties bij muizen18te beoordelen. De Morris water doolhof, radiale arm doolhof, Y-doolhof, contextuele angst conditionering, en object-based tests zijn de meest gebruikte gedragstests en bieden betrouwbare resultaten. Onder hen, de NL, NO, en PS tests zijn efficiënte, eenvoudige methoden voor de e...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

We danken Dr. Jae-Min Lee voor zijn technische ondersteuning. Dit werk werd ondersteund door de National Research Foundation of Korea (NRF) subsidies gefinancierd door de Koreaanse overheid (NRF-2019R1A2C1003958, NRF-2019K2A9A2A08000167).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
1 ml spuitSung-shimGebruik met de 26 of 30 gauge naald
70% EthanolDuksanUN1170Spuit om de doos en objecten schoon te maken
zwarte gordijnVoor het vermijden van onnodige visuele hints
Cresyl violetSigmaC5042Voor Cresyl violet kleuring
cryotomeLeicaE21040041Voor weefsel segmentering
dubbelzijdig plakbandVoor de stevige plaatsing van de objecten
DPX montage mediumSigma06522
ethanol serieDuksanUN1170Maak 100%, 95%, 90%, 80%, 70% ethanol oplossingen
vloerplaat met smalle rasterpatronenLeehyo-bioGedragsexperimentapparatuur, plaatmaat: 42,5 x 42,5 x 0,5 cm, rastermaat: 2,75 x 2,75 cm
vloerplaat met brede rasterpatronenLeehyo-bioGedragsexperimentapparatuur, plaatmaat: 42,5 x 42,5 x 0,5 cm, rastermaat: 5,5 x 5,5 cm
illuminometerTES Electrical Electronic Corp.1334AVoor de meting van de lichtinval in de ruimte (60 Lux)
Intensive care unitThermocare#W-1
ketamine hydrochlorideYuhan7003Gebruik om de muis te anesthetiseren voor transcardial perfusie
LED lampLungoP13A-0422-WW-04Verlichting voor de gedragstestruimte
objectenRubberen pop, 50 ml plastic buis, glazen Coplin pot, plastic T-kolf, glazen fles
open veld boxLeehyo-bioGedragsexperimentapparatuur, maat: 44 x 44 x 31 cm
papieren handdoekYuhan-Kimberly47201Gebruik om de open veld box en objecten te drogen
paraformaldehydeMerck Millipore104005Maak 4% oplossing
pilocarpine hydrochlorideSigmaP6503
liniaalGebruik om de objecten in de open veld box te lokaliseren
scopolamine methylnitraatSigmaS2250Maak 10X stock
Smart system 3.0PanlabVideo tracking systeem
stopwatchJunsoJS-307Voor de meting van exploratieve activiteiten van muizen
sucroseSigmaS9378Voor cryoprotectie van weefselsegmenten
terbutaline hemisulfaat zoutSigmaT2528Maak 10X stock
videocamera (CCD camera)VisionVCE56HQ-12Plaats de camera direct boven de open veld box
xylazine (Rompun)Bayer koreaKR10381Gebruik om de muis te anesthetiseren voor transcardial perfusie
xyleenDuksanUN1307Voor Cresyl violet kleuring

Referenties

  1. Chang, B. S., Lowenstein, D. H. Mechanisms of disease - Epilepsy. New England Journal of Medicine. 349 (13), 1257-1266 (2003).
  2. Scharfman, H. E. The neurobiology of epilepsy. Current Neurology and Neuroscience Report. 7 (4), 348-354 (2007).
  3. Rakhade, S. N., Jensen, F. E. Epileptogenesis in the immature brain: emerging mechanisms. Nature Reviews in Neurology. 5 (7), 380-391 (2009).
  4. Breuer, L. E., et al. Cognitive deterioration in adult epilepsy: Does accelerated cognitive ageing exist. Neuroscience and Biobehavior Reviews. 64, 1-11 (2016).
  5. Leeman-Markowski, B. A., Schachter, S. C. Treatment of Cognitive Deficits in Epilepsy. Neurology Clinics. 34 (1), 183-204 (2016).
  6. Helmstaedter, C., Elger, C. E. Chronic temporal lobe epilepsy: a neurodevelopmental or progressively dementing disease. Brain. 132, Pt 10 2822-2830 (2009).
  7. Groticke, I., Hoffmann, K., Loscher, W. Behavioral alterations in the pilocarpine model of temporal lobe epilepsy in mice. Experimental Neurology. 207 (2), 329-349 (2007).
  8. Long, Q., et al. Intranasal MSC-derived A1-exosomes ease inflammation, and prevent abnormal neurogenesis and memory dysfunction after status epilepticus. Proceedings of the National Academy of Science U. S. A. 114 (17), 3536-3545 (2017).
  9. Lima, I. V. A., et al. Postictal alterations induced by intrahippocampal injection of pilocarpine in C57BL/6 mice. Epilepsy & Behavior. 64, Pt A 83-89 (2016).
  10. Cho, K. O., et al. Aberrant hippocampal neurogenesis contributes to epilepsy and associated cognitive decline. Nature Communication. 6, 6606(2015).
  11. Zhou, Q., et al. Adenosine A1 Receptors Play an Important Protective Role Against Cognitive Impairment and Long-Term Potentiation Inhibition in a Pentylenetetrazol Mouse Model of Epilepsy. Molecular Neurobiology. 55 (4), 3316-3327 (2018).
  12. Jiang, Y., et al. Ketogenic diet attenuates spatial and item memory impairment in pentylenetetrazol-kindled rats. Brain Research. 1646, 451-458 (2016).
  13. Zhuo, J. M., et al. Young adult born neurons enhance hippocampal dependent performance via influences on bilateral networks. Elife. 5, 22429(2016).
  14. Kim, J. E., Cho, K. O. The Pilocarpine Model of Temporal Lobe Epilepsy and EEG Monitoring Using Radiotelemetry System in Mice. Journal of Visualized Experiments. (132), e56831(2018).
  15. Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole animal perfusion fixation for rodents. Journal of Visualized Experiments. (65), e3564(2012).
  16. Muller, C. J., Groticke, I., Bankstahl, M., Loscher, W. Behavioral and cognitive alterations, spontaneous seizures, and neuropathology developing after a pilocarpine-induced status epilepticus in C57BL/6 mice. Experimental Neurology. 219 (1), 284-297 (2009).
  17. Brandt, C., Gastens, A. M., Sun, M., Hausknecht, M., Loscher, W. Treatment with valproate after status epilepticus: effect on neuronal damage, epileptogenesis, and behavioral alterations in rats. Neuropharmacology. 51 (4), 789-804 (2006).
  18. Wolf, A., Bauer, B., Abner, E. L., Ashkenazy-Frolinger, T., Hartz, A. M. A Comprehensive Behavioral Test Battery to Assess Learning and Memory in 129S6/Tg2576 Mice. PLoS One. 11 (1), 0147733(2016).
  19. Lueptow, L. M. Novel Object Recognition Test for the Investigation of Learning and Memory in Mice. Journal of Visualized Experiments. (126), e55718(2017).
  20. Antunes, M., Biala, G. The novel object recognition memory: neurobiology, test procedure, and its modifications. Cognitive Processing. 13 (2), 93-110 (2012).
  21. van Goethem, N. P., van Hagen, B. T. J., Prickaerts, J. Assessing spatial pattern separation in rodents using the object pattern separation task. Nature Protocols. 13 (8), 1763-1792 (2018).
  22. Leger, M., et al. Object recognition test in mice. Nature Protocols. 8 (12), 2531-2537 (2013).
  23. Moscovitch, M., Cabeza, R., Winocur, G., Nadel, L. Episodic Memory and Beyond: The Hippocampus and Neocortex in Transformation. Annual Reviews in Psychology. 67, 105-134 (2016).
  24. Eichenbaum, H. A cortical-hippocampal system for declarative memory. Nature Reviews Neuroscience. 1 (1), 41-50 (2000).
  25. Brown, M. W., Aggleton, J. P. Recognition memory: What are the roles of the perirhinal cortex and hippocampus. Nature Reviews Neuroscience. 2 (1), 51-61 (2001).
  26. Winters, B. D., Forwood, S. E., Cowell, R. A., Saksida, L. M., Bussey, T. J. Double dissociation between the effects of peri-postrhinal cortex and hippocampal lesions on tests of object recognition and spatial memory: Heterogeneity of function within the temporal lobe. Journal of Neuroscience. 24 (26), 5901-5908 (2004).
  27. Winters, B. D., Bussey, T. J. Transient inactivation of perirhinal cortex disrupts encoding, retrieval, and consolidation of object recognition memory. Journal of Neuroscience. 25 (1), 52-61 (2005).
  28. Bermudez-Rattoni, F., Okuda, S., Roozendaal, B., McGaugh, J. L. Insular cortex is involved in consolidation of object recognition memory. Learning & Memory. 12 (5), 447-449 (2005).
  29. Akirav, I., Maroun, M. Ventromedial prefrontal cortex is obligatory for consolidation and reconsolidation of object recognition memory. Cerebral Cortex. 16 (12), 1759-1765 (2006).
  30. Cohen, S. J., Stackman, R. W. Assessing rodent hippocampal involvement in the novel object recognition task. A review. Behavior Brain Research. 285, 105-117 (2015).
  31. Cohen, S. J., et al. The Rodent Hippocampus Is Essential for Nonspatial Object Memory. Current Biology. 23 (17), 1685-1690 (2013).
  32. Broadbent, N. J., Gaskin, S., Squire, L. R., Clark, R. E. Object recognition memory and the rodent hippocampus. Learning and Memory. 17 (1), 5-11 (2010).
  33. Tuscher, J. J., Taxier, L. R., Fortress, A. M., Frick, K. M. Chemogenetic inactivation of the dorsal hippocampus and medial prefrontal cortex, individually and concurrently, impairs object recognition and spatial memory consolidation in female mice. Neurobiology of Learning and Memory. 156, 103-116 (2018).
  34. de Lima, M. N., Luft, T., Roesler, R., Schroder, N. Temporary inactivation reveals an essential role of the dorsal hippocampus in consolidation of object recognition memory. Neuroscience Letters. 405 (1-2), 142-146 (2006).
  35. Hammond, R. S., Tull, L. E., Stackman, R. W. On the delay-dependent involvement of the hippocampus in object recognition memory. Neurobiology of Learning and Memory. 82 (1), 26-34 (2004).
  36. Clark, R. E., Zola, S. M., Squire, L. R. Impaired recognition memory in rats after damage to the hippocampus. Journal of Neuroscience. 20 (23), 8853-8860 (2000).
  37. Stackman, R. W., Cohen, S. J., Lora, J. C., Rios, L. M. Temporary inactivation reveals that the CA1 region of the mouse dorsal hippocampus plays an equivalent role in the retrieval of long-term object memory and spatial memory. Neurobiology of Learning and Memory. 133, 118-128 (2016).
  38. Mumby, D. G., Gaskin, S., Glenn, M. J., Schramek, T. E., Lehmann, H. Hippocampal damage and exploratory preferences in rats: memory for objects, places, and contexts. Learning & Memory. 9 (2), 49-57 (2002).
  39. Jeong, K. H., Lee, K. E., Kim, S. Y., Cho, K. O. Upregulation of Kruppel-Like Factor 6 in the Mouse Hippocampus after Pilocarpine-Induced Status Epilepticus. Neuroscience. 186, 170-178 (2011).
  40. Kim, J. E., Cho, K. O. The Pilocarpine Model of Temporal Lobe Epilepsy and EEG Monitoring Using Radiotelemetry System in Mice. Journal of Visualized Experiments. (132), e56831(2018).
  41. Jiang, Y., et al. Abnormal hippocampal functional network and related memory impairment in pilocarpine-treated rats. Epilepsia. 59 (9), 1785-1795 (2018).
  42. Wang, L., Liu, Y. H., Huang, Y. G., Chen, L. W. Time-course of neuronal death in the mouse pilocarpine model of chronic epilepsy using Fluoro-Jade C staining. Brain Research. 1241, 157-167 (2008).
  43. Detour, J., Schroeder, H., Desor, D., Nehlig, A. A 5-month period of epilepsy impairs spatial memory, decreases anxiety, but spares object recognition in the lithium-pilocarpine model in adult rats. Epilepsia. 46 (4), 499-508 (2005).
  44. Benini, R., Longo, D., Biagini, G., Avoli, M. Perirhinal Cortex Hyperexcitability in Pilocarpine-Treated Epileptic Rats. Hippocampus. 21 (7), 702-713 (2011).
  45. Yassa, M. A., Stark, C. E. Pattern separation in the hippocampus. Trends in Neurosciences. 34 (10), 515-525 (2011).
  46. Goncalves, J. T., Schafer, S. T., Gage, F. H. Adult Neurogenesis in the Hippocampus: From Stem Cells to Behavior. Cell. 167 (4), 897-914 (2016).
  47. Sahay, A., et al. Increasing adult hippocampal neurogenesis is sufficient to improve pattern separation. Nature. 472 (7344), 466-539 (2011).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Trefwoorden

Beoordeling van de geheugenfunctieepileptisch muismodelnieuwe objectlocatienieuwe objectherkenningpatroonscheidingstestopenveldtestgedragsvideotrackinghabituatiesessiesfamiliarisatiesessieberekening van de discriminatieratio
Beoordeling van de geheugenfunctie bij pilocarpine-geïnduceerde epileptische muizen
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleid

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.