Methodenartikel

Lange afstand Channelrhodopsin-assisted Circuit Mapping van inferieure Colliculus Neuronen met blauwe en rood-verschoven Channelrhodopsinen

6.8K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/60760

⸱

7 februari 2020

 , 
1Kresge Hearing Research Institute, Department of Otolaryngology - Head and Neck Surgery, University of Michigan

In dit artikel

Samenvatting

Channelrhodopsin-assisted circuit mapping (CRACM) is een precisietechniek voor het functioneel in kaart brengen van lange afstandneuronale projecties tussen anatomische en/of genetisch geïdentificeerde groepen neuronen. Hier beschrijven we hoe we CRACM kunnen gebruiken om auditieve hersenstamverbindingen in kaart te brengen, inclusief het gebruik van een roodverschoven opsin, ChrimsonR.

Samenvatting

Bij het onderzoeken van neurale circuits, een standaard beperking van de in vitro patch klem aanpak is dat axonen uit meerdere bronnen zijn vaak gemengd, waardoor het moeilijk is om ingangen te isoleren van individuele bronnen met elektrische stimulatie. Echter, met behulp van channelrhodopsin assisted circuit mapping (CRACM), kan deze beperking nu worden overwonnen. Hier rapporteren we een methode om CRACM te gebruiken om opgaande ingangen van lagere auditieve hersenstamkernen en commissurale ingangen in kaart te brengen naar een geïdentificeerde klasse neuronen in de inferieure colliculus (IC), de midbrainkern van het auditieve systeem. In de IC zijn lokale, commissurale, opgaande en dalende axonen sterk met elkaar verweven en daardoor niet te onderscheiden met elektrische stimulatie. Door het injecteren van een virale constructie om expressie van een channelrhodopsine in een presynaptische kern te stimuleren, gevolgd door patch klem opname om de aanwezigheid en fysiologie van channelrhodopsin-uitdrukkende synaptische ingangen te karakteriseren, projecties van een specifieke bron aan een specifieke populatie ic-neuronen kan worden toegewezen met celtype-specifieke nauwkeurigheid. We laten zien dat deze aanpak werkt met zowel Chronos, een blauw licht geactiveerde kanaalrhodopsine, als ChrimsonR, een rood verschoven kanaalrhodopsine. In tegenstelling tot eerdere rapporten van het voorbrein, vinden we dat ChrimsonR robuust wordt verhandeld door de axonen van dorsale cochleair nucleus principal neuronen, wat aangeeft dat ChrimsonR een nuttig hulpmiddel kan zijn voor CRACM-experimenten in de hersenstam. Het hier gepresenteerde protocol bevat gedetailleerde beschrijvingen van de intracraniële virusinjectiechirurgie, inclusief stereotaxiccoördinaten voor het richten van injecties op de rugslakkenkern en IC van muizen, en hoe hele celpatchklemregistratie te combineren met channelrhodopsine activering om lange-afstandsprojecties aan IC neuronen te onderzoeken. Hoewel dit protocol is afgestemd op het karakteriseren van auditieve ingangen aan de IC, kan het gemakkelijk worden aangepast om andere lange-afstandsprojecties in de auditieve hersenstam en daarbuiten te onderzoeken.

Inleiding

Synaptische verbindingen zijn van cruciaal belang voor neurale circuitfunctie, maar de precieze topologie en fysiologie van synapsen binnen neurale circuits zijn vaak moeilijk experimenteel te onderzoeken. Dit komt omdat elektrische stimulatie, het traditionele instrument van cellulaire elektrofysiologie, lukraak axonen activeert in de buurt van de stimulatiesite, en in de meeste hersengebieden verstrengelen axonen uit verschillende bronnen (lokaal, oplopend en/of dalend). Echter, met behulp van channelrhodopsin assisted circuit mapping (CRACM)1,2, kan deze beperking nu worden overwonnen3. Channelrhodopsine (ChR2) is een licht geactiveerd, kation-selectieve ionenkanaal oorspronkelijk gevonden in de groene alg Chlamydomonas reinhardtii. ChR2 kan worden geactiveerd door blauw licht van een golflengte rond 450-490 nm, depolariseren van de cel door middel van kation instroom. ChR2 werd voor het eerst beschreven en uitgedrukt in Xenopus eicellen door Nagel en collega's4. Kort daarna, Boyden en collega's5 uitgedrukt ChR2 in zoogdierneuronen en toonde aan dat ze lichtpulsen konden gebruiken om betrouwbaar controle spiking op een milliseconde tijdschaal, inducerende actie potentials ~ 10 ms na activering van ChR2 met blauw licht. Optogenetische kanalen met nog snellere kinetiek zijn onlangs gevonden (bijvoorbeeld Chronos6).

De basisbenadering van een CRACM-experiment is om een populatie van vermeende presynaptische neuronen te transfectmet een recombinant adeno-geassocieerd virus (rAAV) dat de genetische informatie voor een channelrhodopsine draagt. Transfection van neuronen met rAAV leidt tot de expressie van de gecodeerde channelrhodopsine. Typisch, de channelrhodopsine is gelabeld met een fluorescerend eiwit zoals GFP (Green Fluorescent Protein) of tdTomato (een rood fluorescerend eiwit), zodat transfection van neuronen in het doelgebied gemakkelijk kan worden bevestigd met fluorescentie beeldvorming. Omdat rAAVs niet-pathogene zijn, een laag ontstekingspotentieel hebben en langdurige genexpressie7,8, zijn ze een standaardtechniek geworden om channelrhodopsinen aan neuronen te leveren. Als, na transfection van een vermeende presynaptische populatie van neuronen, activering van een channelrhodopsine door middel van lichtflitsen lokt postsynaptische potentialen of stromingen in de doelneuronen, dit is het bewijs van een axonale verbinding van de transfected kern naar de geregistreerde cel. Omdat afgehakte axonen in hersenslice experimenten kunnen worden gedreven om neurotransmitter release door middel van channelrhodopsine activering, kernen die buiten de acute slice liggen, maar stuur axonen in de postsynaptische hersengebied kan worden geïdentificeerd met CRACM. De kracht van deze techniek is dat de connectiviteit en fysiologie van geïdentificeerde synaptische ingangen over lange afstand direct kunnen worden onderzocht.

In aanvulling op channelrhodopsins die prikkelbaar zijn door blauw licht, onderzoekers hebben onlangs geïdentificeerd verschillende rood-verschoven channelrhodopsins9,10, met inbegrip van Chrimson en zijn snellere analoge ChrimsonR, die beide zijn enthousiast met rood licht van ~ 660 nm6. Roodverschoven opsinen zijn van belang omdat rood licht weefsel beter doordringt dan blauw licht, en rood licht kan een lagere cytotoxiciteit hebben dan blauw licht10,11,12. Rood verschoven channelrhodopsinen openen ook de mogelijkheid van dual color CRACM experimenten, waarbij de convergentie van axonen uit verschillende kernen op hetzelfde neuron kan worden getest in een experiment6,13,14. Echter, de huidige rood-verschoven opsins vertonen vaak ongewenste kruisactivering met blauw licht15,16,17, waardoor twee kleur experimenten moeilijk. Bovendien hebben sommige rapporten aangegeven dat ChrimsonR beperkte axonale handel ondergaat, wat het moeilijk kan maken om ChrimsonR te gebruiken voor CRACM-experimenten16,17.

Bijna alle opgaande projecties van de lagere auditieve hersenstamkernen komen samen in de inferieure colliculus (IC), de midbrain hub van de centrale auditieve route. Dit omvat projecties van de cochleaire kern (CN)18,19, het grootste deel van het superieure olivariecomplex (SOC)20, en de dorsale (DNLL) en ventrale (VNLL) kernen van de laterale lemniscus21. Bovendien eindigt een grote dalende projectie van de auditieve cortex in de IC18,19,20,21,22, en IC-neuronen zelf synaps breed binnen de lokale en contralaterale kwabben van de IC23. Het vermengen van axonen uit vele bronnen heeft het moeilijk gemaakt om IC-circuits te sondemeten met behulp van elektrische stimulatie24. Als gevolg daarvan, hoewel neuronen in de IC berekeningen uit te voeren belangrijk voor geluidslokalisatie en de identificatie van spraak en andere communicatie geluiden25,26, de organisatie van neurale circuits in de IC is grotendeels onbekend. We hebben onlangs geïdentificeerd VIP neuronen als de eerste moleculair identificeerbare neuron klasse in de IC27. VIP-neuronen zijn glutamatergic stellate neuronen die projecteren op verschillende lange-afstandsdoelen, waaronder de auditieve thalamus en superieure colliculus. We zijn nu in staat om de bronnen en functie van lokale en lange-afstandsingangen voor VIP-neuronen te bepalen en te bepalen hoe deze circuitverbindingen bijdragen aan geluidsverwerking.

Het hier gepresenteerde protocol is afgestemd op het onderzoeken van synaptische ingangen van VIP-neuronen in de IC van muizen, met name van de contralaterale IC en de DCN (Figuur 1). Het protocol kan gemakkelijk worden aangepast aan verschillende bronnen van input, een ander neuron type of een ander hersengebied helemaal. We laten ook zien dat ChrimsonR een effectieve roodverschoven kanaalrhodopsine is voor lange afstand circuit mapping in de auditieve hersenstam. We tonen echter aan dat ChrimsonR sterk wordt geactiveerd door blauw licht, zelfs bij lage intensiteiten, en dus, om ChrimsonR te combineren met Chronos in tweekleurige CRACM-experimenten, moeten zorgvuldige controles worden gebruikt om kruisactivering van ChrimsonR te voorkomen.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

Krijg goedkeuring van het lokale Comité voor institutionele dierenverzorging en -gebruik (IACUC) en houd zich aan de NIH-richtlijnen voor de verzorging en het gebruik van proefdieren. Alle procedures in dit protocol werden goedgekeurd door de Universiteit van Michigan IACUC en waren in overeenstemming met NIH richtlijnen voor de verzorging en het gebruik van proefdieren.

1. Chirurgie Voorbereidingen

  1. Voer operaties uit in aseptische omstandigheden. Autoclave/steriliseren alle chirurgie hulpmiddelen en materialen vóór chirurgie. Draag een operatie jurk en masker voor de operatie.
  2. Sanitize de operatie gebied (spray en veeg met 70% ethanol), en plaats steriele handdoek gordijnen om de operatie gebied te dekken.
  3. Bereid de herstelkooi voor. Verwijder kooibeddengoed om het risico op verstikking te beperken. Leg een verwarmingskussen onder de kooi. Zorg voor een voedsel- en waterbron.
  4. Trek een glazen capillaire voor de nanoinjector op een pipet trekker. De intense warmte van de verwarmingsgloeidraad tijdens het trekproces zal de glascapillaire steriliseren. Snijd of breek de punt af om een opening met een diameter van ongeveer 5 μm te verkrijgen.
  5. Schuin de capillaire punt tot een hoek van ongeveer 30° om de weefselpenetratie te verbeteren en verstopping te verminderen. Vul de capillaire met minerale olie en voeg in een nanoliter injector.
  6. Verkrijg een aliquot van de gewenste channelrhodopsin-encoding rAAV en verdun tot de gewenste titer met behulp van steriele PBS.
    OPMERKING: We hebben vastgesteld dat serotype 1 rAAVs goed werken voor transfection van auditieve hersenstam kernen. Met name rAAV1.Syn.Chronos-GFP.WPRE.bGH (blauw licht geactiveerde kanaalrhodopsine) en rAAV1.Syn.ChrimsonR-tdTomato.WPRE.bGH (roodverschoven kanaalrhodopsine), die beschikbaar zijn in openbaar toegankelijke repositories en vectorkernen, consequent opleveren de hoge expressie niveaus en een goede lange afstand axonale handel in channelrhodopsins die nodig zijn voor CRACM experimenten.
  7. Volg injectorinstructies om voorin te vullen capillair met 1-3 μL rAAV in steriele PBS.

2. Chirurgie

  1. Zet het dier in een inductiekamer en induceer anesthesie met 3% isoflurane in zuurstof geleverd via een gekalibreerde isoflurane vaporizer. Observeer de muis tot de ademhaling wordt diep en langzaam en een teen knijpen reflex is afwezig, ongeveer 3-5 min.
  2. Breng het dier naar een stereotaxic frame. Zet het hoofd van het dier vast door zijn mond op een mondbar te zetten met een gasanesthesiemasker en door niet-perforerende oorstaven in beide oorkanalen te plaatsen.
  3. Plaats een rectale temperatuursonde en schakel de homeostatische temperatuurregelaar in.
  4. Breng oogheelkundige zalf aan om te voorkomen dat de ogen uitdrogen.
  5. Preëmptief pijnstillend (bijv. onderhuidse injectie van 5 mg/kg carprofen).
  6. Pas isoflurane aan 1-2,5%, afhankelijk van de diepte van de verdoofde toestand. Controleer de temperatuur, ademhaling en kleur van slijmvliezen ten minste om de 15 minuten tijdens de procedure.
  7. Scheer hoofdhuid met elektrische tondeuses. Aseptisch bereiden hoofdhuid met drie afwisselende wattenstaafjes van povidone-jodium en 70% ethanol.
  8. Maak een incisie in de hoofdhuid langs de middellijn beginnen tussen de oren en de voortzetting van rostral aan de ogen, bloot de lambda en bregma hechtingen. Duw de huid naar de zijkant en verwijder periosteum van blootgesteld bot indien nodig.
  9. Markeer de lambda hechting met een steriele chirurgische marker, plaats het puntje van de nanoinjector, zodat het gewoon lambda aanraakt, en nul de micromanipulator coördinaten. Gebruik de nanoinjectortip en micromanipulator om het hoogteverschil tussen de lambda- en bregma-hechtingen te meten. Pas de smaakbalkhoogte aan om lambda en bregma binnen ± 100 μm hoogteverschil te brengen.
  10. Breng de injectieplaats in kaart met behulp van de nanoinjectortip en het micromanipulatorcoördinatiesysteem en markeer de site met een steriele chirurgische marker. Als u de IC of DCN van P21-P30-muizen wilt injecteren, gebruikt u coördinaten ten opzichte van de lambdahechting, zoals aangegeven in tabel 1. Merk op dat de Z diepte in onze coördinaten wordt gemeten vanaf het oppervlak van de schedel bij lambda.
  11. Gebruik een micromotorische boor met een steriele boorbraam van 0,5 mm om een craniotomie uit te voeren boven de injectieplaats.
  12. Om te zorgen voor een brede transfection van neuronen in de doelkern, injecties te maken op verschillende diepten in het weefsel(Tabel 1, Z coördinaten), en, in het geval van grotere hersengebieden zoals de IC, injecties te maken in de loop van twee of meer penetraties op verschillende X en Y coördinaten(Tabel 1, Juiste IC penetratie 1 en Rechts IC penetratie 2).
  13. Voer injecties uit. Voor IC-injecties deponeert u 20 nL virus met intervallen van 250 μm langs de Z-as (injectiediepte) tussen 2.250 μm en 1750 μm diepte. Voor DCN-injecties deponeert u 20 nL virus op een diepte van respectievelijk 4.750 μm en 4.550 μm.
  14. Wacht na injectie bij elke Z-coördinaat 2-3 minuten voordat u de injector naar de volgende Z-coördinaat verplaatst. Dit zal tijd voor het virus om zich te verspreiden uit de buurt van de injectie plaats, het verminderen van de kans dat het virus zal worden opgezogen de injectie kanaal wanneer de nanoinjector wordt verplaatst.
  15. Wacht na de laatste injectie in een penetratie 3-5 minuten voordat u nanoinjector uit de hersenen terugtrekt.
  16. Wanneer de nanoinjector uit de hersenen wordt verwijderd tussen penetraties en tussen dieren, gooi je een klein volume virus uit de punt om te controleren of de tip niet verstopt is.
  17. Gebruik na injecties steriele PBS om de snijkanten van de hoofdhuid nat te maken en beweeg de huid vervolgens voorzichtig terug naar de middellijn. Sluit de wond met eenvoudige onderbroken hechtingen met behulp van 6-0 (0,7 metrische) nylon hechtingen.
  18. Breng 0,5-1 mL van 2% lidocainegel aan op de wond.
  19. Verwijder oorstaven en temperatuursonde, schakel isoflurane uit, verwijder de muis uit de gehemeltebalk en breng deze over naar de herstelkooi.
  20. Controleer het herstel op de voet. Zodra het dier volledig wakker is, bewegen, en het tonen van geen tekenen van pijn of nood, breng het terug in zijn kooi en keer de kooi terug naar het vivarium.
  21. Als operaties zullen worden uitgevoerd op meerdere dieren in een dag, gebruik maken van een hete kraal sterilisator te ontsmetten chirurgie tools en boor braam voor de volgende operatie.

3. Chirurgische follow-up

  1. Controleer dieren dagelijks op wondsluiting, infectie of tekenen van pijn of nood in de komende 10 dagen, en zich aan de richtlijnen voor dierenverzorging van de instelling.
  2. Wacht 3-4 weken voordat u dieren in experimenten gebruikt om de kanaalropsinen optimaal te laten worden expressie.

4. Brain Slice Voorbereiding en bevestiging van injectie doel

  1. Gebruik voor CRACM scherp bereide hersenschijfjes van getransfecteerde dieren in standaard in vitro elektrofysiologie-experimenten, die hier slechts kort worden beschreven (zie Goyer et al. 2019 voor een meer gedetailleerde beschrijving27).
  2. Bereid kunstmatige hersenvocht (ACSF) voor die (in mM): 125 NaCl, 12,5 D-glucose, 25 NaHCO3, 3 KCl, 1,25 NaH2PO4, 1,5 CaCl2, 1 MgSO4. Bubble ACSF naar een pH van 7,4 met 5% CO2 in 95% O2.
  3. Voer alle volgende stappen uit, inclusief in vitro elektrofysiologie, in bijna-duisternis of rood licht om de activering van channelrhodopsinen te beperken.
  4. Diep verdoven muis met isoflurane en onthoofden het snel. Ontleed de hersenen snel in ~34 °C ACSF.
  5. Snijd coronale plakjes (200-250 μm) met de IC in ~34 °C ACSF met een trillend microtoom en uitbroed de plakjes bij 34 °C gedurende 30 min in een met ACSF gevulde holdingkamer met 5% CO2 in 95% O2. Na incubatie, op te slaan plakjes op kamertemperatuur tot gebruikt voor opnames.
  6. Als het injectiedoel niet de IC was, snijd dan extra coronale plakjes van het geïnjecteerde hersengebied en controleer de transfection van de doelkern onder een fluorescentiemicroscoop. Als er geen transfection in de doelkern of extra transfection in verschillende hersenengebieden is, ga niet met experiment verder.

5. In Vitro Recording en CRACM Experiment

OPMERKING: Om optische stimulatie van Chronos en ChrimsonR te bieden, gebruiken we LED's gekoppeld aan de epifluorescentiepoort van de microscoop. Lasers kunnen echter worden gebruikt in plaats van LED's. Bij het gebruik van lasers, het verkrijgen van voorafgaande goedkeuring van institutionele veiligheidsfunctionarissen en volg passende richtlijnen voor veilig lasergebruik.

  1. Trek elektroden uit borosilicaatglas naar een weerstand van 3,5-4,5 MΩ. De interne elektrodeoplossing moet (in mM): 115 K-gluconaat, 7,73 KCl, 0,5 EGTA, 10 HEPES, 10 Na2 phosphocreatine, 4 MgATP, 0,3 NaGTP, aangevuld met 0,1% biocytine (w/v), pH aangepast tot 7,3 met KOHmol en osmaliteit tot 290 mOsm/kg met sacharose.
  2. Gebruik standaard patchklemmethoden om opnames te maken. Plaats het segment in een opnamekamer onder een vaste trap rechtop microscoop en continu doorbezielen met ACSF op ~ 2 mL/min. Voer opnames in de buurt van fysiologische temperatuur (~ 34-36 °C).
  3. Patch neuronen onder visuele controle met behulp van een geschikte patch klem versterker. Corrigeer voor serieweerstand, pipetcapaciteit en vloeibaar verbindingspotentieel.
  4. Activeer tijdens hele celopnames Chronos door korte pulsen (1-5 ms) van 470 nm licht of ChrimsonR te leveren door korte pulsen van 580 nm licht door commercieel verkrijgbare LED's. Bepaal de drempel van opsin activering en gebruik een minimale stimulatie protocol om berichtenynaptische mogelijkheden uit te lokken. Gebruik in het algemeen de kortste stimulusduur die een PSP uitlokt en stel de optische kracht in op 120% van het drempelvermogen dat nodig is om PSPs uit te lokken.
  5. Om te bevestigen dat de geregistreerde veranderingen in membraanpotentieel inderdaad synaptische ingangen zijn voor het neuron, kunnen standaard antagonisten voor excitatory/inhibitory postsynaptische receptoren tijdens het experiment worden gewassen. Om verschillende receptorbijdragen aan een PSP te onderzoeken (bijvoorbeeld NMDA vs AMPA-receptoren), kunnen geschikte receptorantagonisten worden gewassen. Voor elke receptor antagonist, drug effecten moeten omkeren na washout.
  6. Gebruik de latentie, jitter en betrouwbaarheid van PSPs om te bevestigen dat lichtgeactiveerde synaptische ingangen afkomstig zijn van directe, optische activering van synapsen op het opgenomen neuron, in tegenstelling tot activering van channelrhodopsin-uitdrukkende synapsen op een tussenliggende neuron dat synapsen op het geregistreerde neuron. Over het algemeen lage latentie (<2 ms), lage jitter (<1 ms standaarddeviatie in latentie) en hoge betrouwbaarheid (>50%) geven een directe synaptische verbinding van de channelrhodopsine uitdrukken presynaptic neuron naar de opgenomen neuron.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

We staken VIP-IRES-Cre muizen (Viptm1 (cre)Zjh/J) en Ai14 Cre-reporter muizen (B6. Cg-Gt(ROSA)26Sortm14(CAG-tdTomato)Hze/J) om F1-nakomelingen te genereren waarin VIP-neuronen het fluorescerende eiwit tdTomato uitdrukken. F1 nakomelingen van beide geslachten werden gebruikt, leeftijd postnatale dag (P) 21 tot P70. In totaal werden 22 dieren gebruikt in deze studie.

Stereotaxic injectie van...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

We hebben ontdekt dat CRACM is een krachtige techniek voor het identificeren en karakteriseren van lange afstand synaptische ingangen aan neuronen in de muis IC. Naar aanleiding van het protocol dat hier is beschreven, bereikten we robuuste transfection van neuronen in de DCN en IC, evenals betrouwbare axonale handel van Chronos en ChrimsonR naar synaptische terminals in de IC. Daarnaast hebben we aangetoond dat deze techniek het mogelijk maakt om berichtenynaptische gebeurtenissen te meten en te analyseren, waaronder PS...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

Dit werk werd ondersteund door een Deutsche Forschungsgemeinschaft Research Fellowship (GO 3060/1-1, projectnummer 401540516, aan DG) en National Institutes of Health grant R56 DC016880 (MTR).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

```html
Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
AAV1.Syn.ChrimsonR-tdTomato.WPRE.bGHAddgene59171-AAV1
AAV1.Syn.Chronos-GFP.WPRE.bGHAddgene59170-AAV1
Ai14 reporter muizen (B6.Cg-Gt(ROSA)26Sortm14(CAG-tdTomato)Hze/J)Jackson Laboratorystock #007914
Amber (590nm) LUXEON Rebel LEDLuxeon Star LEDsSP-01-A8
Blauw (470nm) LUXEON Rebel LEDLuxeon Star LEDsSP-01-B4
Carproject (carprofen)Henry Schein Animal Health59149
Drummond glas capillairenDrummond Scientific Company3-000-203-G/X
Drummond Nanoject 3Drummond Scientific Company3-300-207
Elektrode schuinmakerSutter InstrumentFG-BV10-D
Ethilon 6-0 (0.8 metrisch) nylon hechtdraadEthiconlocal pharmacy
Vaste stage microscoopanyn/a
Gasanesthesie hoofdhouderDavid Kopf Instruments933-B
Algemene chirurgische instrumentenFine Science ToolsN/A
Golden A5 huisdieren clipperOster078005-010-003
VerwarmingspadCustom buildN/A
Inductiekamer met kap en vacuümsysteemPatterson Scientific78917760
Hot bead steriele Steri 250InotechIS-250
Jodium oplossing 10%MedChoicelocal pharmacy
Isoflurane verdamperPatterson Scientific07-8703592
Lidocaïne topische gel 2%Akornlocal pharmacy
Micro motor boor 1050Henry Schein Animal Health7094351
Micro motor boortje 0,5 mmFine Science Tools19007-05
Gemotoriseerde MicromanipulatorSutter InstrumentMP-285/R
Oftalmische zalf Artificial TearsAkornlocal pharmacy
P-1000 elektrode pullerSutter InstrumentP-1000
Patch clamp versterker met data verzamel softwareanyn/a
Draagbare anesthesie machinePatterson Scientific07-8914724
Klein dier stereotaxisch frameDavid Kopf Instruments930-B
Standaard chemicaliënlocal vendorsN/A
standaard beeldopname oplossingen
Steriele doek drapenDynarex4410
Chirurgische markerFine Science Tools18000-30
TemperatuurregelaarCustom buildN/A
Vibratomeanyn/a
VIP-IRES-Cre muizen (Viptm1(cre)Zjh/J)Jackson Laboratorystock #010908
Waterbadanyn/a
```

Referenties

  1. Petreanu, L., Huber, D., Sobczyk, A., Svoboda, K. Channelrhodopsin-2-assisted circuit mapping of long-range callosal projections. Nature Neuroscience. 10, 663-668 (2007).
  2. Atasoy, D., Aponte, Y., Su, H. H., Sternson, S. M. A FLEX Switch Targets Channelrhodopsin-2 to Multiple Cell Types for Imaging and Long-Range Circuit Mapping. Journal of Neuroscience. 28, 7025-7030 (2008).
  3. Deisseroth, K. Optogenetics. Nature Methods. 8, 26-29 (2011).
  4. Nagel, G., et al. Channelrhodopsin-2, a directly light-gated cation-selective membrane channel. Proceedings of the National Academy of Sciences. 100, 13940-13945 (2003).
  5. Boyden, E. S., Zhang, F., Bamberg, E., Nagel, G., Deisseroth, K. Millisecond-timescale genetically targeted optical control of neural activity. Nature Neuroscience. 8, 1263-1268 (2005).
  6. Klapoetke, N. C., et al. Independent optical excitation of distinct neural populations. Nature Methods. 11, 338-346 (2014).
  7. Flotte, T. R. Gene Therapy Progress and Prospects: Recombinant adeno-associated virus (rAAV) vectors. Gene Therapy. 11, 805-810 (2004).
  8. Aponte-Ubillus, J. J., et al. Molecular design for recombinant adeno-associated virus (rAAV) vector production. Applied Microbiology and Biotechnology. 102, 1045-1054 (2018).
  9. Kim, C. K., et al. Simultaneous fast measurement of circuit dynamics at multiple sites across the mammalian brain. Nature Methods. 13, 325-328 (2016).
  10. Lin, J. Y., Knutsen, P. M., Muller, A., Kleinfeld, D., Tsien, R. Y. ReaChR: a red-shifted variant of channelrhodopsin enables deep transcranial optogenetic excitation. Nature Neuroscience. 16, 1499-1508 (2013).
  11. Mager, T., et al. High frequency neural spiking and auditory signaling by ultrafast red-shifted optogenetics. Nature Communications. 9, (2018).
  12. Oda, K., et al. Crystal structure of the red light-activated channelrhodopsin Chrimson. Nature Communications. 9, (2018).
  13. Hooks, B. M. Dual-Channel Photostimulation for Independent Excitation of Two Populations. Current Protocols in Neuroscience. 85, e52(2018).
  14. Schild, L. C., Glauser, D. A. Dual Color Neural Activation and Behavior Control with Chrimson and CoChR in Caenorhabditis elegans. Genetics. 200, 1029-1034 (2015).
  15. Rost, B. R., Schneider-Warme, F., Schmitz, D., Hegemann, P. Optogenetic Tools for Subcellular Applications in Neuroscience. Neuron. 96, 572-603 (2017).
  16. Maimon, B. E., Sparks, K., Srinivasan, S., Zorzos, A. N., Herr, H. M. Spectrally distinct channelrhodopsins for two-colour optogenetic peripheral nerve stimulation. Nature Biomedical Engineering. 2, 485(2018).
  17. Asrican, B., et al. Next-generation transgenic mice for optogenetic analysis of neural circuits. Frontiers in Neural Circuits. 7, (2013).
  18. Oliver, D. L. Dorsal cochlear nucleus projections to the inferior colliculus in the cat: A light and electron microscopic study. Journal of Comparative Neurology. 224, 155-172 (1984).
  19. Oliver, D. L. Projections to the inferior colliculus from the anteroventral cochlear nucleus in the cat: Possible substrates for binaural interaction. Journal of Comparative Neurology. 264, 24-46 (1987).
  20. Glendenning, K. K., Masterton, R. B. Acoustic chiasm: efferent projections of the lateral superior olive. Journal of Neuroscience. 3, 1521-1537 (1983).
  21. Adams, J. C. Ascending projections to the inferior colliculus. Journal of Comparative Neurology. 183, (1979).
  22. Winer, J. A., Larue, D. T., Diehl, J. J., Hefti, B. J. Auditory cortical projections to the cat inferior colliculus. Journal of Comparative Neurology. 400, 147-174 (1998).
  23. Saldaña, E., Merchań, M. A. Intrinsic and commissural connections of the rat inferior colliculus. Journal of Comparative Neurology. 319, 417-437 (1992).
  24. Sivaramakrishnan, S., Sanchez, J. T., Grimsley, C. A. High concentrations of divalent cations isolate monosynaptic inputs from local circuits in the auditory midbrain. Frontiers in Neural Circuits. 7, (2013).
  25. Felix, R. A., Gourévitch, B., Portfors, C. V. Subcortical pathways: Towards a better understanding of auditory disorders. Hearing Research. 362, 48-60 (2018).
  26. Winer, J. A., Schreiner, C., et al. The inferior colliculus: with 168 illustrations. Winer, J. A., Schreiner, C. , Springer. New York, NY. (2005).
  27. Goyer, D., et al. A novel class of inferior colliculus principal neurons labeled in vasoactive intestinal peptide-Cre mice. eLife. 8, e43770(2019).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Stereotaxische co rdinatenwhole cell patch clampChronos ChrimsonRdorsale cochleaire kernlange afstandsprojectiesauditieve hersenstamvirale injectiechirurgieoptische activatie

Gerelateerde artikelen