Groei van menselijke en schapen hoornvlies endotheliale cellagen op biomateriële membranen

Samenvatting

Dit protocol beschrijft de kritieke stappen die nodig zijn om hoornvliesendotheliale celculturen uit explants van menselijk of schapenweefsel vast te stellen en te kweken. Er wordt ook een methode gepresenteerd voor het subculturen van hoornvliescellen op membranous biomaterialen.

Samenvatting

Hoornvlies endotheelcelculturen hebben de neiging om epitheel-naar-mesenchymale overgang (EMT) te ondergaan na verlies van cel-op-cel contact. EMT is schadelijk voor de cellen omdat het hun vermogen om een volwassen en functionele laag te vormen vermindert. Hier presenteren we een methode voor het vaststellen en subcultureren van menselijke en schapen hoornvlies endotheliale celculturen die het verlies van cel-op-cel contact minimaliseert. Explants van hoornvlies endothehelium / Descemet's membraan worden genomen uit donorhoornvliezen en geplaatst in weefselcultuur onder omstandigheden die het mogelijk maken de cellen collectief migreren naar het cultuuroppervlak. Zodra een cultuur is vastgesteld, worden de explants overgebracht naar verse platen om nieuwe culturen te initiëren. Dispase II wordt gebruikt om klontjes cellen voorzichtig van weefselkweekplaten te tillen voor subculturing. Hoornvlies endotheelcelculturen die met dit protocol zijn vastgesteld, zijn geschikt voor de overdracht naar biomateriële membranen om weefsel-gemanipuleerde cellagen te produceren voor transplantatie in dierproeven. Een op maat gemaakt apparaat voor de ondersteuning van biomateriële membranen tijdens weefselkweek wordt beschreven en een voorbeeld van een weefsel-engineered graft samengesteld uit een laag hoornvlies endotheelcellen en een laag hoornvlies stromal cellen aan weerszijden van een collageen type I membraan wordt gepresenteerd.

Inleiding

Het hoornvlies is een transparant weefsel dat zich aan de voorkant van het oog bevindt. Het bestaat uit drie grote lagen: een epitheellaag op het buitenoppervlak, een middelste stromalaag en een binnenste laag genaamd het hoornvliesendotheel. Het hoornvlies endothehelium is een monolaag van cellen die zit op een kelder membraan genaamd Descemet's membraan en het handhaaft de transparantie van het hoornvlies door het reguleren van de hoeveelheid vloeistof die de stroma van de onderliggende waterige humor. Te veel vocht in de stroma veroorzaakt hoornvlies zwelling, dekking en verlies van het gezichtsvermogen. Het endotheel is daarom van vitaal belang voor het behoud van visie.

Het hoornvlies endotheel kan disfunctioneel worden om een aantal redenen, waaronder veroudering, ziekte en letsel, en de enige huidige behandeling is transplantatie chirurgie. Tijdens deze operatie worden het endotheel en het membraan van Descemet uit het hoornvlies van de patiënt verwijderd en vervangen door een graft van endotheel en het membraan van Descemet verkregen uit een donorhoornvlies. Veel endotheelgrafts bevatten ook een dunne laag stromal weefsel om de behandeling en gehechtheid aan het gastheerhoornvlies te helpen¹.

Wereldwijd is de vraag naar hoornvliesdonorweefsel voor transplantatieoperaties groter dan het bedrag dat door oogbanken kan worden geleverd². Er is daarom een drive om weefsel-engineered hoornvlies endotheeltransplantaties die kunnen worden gebruikt om dit tekort te verlichten³ontwikkelen. De reden hiervoor is gebaseerd op het feit dat momenteel, endotheel van een individueel hoornvlies kan alleen worden overgedragen aan een enkele patiënt, echter, als het hoornvlies endotheel cellen werden voor het eerst uitgebreid en geteeld op biomateriële steigers in weefselcultuur, ze kunnen worden gebruikt om meerdere patiënten te behandelen.

Grote uitdagingen die moeten worden aangepakt voordat weefsel-engineered hoornvlies endotheeltransplantaties een haalbare optie voor chirurgen worden: (1) het vaststellen van technieken voor het uitbreiden van hoornvlies endotheelcellen van hoge kwaliteit en voor het produceren van volwassen en functionele hoornvlies endotheel cellagen in vitro, en (2) het vaststellen van technieken voor het kweken van de cellen op biomateriële steigers om weefsel-engineered grafts die gelijk zijn aan, of beter dan, de donor hoornvlies-afgeleide grafts die momenteel worden gebruikt te produceren.

Hoornvliesendotheliale cellen hebben een zeer laag proliferative potentieel in vivo, maar kunnen worden gestimuleerd om in vitro te verdelen⁴. Niettemin hebben ze een sterke neiging om in vitro epitheel-naar-mesenchymale overgang (EMT) te ondergaan, wat hun vermogen om een volwassen, functionele endotheellaag te vormen vermindert. Bekende triggers voor EMT in hoornvlies endotheelcellen zijn blootstelling aan bepaalde groeifactoren en verlies van cel-op-cel contact⁵. Het is dus bijna onvermijdelijk dat hoornvliesendotheliale celculturen die enzymatisch gescheiden zijn tijdens de subcultuur veranderingen zullen ondergaan die verband houden met EMT. Hier presenteren we een celkweekmethode voor menselijke of schapen hoornvliesendotheliale cellen die is ontworpen om verstoring van cel-cel-celcontacten tijdens isolatie-, expansie- en subcultuurfasen te minimaliseren, om het potentieel voor EMT te verminderen. Bovendien tonen we aan hoe weefsel-engineered grafts die lijken op donor hoornvlies-afgeleide endotheel / Descemet's membraan / stromal weefsel grafts kunnen worden geproduceerd door groeiende gekweekte cellagen aan beide zijden van een bio-materiaal membraan in een op maat gemaakte montage-apparaat.

Protocol

Menselijke hoornvliezen met donortoestemming voor onderzoek werden verkregen van de Queensland Eye Bank en gebruikt met ethische goedkeuring van de Metro South Hospital en Health Service's Human Research Ethics Committee (HREC/07/QPAH/048). Schapen hoornvliezen werden verkregen uit geëuthanaseerde dieren op de Herston Medical Research Facility van de Universiteit van Queensland onder een weefsel delen overeenkomst.

1. Bereiding van hulpmiddelen voor ontleding

1. Steriliseren twee paar van nummer 4 horlogemaker forceps door ofwel weken ze in een oplossing van 70% ethanol voor 5 min of door autoclaving hen.

2. Bereiding van kweekmedium- en weefselkweekplaten

1. Bereid 100 mL kweekmedium met Opti-MEM 1 (1x) + GlutaMAX-1, 5% foetaal runderserum en 100 U/mL Pen/Strep. Dit kweekmedium is voldoende voor schapenhoornvliescelculturen, maar voor menselijke hoornvliesendotheliale celculturen moet het medium worden aangevuld met 50 μg/mL runderpituitary extract, 0,08% chondroitinsulfaat, 200 μg/mL calciumchloride en 0,3 mM L-ascorbinezuur 2-fosfaat. Kweekmedium kan twee weken lang in het donker bij 4 °C worden opgeslagen.
2. Bestrijk de putten van een 6-goed weefsel kweekplaat met Attachment Factor met behulp van de instructies van de fabrikant en voeg vervolgens 1 mL kweekmedium toe aan elke goed gecoate gecoate. Bereid een goed voor elk hoornvlies.

3. Explant dissectie en celkweekprocedure

1. Plaats het hoornvlies, endotheel kant omhoog, in een steriele petrischaal op het podium van een ontledende microscoop. Pas de verlichting zo aan dat het hoornvliesoppervlak goed verlicht is met voldoende contrast om de endotheellaag te markeren. Pas de zoom zo in dat de rand en een centraal hoornvliesendotheel in zicht is.
2. Gebruik gesteriliseerde horlogemaker forceps om voorzichtig lift en scheur Descemet's membraan uit de buurt van de onderliggende stroma (Figuur 1). Het membraan zal loskomen van de stroma als een strip die onmiddellijk opgerold. Plaats de strip in een put van een 6-goed weefsel kweekplaat die is bekleed met Attachment Factor en bevat 1 mL van cultuur medium. Het deksel van de weefselkweekplaat moet te allen tijde worden ingeschakeld, behalve wanneer er explanten aan worden toegevoegd, om het risico op besmetting te verminderen.
3. Verwijder strips van Het membraan van Descemet uit de extreme periferie van het endotheel eerst en vervolgens uit centrale gebieden later. Plaats alle stroken van één hoornvlies in één enkele put binnen de 6-put plaat.
4. Bebroed de explants in een bevochtigde celkweekincubator op 5% CO₂ en 37 °C. Laat de cultuur 2 dagen ongestoord staan om de explants te laten verzinken en aan het plaatoppervlak te bevestigen. Meestal, tot een derde van de explants niet te hechten aan de plaat.
5. Verwijder het medium en eventuele niet-aangesloten explants na 4 dagen uit de cultuur en voeg voorzichtig 2 mL vers kweekmedium toe, waarbij ervoor wordt gezorgd dat de bijgevoegde explants niet worden verstoord. Cultuurmedium moet twee keer per week worden gewijzigd.

4. Continue productie van hoornvliesendotheelcellen door seriële explantcultuur

OPMERKING: Explants kunnen na 10 dagen worden overgebracht naar verse weefselkweekplaten om extra hoornvliescelculturen vast te stellen.

1. Plaats de explantcultuur op het podium van een ontledende microscoop en pas de verlichting aan en zoom zodat de explants zichtbaar zijn.
2. Met behulp van gesteriliseerde horlogemaker forceps, voorzichtig plukken elke explant uit zijn cultuur plaat en breng het naar een frisse put van een 6-goed weefsel cultuur plaat die is bekleed met Attachment Factor en bevat 1 mL van cultuur medium.
3. Laat de explants zich 4 dagen op het oppervlak van hun nieuwe plaat nestelen voordat ze het kweekmedium vervangen door 2 mL vers kweekmedium. Verandering cultuur medium veranderd twee keer per week.

5. Teelt hoornvliesendotheliale cellen op glashoezen voor immunofluorescentieanalyses

OPMERKING: Celculturen die bestemd zijn om te worden geanalyseerd met behulp van immunofluorescentie moeten worden vastgesteld op glazen afdekkingen die na de kleuringsprocedure op glazen microscoopdia's kunnen worden gemonteerd.

1. Steriliseren van een pak ronde glazen afdekkingen met een diameter van 13 mm in een autoclave of door gedurende 15 minuten 70% ethanol te weken, gevolgd door drie spoelingen in fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS).
2. Plaats individuele coverslips in de putten van een 24-put weefsel cultuur plaat, coat ze met Attachment Factor, en voeg dan 0,5 mL van de cultuur medium aan elke put.
3. Met behulp van gesteriliseerde horlogemaker forceps verwijderen explants uit hun weefsel cultuur platen en breng ze naar putten met coverslips. Laat de explants zich 4 dagen op de coverslips nestelen voordat ze het medium veranderen.
4. Na de vereiste incubatietijd, vast te stellen en vlekken op de coverslip culturen binnen hun cultuur putten. Monteer de gekleurde coverslips op glazen microscoopdia's voor analyse onder een fluorescentiemicroscoop.

6. Subcultuur van hoornvliesendotheliale cellen met Dispase II

OPMERKING: Grote fibroblastische cellen kunnen selectief worden verwijderd uit explant culturen in 6-goed platen voordat subculturing met behulp van deze procedure. Als alle cellen moeten worden subcultuurd, voer dan geen stappen 6.2 tot 6.4 uit. Het doel van deze procedure is om de cellen over te brengen naar verse platen met behoud van hun cel-naar-cel contacten zoveel mogelijk. De cellen moeten voorzichtig worden behandeld. Volledig confluent putten moeten worden doorgepassaged op een verhouding van 1:2, terwijl subconfluent putten moeten worden doorgepassaged bij een verhouding van 1:1 of minder.

1. Haal het medium uit de cultuur en spoel kort af met DPBS.
2. Voeg 1 mL Versene toe. Incubeer bij kamertemperatuur voor 30 s.
3. Verwijder de Versene en voeg 1 mL TrypLE toe. Incubeer bij 37 °C in de weefselkweekincubator gedurende 3 min.
4. Observeer de cultuur met behulp van een fase contrast microscoop. Tik voorzichtig op de cultuur om cellen van de plaat los te maken. Zodra de grote fibroblastische cellen hebben losgemaakt van de plaat verwijder ze en de TrypLE met behulp van een 1 mL pipet. Was de resterende TrypLE van de resterende cellen door twee maal te spoelen met 2 mL DPBS.
5. Voeg 1 mL van 1 mg/mL Dispase II toe aan de kweek en incubeer in de weefselkweekincubator gedurende 1 tot 2 uur of totdat alle cellen van de plaat zijn losgemaakt. De cellen moeten geleidelijk wegdrijven van de plaat in klonten.
6. Verzamel de cellen met behulp van een 1 mL pipet en breng over op 20 mL DPBS in een centrifugebuis van 50 mL. Centrifugeer gedurende 5 min bij 300 x g bij kamertemperatuur.
7. Verwijder de supernatant en voorzichtig opnieuw de cel pellet door trituratie met een 1 mL pipetin in 1 mL van cultuur medium. Breng de celvering over op één of twee putten van een 6-putplaat, naar passage bij een verhouding van respectievelijk 1:1 of 1:2.
8. Vul het medium in elke put aan om 2 mL te maken en plaats de culturen in de weefselkweekincubator. Vervang het medium twee keer per week door 2 mL vers medium.

7. Groei van hoornvliesendotheliale cellagen op biomateriële membranen

OPMERKING: De volgende procedure beschrijft de stappen die betrokken zijn bij het monteren van een membranous biomateriaal in een op maat gemaakt montageapparaat - een micro-Boyden-kamer genoemd - voor celcultuur. Raadpleeg onze recente publicatie⁶ voor meer informatie over het apparaat en voor aankoopgegevens.

1. Monteer de bovenste kamer van de micro-Boyden kamer door het plaatsen van een rode O-ring in het midden.
2. Gebruik een trephine met een diameter van 18 mm om een schijf uit een biomateriaalplaat op een polytetrafluorethyleen (PTFE) snijplaat te slaan. Plaats deze schijf over de rode O-ring in de bovenkamer van de micro-Boyden kamer.
3. Schroef de onderste kamer op de bovenste kamer en vastzet de biomateriaalschijf ertussen.
4. Week de geassembleerde micro-Boyden kamer in 70% ethanol voor 1 uur om het te steriliseren.
5. Dompel de geassembleerde micro-Boyden-kamer gedurende 10 min volledig onder in steriele HBSS om de ethanol te verwijderen. Herhaal deze wasstap twee keer. Voer een laatste wasstap uit voor 10 min in onaangevuld kweekmedium.
6. Breng de gesteriliseerde micro-Boyden kamer naar kweekmedium in de put van een 6-put plaat ervoor te zorgen dat de bovenste kamer is bovenste. Pas het niveau van kweekmedium aan zodat het het onderste oppervlak van het biomateriaalmembraan raakt, maar niet in de bovenste kamer stroomt.
7. Bereid een suspensie van hoornvlies endotheelcellen met behulp van de procedure beschreven in sectie 6. Er moet voldoende celdichtheid in de suspensie worden bereikt om een zaaidichtheid van ten minste 100.000 cellen per cm² op het membraan in de micro-Boyden-kamer mogelijk te maken. Het kweekoppervlak binnen de micro-Boyden kamer is 0,5 cm² en kan een volume van 100 μL bevatten. Daarom moet een suspensie met 500.000 cellen/mL worden voorbereid.
8. Pipetteer 100 μL celsuspensie (50.000 cellen) op het membraan in de micro-Boyden-kamer. Incubeer in de weefselkweekincubator gedurende 4 uur voordat u het medium bijvult om de kamer volledig onder te dompelen. Incubeer de cultuur voor de vereiste periode van tijd, ter vervanging van het medium twee keer per week.
   OPMERKING: Zodra het hoornvlies endotheel cellen hebben bevestigd aan het bovenste oppervlak van het biomateriaal membraan de micro-Boyden kamer kan worden omgedraaid binnen de cultuur goed, zodat de onderste kamer is bovenste. Meer cellen kunnen vervolgens worden toegevoegd aan de kamer om celculturen te initiëren op het andere oppervlak van het membraan. Bijvoorbeeld, hoornvlies stromal cellen kunnen gemakkelijk worden toegepast op het alternatieve oppervlak waardoor het nabootsen van de relatieve locatie van hoornvlies celtypes zoals gezien in het achterste hoornvlies.

Resultaten

De methode voor het isoleren en uitbreiden van hoornvliescellen van menselijke of schapenhoornvliezen wordt samengevat in figuur 1 en figuur 2. De meeste explants die zijn afgeleid van de hoornvliezen van 1 tot 2-jarige schapen of menselijke donoren van minder dan 30 jaar oud zal hechten aan Attachment Factor-gecoate weefsel kweekplaten binnen een week, echter, is het niet ongebruikelijk om te vinden dat tot een derde van de explants niet hechten binnen deze tij...

Discussie

Een belangrijke technische uitdaging in verband met het opzetten en uitbreiden van menselijke hoornvlies endotheelcellen is het voorkomen van EMT optreden in de culturen. EMT kan worden geactiveerd in hoornvlies endotheelcellen door verlies van cel-op-cel contact, maar de meeste celkweek protocollen voor deze cellen te betrekken enzymatische dissociatie naar enkele cellen tijdens isolatie en subcultuur¹⁰. Hier presenteren we een alternatief celkweekprotocol voor hoornvliesendotheliale cellen dat h...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Aanhechtingsfactor	Gibco	S006100	Een 1X steriele oplossing met gelatine die gebruikt wordt om weefselkweekoppervlakken te coaten. Bewaren bij 4 °C.
Runderhypofyse-extract	Gibco	13028014	Een enkele flacon bevat 25 mg. In porties invriezen.
Calciumchloride	Merck	C5670	Oplossen in HBSS om een 1 mM stockoplossing te maken. Filter steriliseren.
Centrifugebuis, 50 ml	Labtek	650.550.050
Chondroitinsulfaat	LKT Laboratories	C2960	Dit is bovien chondroitinsulfaat. Oplossen in HBSS om een 0,08 g/mL stockoplossing te maken. Filter steriliseren en in porties invriezen.
Dispase II	Gibco	17105-041	Oplossen in DPBS om een 2 mg/mL stockoplossing te maken. Filter steriliseren en in porties invriezen.
Ethanol	Labtek	EA043	100% onverdunde ethanol moet worden verdund tot 70% in gedeïoniseerd water voor het steriliseren van instrumenten en oppervlakken.
Foetaal runder serum	GE Healthcare Australia Pty Ltd	SH30084.03	Dit is een HyClone merk van foetaal runder serum.
Dekglas No. 1, Ø 13 mm	Proscitech	G401-13	Plaats gesteriliseerde dekglazen in 24-well platen voor weefselkweek.
HBSS	Gibco	14025-092	Hank's evenwichtige zout oplossing, 1X, bevattend calciumchloride en magnesiumchloride.
L-ascorbinezuur 2-fosfaat	Merck	A8960	Oplossen in HBSS om een 150 mM stockoplossing te maken. Filter steriliseren.
Micro-Boyden kamer	CNC Components Pty. Ltd.	Bovenste ring: QUT-0002-0006, Basisring: QUT-0002-0007	Beide componenten zijn gemaakt van polytetrafluorethyleen (PTFE).
O-ring voor micro-Boyden kamer	Ludowici Sealing Solutions	RSB012	Samengesteld uit siliconenrubber.
Opti-MEM 1 (1X) + GlutaMAX-1	Gibco	51985-034	Een gereduceerd serum medium bevattend glutamine.
DPBS	Gibco	14190-144	Dulbecco's fosfaat gebufferde zoutoplossing, 1X, zonder calciumchloride en magnesiumchloride.
Pen Strep	Gibco	15140-122	Een 100X antibioticum oplossing bevattend 10.000 eenheden/mL penicilline en 10.000 µg/mL streptomycine.
Petrischaal	Sarstedt	82.14473.001	Steriele petrischaal, 92 X 16 mm, voor weefsel dissecties.
Weefselkweekplaat, 24 well	Corning Incorporated	Costar 3524	Een plaat bevattend 24 wells, elk met een oppervlakte van 2 cm2.
Weefselkweekplaat, 6 well	Corning Incorporated	Costar 3516	Een plaat bevattend 6 wells, elk met een oppervlakte van 9 cm2.
TrypLE Select	Gibco	12563-011	Een 1X enzym oplossing voor het dissociëren van cellen.
Versene	Gibco	15040-066	Een 1X EDTA oplossing voor het dissociëren van cellen.
Uurwerkerstangen	Labtek	BWMF4	Nummer 4 uurwerkerstangen werken goed voor het verwijderen van strips van endotheel/Descemet's membraan van hoornvliezen.