Kwantificering van ethanolniveaus in zebravisembryo's met behulp van head space gaschromatografie

Summary

Dit werk beschrijft een protocol om ethanolniveaus in een embryo van zebravissen te kwantificeren met behulp van hoofdruimtegaschromatografie van de juiste blootstellingsmethoden voor embryoverwerking en ethanolanalyse.

Abstract

Foetale Alcohol Spectrum Disorders (FASD) beschrijven een zeer variabel continuüm van ethanol-geïnduceerde ontwikkelingsstoornissen, met inbegrip van gezichtsdysmorfologieën en neurologische stoornissen. Met een complexe pathologie treft FASD jaarlijks ongeveer 1 op de 100 kinderen die in de Verenigde Staten worden geboren. Door het zeer variabele karakter van FASD zijn diermodellen kritisch gebleken in ons huidige mechanistische begrip van door ethanol veroorzaakte ontwikkelingsfouten. Steeds meer laboratoria richten zich op het gebruik van zebravissen om door ethanol veroorzaakte ontwikkelingsfouten te onderzoeken. Zebravissen produceren grote aantallen extern bevruchte, genetisch hardnekkige, doorschijnende embryo's. Dit stelt onderzoekers in staat om de timing en dosering van blootstelling aan ethanol in meerdere genetische contexten nauwkeurig te controleren en de impact van blootstelling aan embryonale ethanol te kwantificeren door middel van live imaging technieken. Dit, gecombineerd met de hoge mate van behoud van zowel genetica als ontwikkeling met de mens, heeft bewezen dat zebravis een krachtig model is om de mechanistische basis van ethanolteratogeniteit te bestuderen. Echter, ethanol blootstelling regimes hebben gevarieerd tussen verschillende zebravissen studies, die de interpretatie van zebravissen gegevens over deze studies heeft verward. Hier is een protocol om ethanolconcentraties in zebravissenembryo's te kwantificeren met behulp van hoofdruimtegaschromatografie.

Introduction

Foetale alcoholspectrumstoornissen (FASD) beschrijven een breed scala aan neurologische stoornissen en craniofaciale dysmorfologieën geassocieerd met blootstelling aan embryonale ethanol¹. Meerdere factoren, waaronder timing en dosering van blootstelling aan ethanol en genetische achtergrond, dragen bij aan de variatie van FASD^2,3. Bij mensen maakt de complexe relatie van deze variabelen het bestuderen en begrijpen van de etiologie van FASD uitdagend. Diermodellen zijn cruciaal gebleken bij het ontwikkelen van ons begrip van de mechanistische basis van ethanolteratogeniteit. Een breed s....

Protocol

Alle zebravisembryo's die in deze procedure werden gebruikt, werden gefokt en gefokt volgens de vastgestelde IACUC-protocollen²⁷. Deze protocollen werden goedgekeurd door de Universiteit van Texas in Austin en de Universiteit van Louisville.

OPMERKING: De zebravislijn Tg(fli1:EGFP)^y1 werd gebruikt in deze studie²⁸. Al het water dat in deze procedure wordt gebruikt, is steriel omgekeerd osmosewater. Alle statistische analyses werden uitgevoerd met Behulp van Graphpad Prism v8.2.1.

1. Embryomedia maken

1. Los 17,5 g NaCl, 0,75 g KCl, 2,9 g ....

Results

Bloedethanol niveaus kunnen niet worden bepaald in de vroege embryonale zebravissen, omdat ze niet over een volledig gevormde bloedsomloop. Om het ethanolgehalte in de zebravisembryo's te bepalen, worden de ethanolniveaus rechtstreeks gemeten aan de andere dag van gehomogeniseerd embryonaal weefsel. Om de embryonale ethanolconcentraties goed te meten, moet rekening worden gehouden met het embryonale volume. Het embryo (dooier bevestigd) zit in de chorion (eierschaal) omgeven door extraembryonaal vocht (

Discussion

Als ontwikkelingsmodelsysteem zijn zebravissen bij uitstek geschikt om de impact van omgevingsfactoren op de ontwikkeling te bestuderen. Ze produceren grote aantallen extern bevruchte embryo's, die het mogelijk maakt voor nauwkeurige timing en dosering paradigma's in ethanol studies. Dit, gecombineerd met de live imaging mogelijkheden en de genetische en ontwikkelingsbescherming met de mens, maken zebravissen een krachtig modelsysteem voor teratologie studies. Beschreven is een protocol voor het meten van embryonale etha.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Air			Provided by contract to the university
Analytical Balance	VWR	10204-962
AutoSampler, CP-8400	Varian		Gas Chromatograph Autosampler
Calcium Chloride	VWR	97062-590
Ethanol	Decon Labs	2701
Gas chromatograph vial with polytetrafluoroethylene/silicone septum and plastic cap 2 mL	Agilent	8010-0198	Can reuse the vials after cleaning, but not the caps/septa
Gas Chromatograph, CP-3800	Varian
Helium			Provided by contract to the university
HP Innowax capillary column	Agilent	19095N-123I	30 m x 0.53 mm x 1.0 μm film thick
Hyrdogen			Provided by contract to the university
Magnesium Sulfate (Heptahydrate)	Fisher Scientific	M63-500
Microcentrifuge tube 1.5 mL	Fisher Scientific	2682002
Micropipette tips 10 μL	Fisher Scientific	13611106
Micropipette tips 1000 μL	Fisher Scientific	13611127
Micropipette tips 200 μL	Fisher Scientific	13611112
Petri dishes 100 mm	Fisher Scientific	FB012924
Pipetman L p1000L Micropipette	Gilson	FA10006M
Pipetman L p200L Micropipette	Gilson	FA10005M
Pipetman L p2L Micropipette	Gilson	FA10001M
Polytetrafluoroethylene/silicone septum and plastic cap	Agilent	5190-7021	Replacement caps/septa for gas chromatograph vials
Potassium Chloride	Fisher Scientific	P217-500
Potassium Phosphate (Dibasic)	VWR	BDH9266-500G
Pronase	VWR	97062-916
Silica Beads .5 mm	Biospec Products	11079105z
Silica Beads 1.0 mm	Biospec Products	11079110z
Sodium Bicarbonate	VWR	BDH9280-500G
Sodium Chloride	Fisher Scientific	S271-500
Sodium Phosphate (Dibasic)	Fisher Scientific	S374-500
Solid-phase microextraction fiber assembly Carboxen/Polydimethylsiloxane	Millipore Sigma	57343-U	Replacement fibers
Star Chromatography Workstation	Varian		Chromatography software
Thermogreen Low Bleed (LB-2) Septa	Millipore Sigma	23154	Replacement inlet septa