Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Preklinische Cardiale Elektrofysiologie Beoordeling door Dual Voltage en Calcium Optical Mapping van human organotypic cardiale plakjes

10.3K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/60781

⸱

16 juni 2020

 ,  , 
1Department of Biomedical Engineering, The George Washington University

* These authors contributed equally

In dit artikel

Samenvatting

Dit protocol beschrijft de procedure voor het doorsnijden en kweken van menselijke cardiale plakjes voor preklinische geneesmiddelentesten en beschrijft het gebruik van optische mapping voor het opnemen van transmembranespanning en intracellulaire calciumsignalen gelijktijdig van deze plakjes.

Samenvatting

Menselijke cardiale slice preparaten zijn onlangs ontwikkeld als een platform voor menselijke fysiologie studies en therapie testen om de kloof tussen dier en klinische proeven te overbruggen. Tal van dier- en celmodellen zijn gebruikt om de effecten van drugs te onderzoeken, maar deze reacties verschillen vaak bij de mens. Menselijke cardiale plakjes bieden een voordeel voor het testen van geneesmiddelen in dat ze rechtstreeks zijn afgeleid van levensvatbare menselijke harten. Naast het behoud van meercellige structuren, celcelkoppeling en extracellulaire matrixomgevingen, kunnen menselijke hartweefselplakjes worden gebruikt om het effect van ontelbare geneesmiddelen op de menselijke hartfysiologie direct te testen. Wat dit model onderscheidt van andere hartpreparaten, zoals hele harten of wiggen, is dat plakjes kunnen worden onderworpen aan cultuur op langere termijn. Als zodanig, cardiale plakjes zorgen voor het bestuderen van de acute en chronische effecten van drugs. Bovendien, de mogelijkheid om enkele honderden tot duizend plakjes te verzamelen van een enkel hart maakt dit een high-throughput model om verschillende geneesmiddelen te testen in verschillende concentraties en combinaties met andere geneesmiddelen op hetzelfde moment. Plakjes kunnen worden bereid uit een bepaalde regio van het hart. In dit protocol beschrijven we de voorbereiding van linker ventriculaire plakjes door weefselblokjes van de linker ventriculaire vrije muur te isoleren en ze in plakjes te snijden met behulp van een hoge precisie vibrerende microtome. Deze plakjes kunnen vervolgens worden onderworpen aan acute experimenten om baseline cardiale elektrofysiologische functie te meten of gekweekt voor chronische medicijnstudies. Dit protocol beschrijft ook dubbele optische mapping van cardiale segmenten voor gelijktijdige opnames van transmembrane potentialen en intracellulaire calciumdynamica om de effecten van de onderzochte geneesmiddelen te bepalen.

Inleiding

Diermodellen zijn een waardevol instrument dat wordt gebruikt voor het begrijpen van de onderliggende mechanismen van de menselijke fysiologie en pathofysiologie, evenals een platform voor het inleidende testen van therapieën voor de behandeling van verschillende ziekten1. Er zijn grote stappen gezet op het gebied van biomedisch onderzoek op basis van deze dierstudies2. Er bestaan echter aanzienlijke verschillen tussen soorten tussen menselijke en dierlijke fysiologie, waaronder muizen, ratten, cavia's, konijnen, schapen, varkens en honden3,4. Als gevolg hiervan zijn er tal van geneesmiddelen, gen en celtherapieën die belofte tijdens de dierproeven fase toonde, maar niet aan de resultaten in klinische studies5. Om deze kloof te overbruggen, werden geïsoleerde cardiale myocyten en door de mens veroorzaakte pluripotente stamcellen (iPSC's) ontwikkeld als modellen om de respons van de menselijke fysiologie op verschillende geneesmiddelen en ziekten te testen6. Stamcel-afgeleide cardiomyocyten zijn op grote schaal gebruikt in organ-on-a-chip systemen als een surrogaat van het hart6,7,8. Het nut van iPSC-afgeleide cardiomyocyten (iPSC-CMs) wordt echter belemmerd door hun relatief onrijpe fenotype en het gebrek aan representatie van de cardiomyocyte subpopulatie; het volwassen myocardium is een complexe structuur die bestaat uit verschillende naast elkaar bestaande celtypen zoals fibroblasten, neuronen, macrofagen en endotheelcellen. Aan de andere kant, geïsoleerde menselijke cardiomyocyten zijn elektrisch volwassen, en verschillende cardiomyocyte subpopulaties kunnen worden verkregen door het veranderen van culturing parameters9. Toch vertonen deze myocyten over het algemeen veranderde actie potentiële morfologieën als gevolg van het gebrek aan celcelkoppeling, snelle de-differentiatie en het optreden van proarritmisch gedrag in vitro10,11. Sommige van de beperkingen werden aangepakt door 3D-cel cultuur modellen van iPSC-CMs en cardiale myocyten. Deze modellen, waaronder sferoïden, hydrogel steiger ingekapseld 3D culturen, ontworpen hartweefsels (EHTs), en hart-op-een-chip systemen, gebruik maken van meerdere cardiale cel populaties zoals cardiomyocyten, fibroblasten, en endotheelcellen. Ze ofwel zelf monteren of monteren langs een steiger om 3D-structuren te vormen, en sommige zelfs reproduceren de complexe anisotropische aard van het myocardium. Deze modellen zijn gemeld te hebben cellen van volwassen fenotypes, contractiele eigenschappen, en moleculaire profielen vergelijkbaar met hartweefsel. Het heart-on-a-chip systeem maakt het ook mogelijk om systemische effecten te bestuderen in medicijntesten en ziektemodellen. In vitro celgebaseerde modellen missen echter de native extracellulaire matrix en kunnen daarom de elektrofysiologie op orgaanniveau niet nauwkeurig nabootsen. Menselijke cardiale plakjes, daarentegen, hebben een intacte extracellulaire matrix en inheemse cel-naar-cel contacten, waardoor ze nuttig voor een nauwkeuriger onderzoek van aritmogene eigenschappen van het menselijke myocardium.

Onderzoekers hebben menselijke cardiale organotypische plakjes ontwikkeld als fysiologisch preklinisch platform voor acute en chronische geneesmiddelentesten en om cardiale elektrofysiologie en hartziekteprogressie12,13,,14,15,16,17,18,19te bestuderen . In vergelijking met iPSC-afgeleide cardiomyocyten, menselijke cardiale plakjes meer trouw repliceren volwassen menselijke cardiale elektrofysiologie met een volwassen cardiomyocyte fenotype. In vergelijking met geïsoleerde menselijke cardiomyocyten vertonen hartsplakjes fysiologische werkingsmogelijkheden vanwege de goed bewaarde celcelkoppeling en het intrinsieke bestaan van hun inheemse intra- en extracellulaire omgevingen.

Dit protocol beschrijft het proces van het genereren van menselijke hartschijfjes uit hele donorharten, het uitvoeren van acute (d.w.z. uren-lange) en chronische (dat wil zeggen, dagen-lange) studies om cardiale elektrofysiologie parameters te testen via optische mapping. Hoewel dit protocol alleen het gebruik van het linker ventriculaire (LV) weefsel beschrijft, is het met succes toegepast op andere delen van het hart, evenals andere soorten zoals muizen, ratten, cavia's en varkens14,20,21,22. Ons laboratorium maakt gebruik van hele menselijke donorharten die de afgelopen 5 jaar zijn afgewezen voor transplantatie, maar het is haalbaar dat deze zelfde procedures worden uitgevoerd op weefsels van donorhartmonsters die met alternatieve middelen zijn verkregen (bijvoorbeeld linker-ventriculaire hulpverlening [LVAD]-implantaties, biopsieën, myectomieën) zolang de weefsels de mogelijkheid hebben om in kubussen te worden gesneusd. Optische mapping wordt gebruikt voor analyse in deze studie vanwege de capaciteit om tegelijkertijd optische actiemogelijkheden en calciumtransiënten in kaart te brengen met een hoge ruimtelijke (100 x 100 pixels) en tijdelijke (>1.000 frames/s) resolutie. Alternatieve methoden kunnen ook worden gebruikt, zoals multi-elektrodenarrays (MEA's) of micro-elektroden, maar deze technieken worden beperkt door hun relatief lage ruimtelijke resoluties. Daarnaast zijn MEA's ontworpen voor gebruik met celculturen, en scherpe micro-elektroden worden gemakkelijker beheerd voor gebruik met hele harten of grote weefselwiggen.

Het doel van het artikel is om meer onderzoekers in staat te stellen menselijke cardiale weefsels te gebruiken voor cardiale elektrofysiologie studies. Opgemerkt moet worden dat de technologie beschreven in dit artikel is relatief eenvoudig en gunstig voor korte termijn studies (in de orde van enkele uren tot dagen). Meer fysiologische biomimetische cultuur voor studies op langere termijn (in de orde van weken) is besproken en beschreven door een aantal andere studies12,18,23. Elektrische stimulatie, mechanische belasting en weefselrekken zijn voordelige conditioneringsmechanismen die het begin van in vitro weefsel remodelleren12,18,23kunnen helpen beperken.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

Alle beschreven methoden zijn uitgevoerd in overeenstemming met alle institutionele, nationale en internationale richtlijnen voor menselijk welzijn. Het onderzoek werd goedgekeurd door de Institution Review Board (IRB) van de George Washington University.

OPMERKING: Donor menselijke harten werden verworven van Washington Regional Transplant Community als gedeidentificeerd weggegooid weefsel met goedkeuring van de George Washington University IRB. Explanted harten worden cardioplegisch gearresteerd door het hart met een oplossing van ijskoude cardioplegia te spoelen (het bloed werd gewist van het hart in dit proces) en overgebracht naar het laboratorium onder standaard orgaantransplantatie voorwaarden.

1. Voorbereiding van oplossingen

  1. Maak voor elk hart 4 L cardioplegische oplossing (110 mM NaCl, 16 mM KCl, 16 mM MgCl2, 10 mM NaHCO3, 1,2 mM CaCl2; pH = 7,4). Sla 3 L op bij 4 °C en de overige 1 L bij -20 °C.
    LET OP: Deze oplossing kan tot enkele dagen van tevoren worden gemaakt.
  2. Bereid 1 L voor elk van Tyrode's snijoplossing (140 mM NaCl, 6 mM KCl, 1 mM MgCl2, 1,8 mM CaCl2, 10 mM glucose, 10 mM HEPES, 10 mM 2,3-butanedion monoxime [BDM]; pH = 7,4) en de hersteloplossing van Tyrode (140 mM NaCl, 4,5 mM KCl, 1 mM MgCl2, 1,8 mM CaCl2, 10 mM glucose, 10 mM HEPES, 10 mM BDM; pH = 7,4).
    LET OP: Zowel de snij- als hersteloplossingen moeten op de dag van het experiment worden aangebracht en kunnen bij 4 °C worden opgeslagen.
  3. Bereid voorraadoplossingen van de fluorescerende kleurstoffen voor. Reconstrueer de spanningsgevoelige kleurstof RH237 bij 1,25 mg/mL in dimethylsulfoxide (DMSO) en bewaar deze in 30 μL aliquots bij 4 °C. Reconstitueer de calciumindicator Rhod-2AM bij 1 mg/mL in DMSO. Bewaar in 30 μL aliquots bij -20 °C.
    OPMERKING: Di-4-ANEPPS (stockoplossing op 1,25 mg/mL in DMSO) kan alleen al worden gebruikt in experimenten voor een camerabeeldvorming van het transmembranepotentieel.
    1. Voor het begin van het experiment, sonicate de kleurstoffen met behulp van een echografie sonicator voor ten minste 10 min en verdun elke aliquot van fluorescerende kleurstoffen in 1 mL van de hersteloplossing. Voeg Pluronic F-127 (Tabel van materialen) aan Rhod-2AM bij een 1:1 verhouding vóór verdunning in terugwinningsoplossing toe.
  4. Bereid een voorraadoplossing voor van de excitatie-contractie uncoupler blebbistatine bij 2 mg/mL-oplossing in DMSO. Bewaar in aliquots bij -20 °C. Verdun tijdens optische mapping-experimenten de voorraadoplossing van blebbistatine tot een werkconcentratie van 5−10 μM in de hersteloplossing van de Tyrode.
  5. Maak vers kweekmedium door medium 199 aan te vullen met 2% penicilline-streptomycine, 1x insuline-transferrin-selenium (ITS) vloeibare media supplement, en 10 mM BDM. Filter het medium met een 0,2 μm steriel filter.
    OPMERKING: Voor farmacologische verstoringsstudies kunnen geneesmiddelen direct aan het kweekmedium worden toegevoegd. Het kweekmedium kan bij 37 °C worden opgeslagen.
  6. Maak een 4% agarose gel voor weefsel montage door het oplossen van laag-smeltpunt agarose in gedestilleerd water en het verwarmen van het mengsel in een magnetron tot volledig opgelost. Genees de agarose in een petrischaal met een dikte van 5 mm en bewaar bij 4 °C.

2. Inrichting van de apparatuur

  1. Trillende microtome-setup
    1. Kalibreer de trillende microtome voorafgaand aan elk experiment.
      1. Met behulp van een hoge precisie vibrerende microtome(Tabel van materialen), laad een keramisch snijblad in de houder en bevestig de kalibrerende inrichting voorzien van de vibrerende microtome. Kies de optie voor het aanpassen van het blad in het menu en selecteer keramiek voor het type blad.
      2. Selecteer de vibrate-optie en controleer de waarde van de Z-as. Als deze waarde <1 μm is, verlaat u het kalibratiemenu. Zo niet, pas dan de kalibratieschroef die aan de bovenkant van de trilkop is bevestigd fijn aan en selecteer de triloptie. Herhaal dit keer zo vaak als nodig is om de Z-as in te stellen op <1 μm.
    2. Stel de vibratome-instellingen in op 400 μm snijdikte, 0,02 mm/s snelheid voor atriumweefsel en 0,04 mm/s op snelheid voor ventriculair weefsel, 2 mm horizontale trillingsamplitude en 80 Hz trillingsfrequentie.
      OPMERKING: Terwijl 400 μm de aanbevolen dikte is om celschade op de snijvlakken van de plak te compenseren, kunnen ook dunnere plakjes worden bereid. Aangezien de zuurstofverspreidingsgrens ongeveer 150 μm bedraagt, worden plakjes rond 300 μm vaak gebruiktop 14,17,18,24.
    3. Vul het bad van de vibrerende microtome met snijoplossing bij 4 °C en houd de temperatuur vast door de buitenkant van het bad te omringen met ijs, en vul zo nodig het snijprotocol aan. Continu zuurstof de snijden oplossing in het bad door borrelen met 100% zuurstof tijdens het snijden.
    4. Zet een tweede schotel met zo veel 100 μm nylon mesh cell strainers en meshed ringen als dat nodig is (een cel zeef per plak). Vul deze schotel met hersteloplossing en zuurstof het door borrelen met 100% zuurstof bij kamertemperatuur (RT).
      OPMERKING: Deze oplossing wordt tijdens het experiment bij RT onderhouden.
  2. Optische toewijzingsinstelling
    OPMERKING: Een meer gedetailleerde beschrijving van het optische kaartsysteem is opgenomen in eerdere publicaties16,25,26.
    1. Bevestig een weefselbad met polydimethylsiloxane (PDMS) gellaag aan de onderkant (om de plakjes vast te pinnen) aan een perfusiesysteem. Circuleert 1 L van de terugwinningsoplossing bij 37 °C en zuurstof met 100% zuurstof, door het perfusiesysteem met een stroomsnelheid die snel genoeg is om de temperatuur en heldere accumulatie van badperfusaat te handhaven.
    2. Pas de focus en uitlijning van de twee CMOS-camera's(Tabel van materialen) met behulp van een doel.
      LET OP: Meer details over uitlijning is te vinden in eerdere studies26.
    3. Gebruik een groene LED-lichtbron met een golflengte van 520 ± 5 nm om de spanningsgevoelige en calciumindicatorkleurstoffen tegelijkertijd op te wekken.
      OPMERKING: De excitatielichtbron is bevestigd aan de excitatiefilterkubus van het optische kaartsysteem en wordt gereflecteerd door een 550 nm dichroic spiegel voor epicentrische verlichting. Het uitgezonden licht wordt opgevangen door een 1x lens en door een tweede dichroic spiegel bij 630 nm in spanning en calcium componenten voordat het wordt gefilterd door 690 ± 50 nm en 590 ± 33 nm filters, respectievelijk, en opgenomen door de twee camera's.

3. Snijden protocol

  1. Wanneer klaar voor weefseldissectie en experimenten, bereiden een bad van ijskoude cardioplegia door het mengen van bevroren en vloeibare cardioplegia. Houd het hart ondergedompeld in het cardioplegiabad tot weefselverzameling voor het snijden(figuur 1A).
  2. Lijm de premade agarose gel aan de achterkant van de metalen weefselhouders van het vibratome.
  3. Identificeer de linker ventriculaire vrije wand en snijd 1 cm3 blokjes weefsel in koude cardioplegic oplossing. Monteer vervolgens snel de weefselblokken op de metalen weefselhouders met de endocardiale oppervlakken naar boven en bevestig ze aan de agarosegel met behulp van actuele huidkleef(figuur 1B).
    OPMERKING: Het geselecteerde weefselgebied moet weg zijn van grote bloedvaten om gaten in de plakjes te voorkomen. Het vlak van de sectie is ongeveer parallel aan de vezel oriëntatie in de endocardial laag (Figuur 1E) en het vlak van de sectie zou kunnen worden op een lichte hoek als gevolg van rotatie anisotropie in een diepere laag van de LV-muur. Om de doorvoer te verhogen, kunnen maximaal twee weefselblokken naast elkaar op dezelfde houder worden gemonteerd.
  4. Breng de metalen houders in het vibratome bad gevuld met de ijskoude zuurstofrijke snijoplossing. Zorg ervoor dat de weefselblokjes volledig onder water staan.
  5. Verplaats het mes naar de voorkant van het weefsel en zet het vibratome aan om te beginnen met snijden met de vooraf ingestelde parameters. Gooi de eerste plakjes weg totdat het mes verder reikt dan de trabeculae in het gladde endocardiale weefsel.
  6. Zodra elk plakje is gesneden, breng je het plakje voorzichtig over op een zuurstofrijk (100% O2)bad van Tyrode's hersteloplossing bij RT. Plaats voorzichtig elk plakje in afzonderlijke 100 μm nylon mesh-cel strainers en bedek met mazen om de weefselschijfjes van curling te houden(figuur 1C). Bewaar plakjes in de hersteloplossing gedurende ten minste 20 minuten.
    OPMERKING: Plakjes kunnen onder deze omstandigheden tot 3−4 uur in het bad worden bewaard zonder schadelijke elektrofysiologische effecten.

4. Slice kweek onder statische omstandigheden

OPMERKING: Om de kans op besmetting te minimaliseren, steriliseert u de tangen met behulp van een kraalsterilierator voor elke overdrachtsstap.

  1. Wanneer klaar om te cultuur, zorgvuldig overbrengen van elk segment naar de individuele putten van een 6 goed plaat gevuld met steriele fosfaat-gebufferde zoutoplossing (PBS). Wieg voorzichtig de putplaat om de plakjes hersteloplossing te spoelen.
    OPMERKING: Vanaf dit punt moeten de plakjes alleen worden blootgesteld in een BSL2 laminaire stroomcultuurkap en moeten steriele tangen worden gebruikt om het weefsel te behandelen.
  2. Breng de plakjes over in putten van verse PBS om de plakjes grondig te spoelen en te steriliseren voor cultuur. Voer deze wasstap 3x uit om volledige verwijdering van de hersteloplossing uit de plakjes te garanderen.
  3. Breng de plakjes over op afzonderlijke putten van een 6 putplaat gevuld met 3 mL voorverwarmd (37 °C) cultuurmedium (met of zonder drugs, figuur 1D). Plaats platen op een orbitale shaker bij 20 rpm in een bevochtigde couveuse bij 37 °C met 30% O2 en 5% CO2. Aspirate en vervang cultuur medium om de 48 uur.

5. Functionele karakterisering-optische mapping

  1. Voor optische mapping studies, hetzij onmiddellijk na het snijden of na het kweken, zorgvuldig overbrengen van het segment van belang aan het weefsel bad van het perfusiesysteem op 37 °C met 100% O2 in herstel Tyrode's oplossing, en pin vaststelling van de vier hoeken naar de PDMS gel laag terwijl het toepassen van minimale rek (dat wil zeggen, net genoeg om het segment te houden van gemakkelijk bewegen onder stroomomstandigheden). Laat de plakjes in dit bad rusten met circulerende hersteloplossing voor ongeveer 10 minuten.
  2. Voeg 0,3−0,5 mL van de verdunde blebbistatine toe aan het reservoir met de terugwinningsoplossing. Laat de slice ongeveer 10 minuten met blebbistatine inbroeden.
  3. Reconstitute 30 μL van de stock voltage-gevoelige kleurstof, RH237, in 1 mL van hersteloplossing bij 37 °C. Zet de pompen uit en laad langzaam 0,2−0,3 mL werkende kleurstofoplossing op het oppervlak van de schijf over een periode van 30 s. Laat het plakje in de kleurstof met de pompen uitbroeden voor een periode tot 90 s, zet dan de pompen weer aan om overtollige kleurstof uit te laten wassen.
    LET OP: Zorg moet worden genomen om de kleurstof gelijkmatig toe te passen over de hele plak. Bovendien, zeer langzame kleurstof toepassing is van cruciaal belang om te voorkomen dat de kleurstof drijven uit de buurt van het segment.
  4. Herhaal stap 5.3 om de voorraad calcium indicator Rhod-2AM reconstrueren en laad het op slice.
  5. Richt de camera's op het segment door de afstand van het segment van de lens aan te passen.
  6. Plaats een bipolaire platina-iridium pacing elektrode zodanig dat de tip in contact is met het midden van de slice en toepassen pacing stimuli van toenemende amplitude om de minimale pacing drempel die nodig is om een elektrische reactie uit te lokken te bepalen. Tempo het segment op 1 Hz met een pulsbreedte van 2 ms op 1,5x de amplitude van de vooraf bepaalde pacing drempel. Plaats een coverlip over het weefsel segment.
  7. Verlicht het segment met een 520 ± 5 nm LED excitatie lichtbron. Nota van de uitgezonden spannings- en calciumsignalen met de twee CMOS-camera's op 1.000 frames/s.
  8. Controleer de opname op een goede signaalkwaliteit en onderdrukte bewegingsartefacten(figuur 1F). Voeg meer blebbistatine toe aan het reservoir in stappen van 0,1 mL totdat de beweging geen artefacten meer produceert in de optische signalen. Voeg meer kleurstof, indien nodig, om de signaalkwaliteit te verbeteren.
    OPMERKING: Goede signaalkwaliteit verwijst naar kwalitatief beoordeelde grote signaalamplitude en lage achtergrondgeluid in de opgenomen optische signalen.

6. Gegevensverwerking met RHYTHM1.2

OPMERKING: RHYTHM1.2 is een op MATLAB gebaseerde gebruikersinterface die wordt gebruikt voor het weergeven, conditie en analyseren van optische toewijzingsgegevens die zijn verkregen door optische kaartsystemen met één of twee camera's(figuur 3). Het wordt gebruikt in combinatie met het beeldvormingssysteem.

  1. Gegevensbestanden laden
    1. Laad de gegevensbestanden in RHYTHM1.2 door een van de vier etalages op het scherm te selecteren en de knoppen Map en Laden selecteren te gebruiken.
    2. Het programma zal de gebruiker vragen om Camera 1 of Camera 2 gegevens voor de dubbele spanning en calciumopnamen te selecteren. Selecteer Camera 1 voor het spanningssignaal.
    3. Herhaal het proces om het calciumsignaal (Camera 2) te laden op een van de aangrenzende etalages.
    4. Selecteer het selectievakje Koppeling van dubbele gegevens tussen de twee geselecteerde weergavevensters om de twee weergavevensters te koppelen, omdat de twee gegevenssets vanuit hetzelfde gebied op het segment worden opgenomen.
      OPMERKING: Als alternatief, als hetzelfde gezichtsveld wordt gehandhaafd, kan deze functie worden gebruikt om twee beelden te koppelen die op afzonderlijke tijdstippen zijn verkregen om de tijdrespons in de elektrofysiologie van het onderzochte geneesmiddel te zien. Dubbelklikken op een beeldscherm maakt het mogelijk om dat ene venster te maximaliseren om het gemak van analyse mogelijk te maken.
  2. Signaalconditionering
    1. Gegevensanalyse selecteren | Conditie Parameters om de toestand van de spanning en calcium optische mapping gegevens voorafgaand aan verdere analyse.
    2. Gebruik de functie'Achtergrond verwijderen'om pixels te verwijderen die geen signaal bevatten op basis van een fluorescerende intensiteitsdrempel (achtergrond [BG]-drempel) en de mate van pixelclustering (excitatie [EX]-drempel).
    3. Voer ruimtelijke gemiddeldingen uit van de optische kaartgegevens met behulp van de "Bin"-functie om de signaalkwaliteit te verbeteren.
    4. Filter de optische toewijzingsgegevens met behulp van een bandpassfilter met de functieFilter.
    5. Gebruik de functie"Drift" om de basislijndrift in het optische kaartsignaal te verwijderen.
    6. Normaliseer met de functie" Normaliseren"de optische toewijzingsgegevens van elke pixel om een maximale amplitude van 1 te hebben.
    7. Gebruik de functie "Inverse Signal" om de calciumsporen om te keren voor verdere analyse.
    8. Klik op Wave weergeven om het geconditioneerde spoor van een bepaalde plek in het weergavevenster te selecteren en in het venster Golfvorm te plotten. Pas de parameters voor signaalconditionering aan om optimaal actiepotentieel en calciumtransient sporen te verkrijgen.
  3. Geleidingssnelheid (CV) berekening
    OPMERKING: De activeringstijd wordt gedefinieerd als de tijd van maximale afgeleide van het optische signaal (dF/dtmax).
    1. Gegevensanalyse selecteren | Activeringskaart en voer een begintijd en eindtijd in om één actiepotentieel in het spoor te omvatten. Druk op Berekenen en selecteer het interessegebied (ROI) om de activeringskaart van het geselecteerde gebied weer te geven ( figuur1G).
    2. Gegevensanalyse selecteren | CV Kaart en op dezelfde manier, kies de begintijd en eindtijd. Voer de interpixelresolutiewaarden in op basis van de instelling.
      OPMERKING: Voor 1x vergrotingssystemen bedraagt de interpixelresolutie 0,1 mm in de X- en Y-richting.
    3. Druk op de Generate Vec. Kaartknop om een ROI te selecteren en CV-vectoren binnen dat gebied weer te geven. Het gemiddelde, mediaan, standaarddeviatie en het aantal vectoren dat in de analyse is opgenomen, evenals de gemiddelde voortplantingshoek van de CV-vectoren in het geselecteerde gebied, worden berekend en weergegeven in de sectie Statistieken.
    4. Klik op de knop Lijn tekenen om een lijn langs een bepaalde voortplantingsrichting te tekenen. Alle CV-vectoren in die richting worden geselecteerd. Klik op CV berekenen om alleen de geselecteerde CV-vectoren te gebruiken om de statistieken te berekenen die worden weergegeven in de sectie Statistieken.
  4. Actie potentiële duur (APD) en calcium voorbijgaande duur (CaTD) berekening
    OPMERKING: De APD is een andere fundamentele parameter van de hartelektrofysiologie. APD-kaarten kunnen worden gegenereerd door het tijdsverschil tussen activering en een opgegeven percentage van repolarisatie van elk optisch actiepotentieel te bepalen. APD heterogeniteit of APD verlenging en verkorting kan worden gebruikt om aritmie gevoeligheid te voorspellen.
    1. Selecteer gegevensanalyse | APD/Cat-kaart.
    2. Selecteer de begin- en eindtijd om één volledig actiepotentieel te omvatten. Stel een minimum- en maximumwaarde van APD/CaTD in om eventuele uitschieters te verwijderen (bijvoorbeeld respectievelijk 0 en 1.000 ms). Voer de procentuele repolarisatie in die de APD bepaalt, bijvoorbeeld 0,8 voor APD80/CaTD80 of 0,5 voor APD50/CaTD50.
    3. Klik op Regional APD Calc om een ROI te selecteren en de APD-kaart te genereren. Het gemiddelde, de mediaan, de standaarddeviatie en het aantal pixels dat in de analyse is opgenomen, worden weergegeven in de sectie Statistieken.
  5. Stijgingstijd
    OPMERKING: De stijgingstijd is een andere elektrofysiologische parameter die kan worden gemeten aan de uiting van optische signalen van spanning en calciumtransient sporen. Het biedt een schatting voor hoe lang het duurt voor de depolariserende ionkanalen om een actiepotentieel te activeren, of hoe lang het duurt voordat calcium wordt vrijgegeven in het cytoplasma van het sarcoplasmatische reticulum. Optische stijgingstijd is geen perfecte vervanging voor stijgingstijden gemeten door micro-elektroden en is mogelijk niet zo gevoelig voor veranderingen in depolarisatie, omdat optische actiemogelijkheden een gemiddelde zijn van het transmembranepotentieel van veel cellen. Ruimtelijke en tijdelijke resolutie van het systeem kan ook invloed hebben op optische stijgingstijdwaarden. Het kan echter nog steeds worden gebruikt om grote veranderingen in depolarisatie te voorspellen27.
    1. Selecteer gegevensanalyse om de stijgingstijd te bepalen | Rise Time.
    2. Selecteer Begintijd en eindtijd om de upstroke van één enkele actiepotentieel of calciumtransient te selecteren. Voer de waarden van Start% en Einde% in (meestal wordt 10-90% aanbevolen voor niet-luidruchtige signalen), waarmee de gebruiker alleen de delen van het signaal kan selecteren zonder ruis op te nemen in het geval van luidruchtige signalen.
    3. Klik op Berekenen om de ROI te selecteren en het gemiddelde, de mediaan, de standaarddeviatie en het aantal pixels dat is opgenomen in de analyse van de stijgingstijd te bepalen.
  6. Calciumverval
    OPMERKING: Voor calciumsporen kan de tijdconstante van het verval van het calciumtransient worden bepaald. Dit maakt het mogelijk voor de analyse van veranderingen in de verwijdering van calciumionen uit het cytoplasma terug in de SR.
    1. Gegevensanalyse selecteren | Calcium Verval en voer de begin- en eindtijd in om het gehele vervalgedeelte van een enkel calciumtransient signaal te omvatten.
    2. Klik op Tau berekenen om de ROI te selecteren en het gemiddelde, de mediaan, de standaarddeviatie en het aantal pixels in de analyse van calciumbederftijdconstante te bepalen.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Menselijke organotypische plakjes werden verzameld uit de linker ventrikel van een donor menselijk hart volgens het hierboven beschreven protocol en geïllustreerd inFiguur 1. Een dubbele camera optische mapping systeem als dat inFiguur 2werd gebruikt in de rechtopstaande beeldvorming configuratie om gelijktijdige optische mapping van spanning en calcium uit te voeren ongeveer 1 uur na de voltooiing van het snijprotocol. Gegevens werden geanalyseerd met behulp va...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Hier presenteren we stapsgewijze methoden om levensvatbare cardiale plakjes te verkrijgen van cardioplegisch gearresteerde menselijke harten en om functioneel te karakteriseren de plakjes met behulp van dubbele optische mapping van transmembrane potentieel en intracellulaire calcium. Met een bewaard gebleven extracellulaire omgeving en inheemse celcelkoppeling kunnen menselijke hartsplakjes worden gebruikt als een nauwkeurig model van het menselijk hart voor fundamentele wetenschappelijke ontdekking en voor het testen va...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

Financiering door NIH (subsidies R21 EB023106, R44 HL139248 en R01 HL126802), door Stichting Leducq (project RHYTHM) en een American Heart Association Postdoctoral Fellowship (19POST34370122) worden dankbaar erkend.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
1mL BD SpuitThomas Scientific309597
2,3-butaanedion monoximeSigma-AldrichB0753
6-well kweekplatenCorning3516
BioveiligheidskastThermoFisher Scientific1377
BlebbistatinCayman13186
Bubble TrapRadnoti130149
CalciumchlorideSigma-AldrichC1016
Corning Cell StrainersFisher Scientific07-201-432
Di-4-ANEPPSBiotiumvoorraadoplossing van 1,25 mg/mL in DMSO
DMSOSigma-AldrichD2650
Dumont #3c PincetFine Science Tools11231-20
Emissiedichroische spiegelChromaT630LPXR-UF1
Emissiefilter (RH237)ChromaET690/50m
Emissiefilter (Rhod2AM)ChromaET590/33m
Excitatiedichroische spiegelChromaT550LPXR-UF1
ExcitiefilterChromaET500/40x
Falcon 50mL Conische CentrifugeerbuisjesFisher Scientific14-959-49A
GlucoseSigma-AldrichG8270
WarmtewisselaarRadnoti158821
HEPESSigma-AldrichH3375
IncubatorThermoFisher Scientific50145502
Insuline Transferrine Selenium (ITS)Sigma-AldrichI3146
LED-excitatieverlichtingsbronPrizmatixUHP-Mic-LED-520
Magnesiumchloride hexahydraatSigma-AldrichM9272
Medium 199ThermoFisher Scientific11150059
Micam Ultima L type CMOS-cameraScimediaN/A
Minutien-speldenFine Science Tools26002-10
Penicilline-streptomycineSigma-AldrichP4333
PeristaltiekpompCole ParmerEW-07522-20
Platinum pacingdraadAlfa Aesar43275
Pluronic F127ThermoFisher ScientificP6867niet-ionische, oppervlakteactieve stof polyol
KaliumchlorideSigma-AldrichP3911
Powerlab data-acquisitie en stimulatorAD InstrumentsPowerlab 4/26
RH237Biotium61018
Rhod2AMThermoFisher ScientificR1245MP
Rhod-2AMInvitrogen, Carlsbad, CA
NatriumbicarbonaatSigma-AldrichS6014
NatriumchlorideSigma-AldrichS9625
Sterilizer, droogkorrelSigma-AldrichZ378550
Stone Oxygen DiffuserWaterwoodB00O0NUVM0
TissueSeal - Histoacryl Topische HuidlijmgobiomedAESCULAP
UltraPure Laagsmeltende AgaroseThermo Fisher Scientific16520100
Ultrasone sonicatorBranson 1800
VibratomeCampden Instruments7000 smz

Referenties

  1. Ericsson, A. C., Crim, M. J., Franklin, C. L. A brief history of animal modeling. Missouri Medicine. 110 (3), 201-205 (2013).
  2. Choudhary, A., Ibdah, J. A. Animal models in today's translational medicine world. Missouri Medicine. 110 (3), 220-222 (2013).
  3. Perlman, R. L. Mouse models of human disease: An evolutionary perspective. Evolution, Medicine, and Public Health. 2016 (1), 170-176 (2016).
  4. Milani-Nejad, N., Janssen, P. M. L. Small and large animal models in cardiac contraction research: advantages and disadvantages. Pharmacology & Therapeutics. 141 (3), 235-249 (2014).
  5. Green, A. R. Why do neuroprotective drugs that are so promising in animals fail in the clinic? An industry perspective. Clinical and Experimental Pharmacology and Physiology. 29 (11), 1030-1034 (2002).
  6. Shinnawi, R., Gepstein, L. iPCS cell modeling of inherited cardiac arrhythmias. Current Treatment Options in Cardiovascular Medicine. 16 (9), 331(2014).
  7. Morimoto, Y., Mori, S., Sakai, F., Takeuchi, S. Human induced pluripotent stem cell-derived fiber-shaped cardiac tissue on a chip. Lab on a Chip. 16 (12), 2295-2301 (2016).
  8. Wang, G., et al. Modeling the mitochondrial cardiomyopathy of Barth syndrome with induced pluripotent stem cell and heart-on-chip technologies. Nature Medicine. 20 (6), 616-623 (2014).
  9. Ben-Ari, M., et al. Developmental changes in electrophysiological characteristics of human-induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. Heart Rhythm. 13 (12), 2379-2387 (2016).
  10. Goversen, B., van der Heyden, M. A. G., van Veen, T. A. B., de Boer, T. P. The immature electrophysiological phenotype of iPSC-CMs still hampers in vitro drug screening: Special focus on IK1. Pharmacology & Therapeutics. 183, 127-136 (2018).
  11. Zhang, Y., et al. Dedifferentiation and proliferation of mammalian cardiomyocytes. PloS One. 5 (9), 12559(2010).
  12. Watson, S. A., et al. Biomimetic electromechanical stimulation to maintain adult myocardial slices in vitro. Nature Communications. 10, 2168(2019).
  13. Fischer, C., et al. Long-term functional and structural preservation of precision-cut human myocardium under continuous electromechanical stimulation in vitro. Nature Communications. 10, 117(2019).
  14. Ou, Q., et al. Physiological Biomimetic Culture System for Pig and Human Heart Slices. Circulation Research. 125 (6), 628-642 (2019).
  15. Qiao, Y., et al. Multiparametric slice culture platform for the investigation of human cardiac tissue physiology. Progress in Biophysics and Molecular Biology 2. 144, 139-150 (2019).
  16. Kang, C., et al. Human Organotypic Cultured Cardiac Slices: New Platform For High Throughput Preclinical Human Trials. Scientific Reports. 6, 28798(2016).
  17. Camelliti, P., et al. Adult human heart slices are a multicellular system suitable for electrophysiological and pharmacological studies. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 51 (3), 390-398 (2011).
  18. Brandenburger, M., et al. Organotypic slice culture from human adult ventricular myocardium. Cardiovascular Research. 93 (1), 50-59 (2012).
  19. Watson, S. A., et al. Preparation of viable adult ventricular myocardial slices from large and small mammals. Nature Protocols. 12 (12), 2623-2639 (2017).
  20. Halbach, M., et al. Ventricular slices of adult mouse hearts - A new multicellular in vitro model for electrophysiological studies. Cellular Physiology and Biochemistry. 18 (1-3), 1-8 (2006).
  21. Wang, K., et al. Cardiac tissue slices: preparation, handling, and successful optical mapping. American Journal of Physiology. Heart and Circulatory Physiology. 308 (9), 1112-1125 (2015).
  22. Bussek, A., et al. Cardiac tissue slices with prolonged survival for in vitro drug safety screening. Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 66 (2), 145-151 (2012).
  23. Watson, S. A., Terracciano, C. M., Perbellini, F. Myocardial Slices: an Intermediate Complexity Platform for Translational Cardiovascular Research. Cardiovascular Drugs and Therapy. 33 (2), 239-244 (2019).
  24. Rouwkema, J., Koopman, B. F. J. M., Blitterswijk, C. A. V., Dhert, W. J. A., Malda, J. Supply of nutrients to cells in engineered tissues. Biotechnology and Genetic Engineering Reviews. 26 (1), 163-178 (2009).
  25. Lang, D., Sulkin, M., Lou, Q., Efimov, I. R. Optical mapping of action potentials and calcium transients in the mouse heart. Journal of Visualized Experiments. (55), e3275(2011).
  26. Brianna, C., et al. Open-Source Multiparametric Optocardiography. Scientific Reports. 9, 721(2019).
  27. George, S. A., et al. Modulating cardiac conduction during metabolic ischemia with perfusate sodium and calcium in guinea pig hearts. American Journal of Physiology - Heart and Circulatory Physiology. 316 (4), 849-861 (2019).
  28. Kawara, T., et al. Activation delay after premature stimulation in chronically diseased human myocardium relates to the architecture of interstitial fibrosis. Circulation. 104 (25), 3069-3075 (2001).
  29. Qu, Y., et al. Action potential recording and pro-arrhythmia risk analysis in human ventricular trabeculae. Frontiers in Physiology. 5 (8), 1109(2018).
  30. Franz, M. R., Swerdlow, C. D., Liem, L. B., Schaefer, J. Cycle length dependence of human action potential duration in vivo. Effects of single extrastimuli, sudden sustained rate acceleration and deceleration, and different steady-state frequencies. Journal of Clinical Investigation. 82 (3), 972-979 (1988).
  31. Lou, Q., et al. Transmural heterogeneity and remodeling of ventricular excitation- contraction coupling in human heart failure. Circulation. 123 (17), 1881-1890 (2011).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Meer artikelen verkennen

Menselijke hartsnedenvoltage-calcium-imagingpreparatie van weefselsnedenelektrofysiologische beoordelingmodel voor geneesmiddelentestenanalyse van de geleidingssnelheidactiepotentiaalduurcalciumtransiënt-imagingweefsel uit de linker ventrikel
Preklinische Cardiale Elektrofysiologie Beoordeling door Dual Voltage en Calcium Optical Mapping van human organotypic cardiale plakjes
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan de bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleidsoverzicht

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.