Methodenartikel

Aantonen van een lineaire relatie tussen vasculaire endotheliale groei factor en luteïniserend hormoon in nier schors extracten

DOI:

10.3791/60785

⸱

22 januari 2020

 ,  , 
1Zietchick Research Institute

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hier gepresenteerd is een protocol voor het gebruik van een corticale nier extract voorbereiding en totale eiwit normalisatie om de correlatie tussen vasculaire endotheliale groeifactor en luteïniserend hormoon in de nier van zoogdieren demonstreren.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Vasculaire endotheliale groeifactor (VEGF) helpt bij het beheersen van de angiogenese en vasculaire permeabiliteit in de nier. Nieraandoeningen, zoals diabetische nefropathie, worden geassocieerd met VEGF-disregulatie in de nier. De factoren die VEGF beheersen onder fysiologische omstandigheden in de nier zijn niet goed begrepen. Luteïniserend hormoon (LH), een Pro-angiogenic hormoon, helpt bij het reguleren van de fysiologische VEGF expressie in voortplantingsorganen. Gezien het feit dat LH receptoren zijn gevonden in de nier, wij, bij Zietchick Research Institute, veronderstelde hier dat LH ook helpt reguleren VEGF expressie in de nier zo goed. Om bewijs te leveren, hebben we erop gericht om te laten zien dat LH-niveaus VEGF-niveaus in de nier van zoogdieren kunnen voorspellen. De meeste VEGF-gerelateerde onderzoeken met betrekking tot de nier hebben lagere zoogdieren gebruikt als modellen (d.w.z. knaagdieren en konijnen). Om dit werk te vertalen naar het menselijk lichaam, werd besloten om de relatie tussen VEGF en LH in de hogere orde zoogdieren (d.w.z. runderen en varkens modellen) te onderzoeken. Dit protocol maakt gebruik van het totale eiwit lysaat uit de nierschors. De sleutels van het succes van deze methode omvatten de aanschaf van nieren van slachterij dieren onmiddellijk na de dood evenals normalisatie van de analyt niveaus (in het nierextract) door totaal eiwit. Deze studie toont met succes een significante lineaire relatie aan tussen LH en VEGF bij zowel runderen als varkens nieren. De resultaten zijn reproduceerbaar in twee verschillende soorten. De studie biedt ondersteunend bewijs dat het gebruik van nierextracten van koeien en varkens een uitstekende, economische en overvloedige bron is voor de studie van nierfysiologie, met name voor het onderzoeken van de correlatie tussen VEGF en andere analyten.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Vasculaire endotheliale groeifactor A (VEGF-a), helpt bij het reguleren van angiogenese en vasculaire permeabiliteit in de nier en andere organen1,2(hierna wordt VEGF-a aangeduid als VEGF). VEGF-niveaus in de nier zijn onder strakke homeostatische controle. Wanneer de renale VEGF-niveaus verhoogd of depressief zijn, kan de nier defect raken. Bijvoorbeeld, binnen 3 weken na de geboorte, muizen met podocyte-specifieke heterozygositeit voor VEGF ontwikkelen endotheliose en bloedloze glomeruli (dat wil zeggen, nierlaesies waargenomen bij menselijke preeclampsie), en eindstadium nierfalen treedt op in deze heterozygoten door 3 maanden oud. Podocyte-specifieke homo zygotische Knockouts sterven aan hydrops en nierfalen binnen 1 dag na de geboorte3,4.

Aan de andere kant veroorzaakt overexpressie van renale VEGF Proteïnurie en glomerulaire hypertrofie3,4. Bijvoorbeeld, transgene konijnen die VEGF vertonen vertonen progressieve Proteïnurie met verhoogde glomerulaire filtratie snelheden in vroege stadia van nefropathie, gevolgd door verminderde glomerulaire filtratie snelheden in latere stadia3. Diabetische nefropathie, een belangrijke oorzaak van eindstadium nierziekte bij diabetische volwassenen, wordt sterk geassocieerd met VEGF disregulatie2,5. Er is veel aandacht besteed aan de rol van hypoxie bij het induceren van VEGF-expressie onder pathologische omstandigheden5. Echter, de factoren voor VEGF onder fysiologische omstandigheden (zowel in de nier en andere organen) zijn niet goed begrepen2,6. Het identificeren van deze factoren (met uitzondering van zuurstof) die betrokken zijn bij fysiologisch en pathologisch VEGF-regelgeving is een belangrijke onderneming.

Luteïniserend hormoon (LH), een Pro-angiogenic hormoon, helpt bij het reguleren van de fysiologische VEGF expressie in voortplantingsorganen zoals de eierstok en testis7,8. Eerdere studies hebben aangetoond dat LH ook helpt bij het reguleren van VEGF in niet-voortplantingsorganen, zoals de ogen6,9,10. LH-receptoren zijn te vinden in de Medulla en cortex van de nier11,12. Van noot, niertubulaire epitheliale cellen, evenals de LH-receptor, Express VEGF11,12,13,14. Met deze twee observaties samen, we veronderstelde dat LH ook helpt reguleren VEGF expressie in de nier13,14. Om het bewijs te leveren van deze LH/VEGF-relatie, heeft het gepresenteerde protocol tot doel te laten zien dat LH-niveaus in staat zijn om VEGF-niveaus in de nier te voorspellen. Veel eerdere VEGF-gerelateerde onderzoeken met betrekking tot de nier hebben gebruik gemaakt van lagere orde zoogdieren modellen (d.w.z. knaagdieren en konijnen)2. Om dit werk te vertalen naar het menselijk lichaam, onderzoekt de studie de relatie tussen VEGF en LH in de hogere orde zoogdieren (hier, runderen en varkens modellen). Om dit doel te realiseren, werd totaal eiwit lysaat bereid uit de cortex-regio van runderen en varkens nieren.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Voor deze studie werden geen levende of experimentele dieren gebruikt.

1. weefselbehandeling

  1. Onmiddellijk na het slachten van een slachthuizen runderen en varkens hele nieren aanschaffen. Transport op ijs naar het laboratorium.
  2. Bij aankomst in het laboratorium, spoel de nieren af met 50 mL ijskoude fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS). Herhaal deze stap 2x om bloed volledig te verwijderen.
  3. Houd de nieren op het ijs (of gekoeld) tot verdere extractie.

2. dissectie van de nieren

  1. Gebruik een steriele schaar, een tang, een mes en Petri schalen om de nieren te ontleden en het benodigde weefsel gedeelte te accijns.
  2. Bereid de RIPA lysisbuffer vóór de nierdissectie. Los 5 mM NaCl op, 0,5 M EDTA, 1 M Tris (pH = 8,0), NP-40 (ID + GEPAL CA-630), 10% natrium deoxycholaat en 10% SDS in dubbel gedestilleerd water en meng vervolgens grondig. Koel de RIPA lysisbuffer wanneer deze niet in gebruik is.
  3. Snijd de nier zachtjes in de helft (Sagittaal vlak) en snijd een stukje weefsel (50-70 mm2) uit de cortex-regio in het midden van de nier (met een gewicht van 80-100 mg).
  4. Doe het weefsel blok in kleine stukjes met een mes om het homogenisatie proces te ondersteunen.
  5. Na het hakken van de weefsels, breng ze in een microfugebuis buis met 1 mL ijskoude 1x RIPA lysis extractiebuffer. Plaats de buisjes in ijs tot verdere extractie.

3. weefselhomogenisatie

  1. Label de microfugebuis buizen met specifieke sample Details voor weefsel supernatant collectie.
  2. Gebruik een handheld-homogenisator met een steriele sonde en homogeniseer de weefsels gedurende 1-2 minuten in koude omstandigheden (monsters op de ijsemmer) totdat er geen stukjes weefsels zichtbaar zijn.
  3. Onderwerp de weefsel extracten onmiddellijk voor centrifugeren in de gekoelde centrifuge bij 9.600 x g gedurende 5 minuten bij 4 °c.
  4. Verwijder de buizen van de centrifuge en plaats ze op de ijsemmer.
  5. Verzamel de supernatant in een nieuw gelabelde microfugebuis Tube en bewaar op ijs. Gooi de pellet weg.
  6. Bereid afzonderlijke aliquots van de supernatanten voor LH en VEGF-een enzym-gebonden immunosorptie-assays (Elisa) en totale eiwitanalyse, om te voorkomen dat vries-dooi cycli.

4. runderen en varkens LH-ELISA-test

  1. Bewaar alle ELISA-assay componenten die zijn opgenomen in de in de handel verkrijgbare ELISA-kit voor luteïniserend hormoon (Zie tabel met materialen) bij 2-8 °c. Dit omvat het antilichaam, HRP-conjugaat, test plaat (96 well), Kalibrators, wasbuffer (20x concentraat), substraat A, substraat B en stop oplossing. Bereid alle reagentia voor zoals aanbevolen door de instructies van de fabrikant.
  2. Breng vóór aanvang van de test alle reagentia en de test plaat op kamertemperatuur (RT). Gebruik het vereiste aantal putten voor de Assay, Seal, en bewaar de ongebruikte putjes bij 4 °C tot het gebruik.
  3. Verdun de reinigings buffer (15 mL 20x concentraat) tot 300 mL met dubbel gedestilleerd water
  4. De lege putjes zonder oplossing instellen.
  5. Voeg aan elke put 50 μL standaard of monster toe (n = 2) en voeg vervolgens nog eens 50 μL mierikswortelperoxidase (HRP)-conjugaat toe aan elk goed. Voeg onmiddellijk nog eens 50 μL antilichaam oplossing toe aan elk goed. Sluit de plaat af, meng goed en inincuberen gedurende 1 uur bij 37 °C.
  6. Was de putjes met 1x wasbuffer (200 μL/well) en herhaal 4x.
  7. Voeg aan elke put 50 μL substraat A en 50 μL substraat B toe en meng goed door de plaat aan de zijkant zachtjes te tikken. Sluit de plaat af en incuberen gedurende 15 minuten gedurende 15 minuten bij 37 °C in het donker.
  8. Voeg aan elke put 50 μL stop oplossing toe, tik zachtjes op de plaat en lees de plaat met de spectrofotometer ingesteld op een golflengte van 450 nm.
  9. Normaliseer runderen en varkens LH niveaus tot totaal eiwit (zie rubriek 6).

5. runderen en varkens VEGF-een ELISA-test

  1. Bewaar alle ELISA-assay componenten die zijn opgenomen in de in de handel verkrijgbare vasculaire endotheliale groei factor-een ELISA-Kits (Zie tabel met materialen) bij 2-8 °c. Dit omvat het antilichaam, HRP-conjugaat, test plaat (96 well), Kalibrators, wasbuffer (20x concentraat), substraat A, substraat B en stop oplossing. Bereid alle reagentia voor zoals aanbevolen door de instructies van de fabrikant.
  2. Breng, voordat u begint met de test, alle reagentia en de test plaat naar RT. gebruik het vereiste aantal putjes voor de Assay, afdichting en bewaar de ongebruikte putjes bij 4 °C tot het gebruik.
  3. Verdun de reinigings buffer (15 mL 20x concentraat) tot 300 mL met dubbel gedestilleerd water
  4. Voeg aan elke put 100 μL van de norm of het monster toe (n = 2). Sluit de plaat af, meng goed en inincuberen voor 2 uur bij 37 °C.
  5. Verwijder de vloeistof in elk goed en voeg 100 μL detectie reagens A aan elk goed toe, sluit de plaat af en inincuberen gedurende 1 uur bij 37 °C.
  6. Was de putjes met 1x wasbuffer (400 μL/well) en herhaal 4x.
  7. Voeg 100 μL detectie reagens B toe aan elk goed en meng goed door de plaat aan de zijkant zachtjes te tikken. Sluit de plaat af en inbroed de plaat gedurende 1 uur bij 37 °C.
  8. Was de putjes met 1x wasbuffer (400 μL/well) en herhaal 4x.
  9. Voeg aan elke put 90 μL substraat oplossing toe, tik zachtjes op de plaat en inincuberen gedurende 1 uur bij 37 °C.
  10. Voeg aan elke put 50 μL stop oplossing toe, tik zachtjes op de plaat en lees de plaat met de spectrofotometer ingesteld op een golflengte van 450 nm.
  11. Normaliseren van runderen en varkens VEGF-een gehalte aan totaal eiwit (rubriek 6).

6. totaal eiwit schatting

  1. Raming van het totaal eiwit van de extracten van runderen en varkens nieren door standaard boviene serumalbumine (BSA) assay met behulp van een commerciële Kit (Zie tabel met materialen) volgens de aanbevelingen van de fabrikant.

7. statistische analyse

  1. Bereken het gemiddelde, de mediaan en de standaarddeviatie van elke analyt.
  2. Test de divergentie van de monster verdeling van normaal gebruik van de Kolmogorov-Smirnov-test om, bij gebruik, te beslissen tussen parametrische versus niet-parametrische statistische tests. Als gegevens normaalgesproken worden gedistribueerd, voert u statistische tests uit via parametrische tests.
  3. Gebruik onder passende omstandigheden (zoals normale Gegevensdistributie) regressiemodellen om de lineaire relatie tussen LH en VEGF-A te onderzoeken.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De gemiddelde en mediane niveaus van LH en VEGF per diersoort en geslacht worden weergegeven in tabel 1. Na het verifiëren van de normaliteit van gegevens door Kolmogorov-Smirnov-testen van normaliteit, werden lineaire regressiemodellen gebruikt om de relatie tussen LH en VEGF te onderzoeken. LH bleek een sterke en significante voorspeller te zijn van VEGF in zowel runderen als varkens (runderniermodel: n = 7, R2 = 0,86, p = 0,002; varkens niermodel: n = 7; R

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Het aanschaffen van de nieren uit de slachterij onmiddellijk na de dood van dieren is de sleutel tot succes in deze methodologie. Dit is het belangrijkste voordeel van het gebruik van organen van koeien en varkens in plaats van menselijke cadavers. Er is meestal ten minste een 12-24 h vertraging van de tijd van de dood totdat menselijke kadaver organen worden verkregen. Omdat de chemische samenstelling van de lichaamsorganen significant verandert binnen 2 h post-mortem15,

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Zietchick Research Institute (ZRI) is een private (for-profit) Research Institute, en Dr. Tammy Movsas (oprichter en directeur van ZRI) heeft een hangende octrooiaanvragen en gevalideerde octrooien voor het gebruik van gonadotrofine antagonisten bij de behandeling van oogziekten en diabetes. Anders dan een werknemer (biochemicus) bij ZRI, heeft Dr. A. Muthusamy geen andere financiële conflicten om te rapporteren. A. Arivalagan (Summer intern bij ZRI, undergraduate student aan University of Michigan) heeft geen andere financiële conflicten om te rapporteren.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs bedanken het slachthuis van Scholl (Blissfield, MI) voor het leveren van de runderen en varkens nieren. Voor deze studie werd geen subsidiefinanciering gebruikt.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Bovine LH ELISA KitMyBiosource, San Diego, CA.MBS700951
Bovine VEGF-A ELISA KitMyBiosource, San Diego, CA.MBS2887434
Micro BCA Protein Assay KitThermoFisher Scientific Inc, Columbus, OH.23235
Porcine LH ELISA KitMyBiosource, San Diego, CA.MBS009739
Porcine VEGF-A ELISARay Biotech, Norcross, GA.ELP-VEGFA-1
RIPA Lysis and Extraction BufferThermoFisher Scientific Inc, Columbus, OH.89901

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Advani, A., et al. Role of VEGF in maintaining renal structure and function under normotensive and hypertensive conditions. Proceedings of the National Academy of Science U. S. A. 104 (36), 14448-14453 (2007).
  2. Majumder, S., Advani, A. VEGF and the diabetic kidney: More than too much of a good thing. Journal of Diabetes and its Complications. 31 (1), 273-279 (2017).
  3. Liu, E., et al. Increased expression of vascular endothelial growth factor in kidney leads to progressive impairment of glomerular functions. Journal of the American Society of Nephrology. 18 (7), 2094-2104 (2007).
  4. Eremina, V., et al. Glomerular-specific alterations of VEGF-A expression lead to distinct congenital and acquired renal diseases. Journal of Clinical Investigation. 111 (5), 707-716 (2003).
  5. Ferrara, N. Vascular endothelial growth factor: basic science and clinical progress. Endocrine Reviews. 25 (4), 581-611 (2004).
  6. Movsas, T. Z., Sigler, R., Muthusamy, A. Vitreous Levels of Luteinizing Hormone and VEGF are Strongly Correlated in Healthy Mammalian Eyes. Current Eye Research. 43 (8), 1041-1044 (2018).
  7. Babitha, V., et al. Luteinizing hormone, insulin like growth factor-1, and epidermal growth factor stimulate vascular endothelial growth factor production in cultured bubaline granulosa cells. General and Comparative Endocrinology. 198, 1-12 (2014).
  8. Trau, H. A., Davis, J. S., Duffy, D. M. Angiogenesis in the Primate Ovulatory Follicle Is Stimulated by Luteinizing Hormone via Prostaglandin E2. Biology of Reproduction. 92 (1), 15(2015).
  9. Movsas, T. Z., et al. Confirmation of Luteinizing Hormone (LH) in Living Human Vitreous and the Effect of LH Receptor Reduction on Murine Electroretinogram. Neuroscience. 385, 1-10 (2018).
  10. Movsas, T. Z., Sigler, R., Muthusamy, A. Elimination of Signaling by the Luteinizing Hormone Receptor Reduces Ocular VEGF and Retinal Vascularization during Mouse Eye Development. Current Eye Research. 43 (10), 1286-1289 (2018).
  11. Hipkin, R. W., Sanchez-Yague, J., Ascoli, M. Identification and characterization of a luteinizing hormone/chorionic gonadotropin (LH/CG) receptor precursor in a human kidney cell line stably transfected with the rat luteal LH/CG receptor complementary DNA. Molecular Endocrinology. 6 (12), 2210-2218 (1992).
  12. Lei, Z. M., et al. Targeted disruption of luteinizing hormone/human chorionic gonadotropin receptor gene. Molecular Endocrinology. 15 (1), 184-200 (2001).
  13. Schrijvers, B. F., Flyvbjerg, A., De Vriese, A. S. The role of vascular endothelial growth factor (VEGF) in renal pathophysiology. Kidney International. 65 (6), 2003-2017 (2004).
  14. Apaja, P. M., Aatsinki, J. T., Rajaniemim, H. J., Petaja-Repo, U. E. Expression of the mature luteinizing hormone receptor in rodent urogenital and adrenal tissues is developmentally regulated at a posttranslational level. Endocrinology. 146 (8), 3224-3232 (2005).
  15. Ondruschka, B., et al. Post-mortem in situ stability of serum markers of cerebral damage and acute phase response. International Journal of Legal Medicine. 133 (3), 871-881 (2019).
  16. Swain, R., et al. Estimation of post-mortem interval: A comparison between cerebrospinal fluid and vitreous humour chemistry. Journal of Forensic and Legal Medicine. 36, 144-148 (2015).
  17. Thompson, C. S., Traynor, I. M., Fodey, T. L., Faulkner, D. V., Crooks, S. R. H. Screening method for the detection of residues of amphenicol antibiotics in bovine, ovine and porcine kidney by optical biosensor. Talanta. 172, 120-125 (2017).
  18. Konstantinou, G. N. Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA). Methods in Molecular Biology. 1592, 79-94 (2017).
  19. Levesque, B. M., et al. Low urine vascular endothelial growth factor levels are associated with mechanical ventilation, bronchopulmonary dysplasia and retinopathy of prematurity. Neonatology. 104 (1), 56-64 (2013).
  20. Leviton, A., et al. Antecedents and early correlates of high and low concentrations of angiogenic proteins in extremely preterm newborns. Clinica Chimica Acta. 471, 1-5 (2017).
  21. Simo-Servat, O., Hernandez, C., Simo, R. Usefulness of the vitreous fluid analysis in the translational research of diabetic retinopathy. Mediators of Inflammation. , 872978(2012).
  22. Sharma, R. K., Rowe-Rendleman, C. L. Validation of molecular and genomic biomarkers of retinal drug efficacy: use of ocular fluid sampling to evaluate VEGF. Neurochemical Research. 36 (4), 655-667 (2011).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Lineaire relatieanalyserunder en varkensmodellennormalisatie van totaal eiwitELISA assayprotocolweefseldissectiemethodespectrophotometrische uitlezingstudie naar renale fysiologie

Gerelateerde artikelen