Gebruikmakend van intravitale microscopie, maakt de hier gepresenteerde methode real-time visualisatie van darmeppitheelcelvergieten bij levende dieren mogelijk. Daarom is geigreerd darmslijmvlies (acriflavine en rhodamineB-dextran) van verdoofde muizen afgebeeld tot eencellige resolutie met behulp van confocale microscopie.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Een intravitale microscopie-gebaseerde benadering om darmdoorlatendheid en epitheelcelvergieten prestaties te beoordelen
* These authors contributed equally
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Intravitale microscopie van de darm met behulp van confocale beeldvorming maakt real-time observatie van epitheelcelvergieten en barrièrelekkage bij levende dieren mogelijk. Daarom is het darmslijmvlies van verdoofde muizen geigreerd met niet-specifieke vlekken (acriflavine) en een fluorescerende tracer (rhodamine-B dextran), gemonteerd op een zoute oplossingsspoelplaat en direct afgebeeld met behulp van een confocale microscoop. Deze techniek kan een aanvulling vormen op andere niet-invasieve technieken om lekkage van darmdoorlatendheid te identificeren, zoals transmucosale passage van oraal toegediende tracers. Daarnaast maakt de hier gepresenteerde aanpak het mogelijk om de gebeurtenissen in celvergieten in real-time te observeren. In combinatie met geschikte fluorescerende reportermuizen is deze aanpak geschikt om licht af te werpen in cellulaire en moleculaire mechanismen die darmeppitheelcelextrusie controleren, evenals aan andere biologische processen. In de afgelopen decennia hebben interessante studies met behulp van intravitale microscopie bijgedragen aan kennis over endotheeldoorlatendheid, immuuncelearm homing, immuun-epitheliale communicatie en invasie van luminale componenten, onder anderen. Samen zou het hier gepresenteerde protocol niet alleen bijdragen tot een groter begrip van mechanismen die epitheliale celextrusie controleren, maar ook de basis kunnen vormen voor de ontwikkeling van andere benaderingen die moeten worden gebruikt als instrumenten om andere zeer dynamische cellulaire processen te visualiseren, zelfs in andere weefsels. Onder technische beperkingen zouden de optische eigenschappen van het specifieke weefsel, evenals de geselecteerde beeldvormingstechnologie en microscoopconfiguratie, op zijn beurt de beeldafstand en de resolutie van verworven beelden bepalen.
Inleiding
De darm is een zeer gespecialiseerd orgaan met een strak gereguleerde functie die conflicterende processen mogelijk maakt, namelijk voeding en bescherming tegen schadelijke luminale stoffen. Voering tussen het menselijk lichaam en het milieu, het darmeptheel fungeert als een fysieke en immunologische barrière en draagt bij aan het behoud van mucosale homeostase in de darm1,2. Verlies van epitheliale integriteit en verhoogde nauwe verbindingdoorlaatbaarheid is bekend te worden geassocieerd met inflammatoire darmziekte (IBD)3,4,
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
Het volgende protocol is goedgekeurd door de bevoegde lokale autoriteiten in Erlangen (Regierung von Unterfranken, Würzburg, Duitsland). Muizen werden ondergebracht onder specifieke ziekteverwekkervrije omstandigheden.
OPMERKING: Remming van GGTase-gemedieerde prenylation binnen IECs veroorzaakt een ernstige verandering van darmomvang bij Pggt1biΔIEC muizen24. Daarom werd dit muismodel gebruikt om aan te tonen hoe het protocol nuttig kan zijn om darmbarrièredefecten te bestuderen. Dit protocol kan echter worden gebruikt voor de studie van een andere muislijn.
1. Chirurgis....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Het hier gepresenteerde protocol beschrijft een intravitale microscopiegebaseerde benadering om darmepelende lekkage te visualiseren en de prestaties van celafstoten in de darm in real-time te observeren. Kortom, muizen worden verdoofd en voorgelegd aan chirurgische voorbereiding om het oppervlak van het dunne darmslijmvlies bloot te stellen. IECs worden vervolgens gekleurd via actuele toepassing van acriflavine; terwijl luminale rhodamine B-dextran wordt gebruikt als tracers om transmuco.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Hoewel technisch uitdagend, intravital microscopie-gebaseerde methodologie vertegenwoordigt een unieke experimentele aanpak om zeer dynamisch cellulair proces visualiseren in real time, zoals cel vergieten prestaties. Tot nu toe is er geen alternatieve experimentele benadering om celextrusie in vivo te visualiseren. Wij geloven dat dit protocol kan bijdragen aan de beschrijving van diverse cellulaire processen die een rol spelen bij het behoud van darmhomeostase.
Gebruikmakend van intravitale .......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Dankbetuigingen
Het onderzoek dat tot deze resultaten heeft geleid, heeft financiering ontvangen van het People Program (Marie Curie Actions) in het kader van REA-subsidieovereenkomst nummer 302170 van het zevende kaderprogramma van de Europese Unie (KP7/2007-2013); het Interdisciplinair Centrum voor Klinisch Onderzoek (IZKF) van de Universiteit Erlangen-Neurenberg; het Collaborative Research Center TRR241 en de Clinical Research Group KFO257 van de Duitse Onderzoeksraad (DFG); en de DFG.
....Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| Acriflavine hydrochloride | Sigma Aldrich | A8251 | 1 mg/mL oplossing in PBS |
| Deltaphase isothermische pad | BrainTree | B-DP-PAD | - |
| Gemini Cautery System | BrainTree | B-GEM-5917 | - |
| Ketamin | WDT | 9089.01.00 | |
| LAS X | Leica | - | - |
| LSM microscoop SP8 | Leica | - | - |
| PBS | Biochrom | L182 | |
| Rhodamine B dextran | Invitrogen | D1824 | 10.000 kDa MW; 2 mg/mL oplossing |
| Standaardtang (Dumont SS) | Fine Science Tools | 11203-23 | - |
| Rechte fijne schaar | Fine Science Tools | 14060-10 | - |
| Tamoxifen | Sigma Aldrich | T5648 | 50 mg/mL in ethanol |
| Xylazin | Bayer | 1320422 |
Referenties
- Buhner, S., et al. Genetic basis for increased intestinal permeability in families with Crohn's disease: role of CARD15 3020insC mutation? Gut. 55 (3), 342-347 (2006).
- Pastorelli, L., De Salvo, C., Mercado, J. R., Vecchi, M., Pizarro, T. T.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
