Methodenartikel

Hoge nauwkeurigheid correctie van 3D Chromatische verschuivingen in het tijdperk van super-resolutie biologische beeldvorming met behulp van Chromagnon

8.3K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/60800

⸱

16 juni 2020

 ,  ,  ,  , 
1Advanced ICT Research Institute Kobe, National Institute of Information and Communications Technology, 2Graduate School of Frontier Biosciences, Osaka University, 3Micron Advanced Bioimaging Unit, Department of Biochemistry, University of Oxford

In dit artikel

Samenvatting

Correctie van chromatische verschuivingen in driedimensionale (3D) multicolor fluorescentie microscopie beelden is cruciaal voor kwantitatieve data-analyses. Dit protocol is ontwikkeld om chromatische verschuivingen in biologische monsters te meten en te corrigeren door het verwerven van geschikte referentiebeelden en verwerking met de open-source software, Chromagnon.

Samenvatting

Kwantitatieve multicolor fluorescentie microscopie is gebaseerd op de zorgvuldige ruimtelijke matching van kleur kanalen verworven op verschillende golflengten. Als gevolg van chromatische aberratie en de onvolmaakte uitlijning van camera's, beelden verworven in elk kanaal kan worden verschoven, en vergroot, evenals gedraaid ten opzichte van elkaar in een van de drie dimensies. Met de klassieke kalibratiemethode worden chromatische verschuivingen gemeten door veelkleurige kralen die aan het oppervlak van een coverslip zijn bevestigd, en een aantal software is beschikbaar om de chromatische verschuivingen van dergelijke kalibratiemonsters te meten. Chromatische aberratie kan echter variëren met diepte, veranderen met observatieomstandigheden en worden veroorzaakt door het biologische monster zelf, waardoor de bepaling van de werkelijke hoeveelheid chromatische verschuiving in het monster van belang en over het volume wordt belemmerd. Het corrigeren van chromatische verschuivingen bij hogere nauwkeurigheid is met name relevant voor microscopie met superresolutie, waarbij slechts lichte chromatische verschuivingen kwantitatieve analyses kunnen beïnvloeden en de interpretatie van veelkleurige beelden kunnen veranderen. We hebben een open-source software Chromagnon en bijbehorende methoden ontwikkeld om 3D chromatische verschuivingen in biologische monsters te meten en te corrigeren. Hier bieden we een gedetailleerd toepassingsprotocol dat speciale vereisten bevat voor monstervoorbereiding, gegevensverwerving en softwareverwerking om chromatische verschuivingen in biologische monsters van belang te meten.

Inleiding

Multicolor imaging is een van de fundamentele aspecten van biologische fluorescentie microscopie, in gevallen waarin de ruimtelijke relatie van verschillende moleculen of structuren is van groot belang. Chromatische aberratie, een optische aberratie van polychromatisch licht veroorzaakt door dispersie, verandert de schijnbare positie van de gekleurde objecten van belang. Op dezelfde manier, microscopen uitgerust met meerdere camera's gewijd aan het verwerven van elke kleur hebben meer complexe chromatische verschuivingen als gevolg van verschillen in optische elementen en onvolmaakte uitlijning tussen de kanalen. Dergelijke chromatische verschuivingen kunnen dus leiden tot een verkeerde conclusie, tenzij de gebruiker dit expliciet heeft gecorrigeerd. Hoewel chromatische verschuivingen geen groot probleem zijn geweest zolang de resolutie van microscopie wordt beperkt door de klassieke resolutielimiet, heeft de recente ontwikkeling van microscopie met superresolutie1 geleid tot de noodzaak van een nauwkeurigere correctie van chromatische verschuivingen.

Het is een gangbare praktijk om chromatische verschuivingen van microscoopsystemen te meten met behulp van een veelkleurige kraalkalibratieglijbaan2. De op kralen gebaseerde kalibratiemethode is geschikt voor het meten van chromatische verschuivingen van de gehele optiek van de microscoop naar het oppervlak van de coverslip2. Deze methode is echter niet in staat chromatische verschuivingen in de biologische monsters van belang te meten. Het is belangrijk op te merken dat veel biologische monsters driedimensionaal (3D) zijn, en de chromatische verschuivingen van dergelijke monsters verschillen van die aan het oppervlak van de coverslip. Bovendien veranderen chromatische verschuivingen met beeldomstandigheden2,3. We hebben de chromatische verschuivingen in 3D biologische monsters gemeten en vastgesteld dat de onzekerheid van chromatische verschuivingen vaak maar liefst 350 nm was door de klassieke multicolor-kraalkalibratie methode3. Daarom moeten chromatische verschuivingen worden gemeten in biologische monsters op de diepte van de belangstelling en onder de imaging omstandigheden die worden gebruikt.

Hier beschrijven we procedures om chromatische verschuivingen in biologische monsters te meten en deze verschuivingen te corrigeren met behulp van onze software, Chromagnon3. Om chromatische verschuivingen in biologische monsters te meten, maakt onze methode gebruik van twee soorten gegevenssets, een "doel" afbeelding en een "referentie" afbeelding. De "doel" afbeelding is een veelkleurig beeld van belang, bijvoorbeeld, beelden gekleurd voor DNA, nucleaire envelop, en microtubuli. Het is vaak onmogelijk om chromatische verschuivingen in een dergelijk beeld te meten. Daarom hebben we een "referentie" afbeelding nodig die is gewijd aan het meten van de chromatische verschuivingen in het monster. De enige definitie van een "referentie" afbeelding is een veelkleurige afbeelding van hetzelfde object. In deze zin is een veelkleurige kralenafbeelding ook een type referentieafbeelding. Hier beschrijven we drie verschillende soorten referentiebeeld die worden gebruikt om chromatische verschuivingen in de biologische monsters te meten: "crosstalk referentiebeelden", "bright-field reference images" en "biological calibration reference images". Het type referentieafbeelding is afhankelijk van het type microscoop dat wordt gebruikt of de vereiste correctienauwkeurigheid zoals samengevat in tabel 1.

OverspraakHelder veldBiologische kalibratie (op een andere dia)Biologische kalibratie (op dezelfde dia)
Nauwkeurigheidvan een ++++++b +++
Eenvoud+++++++++
Toepasselijke microscopieBreed veldBreed veldAlleAlle
Beschikbaarheid van lokale uitlijning++-c -c
a: Aantal "+" geeft een stijgende beoordeling aan. Single plus is ongeveer 50 nm en drie plus is ongeveer 15 nm in 3D.
b: De nauwkeurigheid hangt af van de hoogte van de variabele beeldvormingsomstandigheden constant worden gehouden.
c: Lokale kalibratie gemeten door veelkleurige kraalmonsters kan worden gecombineerd zoals beschreven in protocol sectie 4.

Tabel 1: Parameters bij het kiezen van het type referentieafbeeldingen.

"Crosstalk referentiebeelden" hebben de hoogste correctienauwkeurigheid en zijn relatief eenvoudig te bereiken3,4 (tabel 1). Het nadeel is hun beperking in microscopie toepassingen als gevolg van hun onvermogen van het meten van chromatische verschuivingen in opwinding paden. Ook, om dergelijke beelden te verkrijgen, moet de microscoop worden uitgerust met multiband dichroic spiegels, en emissiefilters die onafhankelijk worden gecontroleerd van de excitatie filters of lichtbronnen. Geschikte microscopie omvat conventionele breedveldmicroscopie, single molecule localisatie microscopie (SMLM) zoals foto-geactiveerde lokalisatie microscopie / stochastische optische reconstructie microscopie (PALM / STORM)5,6 en uitbreiding microscopie7 waargenomen met breedveldmicroscopie. Een kruisspraakreferentieafbeelding wordt verkregen uit het doelsteekproef zelf. Het is een beeld van crosstalk (bleed-through) fluorescentie van een kleurstof verkregen in alle vereiste kanalen. Fluorescentie emissie breidt zich altijd uit naar de langere golflengten, daarom kleurstoffen met de kortste emissie golflengte zijn enthousiast om crosstalk fluorescentie te verkrijgen in kanalen van langere golflengten. Wanneer het monster bijvoorbeeld is gekleurd met blauw, groen en rood, wordt alleen de blauwe kleurstof opgewekt en wordt het emissielampje verkregen in de blauwe, groene en rode kanalen. In dit protocol, DNA gekleurd met 4′, 6-diamidino-2-fenylindole (DAPI) werd gebruikt om crosstalk fluorescentie te verkrijgen.

"Bright-field reference images" zijn een gemakkelijker en minder fototoxisch alternatief voor "crosstalk referentiebeelden", maar zijn de minst nauwkeurige3 (tabel 1). Dit zijn heldere veldafbeeldingen van het doelsampproef, verkregen in alle kleurkanalen die in de doelafbeelding worden gebruikt.

"Biologische kalibratiereferentiebeelden" hebben het voordeel dat zij van toepassing zijn op elk type microscopie vanwege hun vermogen om de chromatische verschuivingen te meten, zowel in de excitatie- als in emissiepaden3,8 (tabel 1). Geschikte microscopie omvat breedveldmicroscopie, confocale microscopie, lichtplaatmicroscopie, gestimuleerde emissieuitputting (STED)9, structured illumination microscopy (SIM)10, Airyscan/SORA11,12, SMLM waargenomen met de totale interne reflectie fluorescentie (TIRF) modus, Olympus super resolutie (OSR)13, enzovoort. Een biologische kalibratiereferentieafbeelding wordt verkregen uit een kalibratiemonster dat op dezelfde manier is bereid als het doelmonster, maar met het beitsen van een enkele structuur met meerdere kleuren. De correctie nauwkeurigheid blinkt uit de resolutie van de meeste super-resolutie microscopie en de voorbereiding van een biologische kalibratie monster kan relatief eenvoudig zijn. Een ander voordeel is de beschikbaarheid van "gemiddelde" meerdere referentiebeelden. Daarom, hoewel de afzonderlijke beelden slechte informatie voor de meting van chromatische verschuivingen bevatten, kan de informatieinhoud door het gemiddelde van meerdere beelden worden verhoogd. De nauwkeurigheid hangt af van hoeveel de beeldvorming voorwaarden constant worden gehouden. In dit verband worden de beste prestaties verkregen wanneer zowel doel- als referentiemonsters zich op dezelfde dia bevinden, bijvoorbeeld met 8 goed kamersde afdekglazen(tabel 1, rechts-meest). In dit protocol, actin gekleurd met drie kleuren van phalloidin werd gebruikt als een biologische kalibratie.

Zodra een referentieafbeelding is verkregen, wordt de chromatische verschuiving gemeten en gecorrigeerd door onze software Chromagnon. Er is geen beperking op het aantal kanalen, Z secties en termijnen die Chromagnon kan meten en corrigeren van de chromatische verschuivingen voor. Chromagnon meet chromatische verschuivingen in twee stappen. De eerste stap verwerft de "globale" of "affine" uitlijning parameters van de vertaling in de X, Y, Z assen, vergroting langs de X, Y, Z assen, en rotatie rond de Z-as. De berekening nauwkeurigheid van de globale uitlijning is ~ 16 nm in 3D en ~ 8 nm in 2D. De tweede stap is een optionele 2D iteratieve "lokale uitlijning" op geprojecteerde afbeeldingen om een hogere nauwkeurigheid te verkrijgen. In het lokale uitlijningsproces worden de afbeeldingen onderverdeeld in meerdere regio's en worden chromatische verschuivingen in deze lokale regio's gemeten. Vervolgens worden de regio's verder verdeeld en chromatische verschuivingen in de subregio's worden iteratief gemeten totdat het aantal pixels in de regio het minimumaantal pixels (meestal 60 x 60 pixels) bereikt. De resulterende lokale uitlijningskaart wordt gecombineerd met de parameter globale uitlijning en wordt door een elastische transformatie op de doelafbeelding toegepast. Na deze stap wordt de berekeningsnauwkeurigheid verbeterd tot ~ 14 nm in 3D en ~ 6 nm in 2D. De lokale uitlijning is niet geschikt voor biologische kalibratiereferentiebeelden omdat de biologische structuur in de referentie verschilt van die in het doel(tabel 1). Daarom wordt alleen globale uitlijning gebruikt voor biologische kalibratiereferentiebeelden.

De lokale chromatische verschuivingen zijn afkomstig uit twee bronnen; microscoop instrumentele lokale vervorming en biologische structurele inhomogeniteit. Omdat microscoop instrumentale lokale vervorming constant is, kan dit worden gemeten aan de hand van het veelkleurige kralenreferentiemonster en gecorrigeerd als een vaste parameter. Chromagnon kan de microscoop instrumentale lokale vervormingskaart en de globale uitlijningsparameters van de biologische kalibraties combineren(tabel 1). Met behulp van deze methode wordt verwacht dat de gemiddelde nauwkeurigheid van biologische kalibratie zal worden verbeterd met een extra 1−2 nm.

Hier beschrijven we een protocol om de chromatische verschuivingen van 3D-fluorescentiebeelden te corrigeren met behulp van onze software Chromagnon, van de gemakkelijkste lage kant tot de hoogste nauwkeurigheid. We gebruiken immunostaining van HeLa-cellen als voorbeeld en hebben ze geobserveerd met behulp van 3D-breedveldmicroscopie en 3D-SIM. In het eerste deel beschrijven we hoe we doelmonsters en biologische kalibratiemonsters kunnen voorbereiden. Dit deel van het protocol moet worden geoptimaliseerd voor de specifieke doelstellingen van het onderzoek. In het tweede deel beschrijven we de acquisitiemethoden voor drie soorten referentiebeelden door microscopen. De veronderstelling was om blauwe, groene en rode kanalen te verkrijgen, maar kanaalsamenstelling moet worden gewijzigd door de specifieke doelen van het onderzoek en door de opstellingen van de microscoop. Het maakt niet uit of de microscoop is uitgerust met een enkele camera of meerdere camera's. In het derde deel beschrijven we hoe men onze software kan gebruiken om chromatische verschuivingen van de doelafbeelding te meten en te corrigeren met behulp van referentiebeelden. Ten slotte beschrijven we in het vierde deel een methode om de biologische kalibratiereferentiebeelden aan te vullen met behulp van de instrumentale lokale kalibratie van een microscoop.

Protocol

1. Voorbereiding van de steekproef

  1. Bereiding van een doelmonster
    1. Zaad 2,5 x 105 HeLa-cellen op een schotel met glazen bodem van 35 mm en telen in 2 mL groeimedium (Dulbecco's gemodificeerde adelaarsmedium met L-glutamine en natriumpyruvaat aangevuld met 10% foetaal runderserum [FBS]) bij 37 °C en een CO2-concentratie van 5%. Als alternatief zaad 6 x 104 HeLa cellen op een 8-goed chambered coverglass en groeien ze in 0,5 mL groeimedium bij 37 °C en een CO2-concentratie van 5%. Gebruik #1,5 afdekglas (met een dikte van 0,170 mm) voor microscopie met hoge resolutie.
      OPMERKING: Gebruik 1/4 volumes voor het 8-goed chambered coverglas voor verdere stappen, behalve stappen 1.1.5, 1.1.6, 1.1.8, 1.1.11 en 1.2.5 waar het volume 100 μl is, ongeacht het type container.
    2. Vervang de oplossing na ongeveer 24 uur incubatie door 2 mL van 3,7% formaldehyde in fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS). Na het zachte mengen, blijven cellen vast te stellen gedurende 15 min bij kamertemperatuur (RT) op een rotatieplatform.
      LET OP: Werk in een rookkap.
    3. Was cellen met 2 mL PBS, 3x elk voor 5−10 min op een rotatieplatform.
      LET OP: Volg de lokale regelgeving om formaldehydeafval te verwijderen.
    4. Permeabiliseren cellen met 2 mL van 0,1% Triton X-100 in PBS gedurende 5 minuten op een rotatieplatform, gevolgd door drie wasbeurten met 2 mL PBS, elk voor 5−10 min op een rotatieplatform.
    5. Incubeercellen in 100 μL van 1% runderserum albumine (BSA) in PBS voor 1 uur bij RT op een rotatieplatform.
    6. Vervang de oplossing door 100 μL van een mengsel van primaire antilichamen (anti-emerine polyklonale antilichaam14 en anti-tubuline monoklonale antilichaam15) in 1% BSA in PBS bij passende verdunningen (1/500 voor anti-emerine en 1/100 voor anti-tubuline), en incubate 's nachts bij 4 °C.
    7. Was cellen met 2 mL PBS, 3−5x elk gedurende 10 minuten op een rotatieplatform.
    8. Vervang de oplossing door 100 μL van een mengsel van secundaire antilichamen (anti-konijn IgG door Alexa Fluor 488 en anti-muis IgG door Alexa Fluor 555) in 1% BSA in PBS bij 1/500 verdunning, en incubate voor 3−4 h bij RT.
    9. Was cellen met 2 mL PBS, 3−4x elk gedurende 5 minuten op een rotatieplatform.
    10. Vervang de oplossing door 2 mL van 0,5 μg/mL DAPI in PBS om DNA 30 minuten bij RT op een rotatieplatform te bevlekken.
      OPMERKING: In plaats van DAPI kan hoechst 33342 met dezelfde concentratie ook worden gebruikt.
    11. Vervang de oplossing door ~100 μL montagemedium (Tabel van materialen).
  2. Bereiding van een biologisch kalibratiemonster
    1. Bereid vaste cellen voor zoals beschreven in stap 1.1.1−1.1.4.
      LET OP: Bij voorkeur worden monsters op een chambered coverglass bereid om zowel de doel- als de referentiemonsters in afzonderlijke kamers op dezelfde coverlip te plaatsen(tabel 1, rechts-meest). Dit preparaat heeft de voorkeur wanneer het experiment de hoogste correctienauwkeurigheid vereist. Wanneer het monster op een gewone afdekplaat moet worden bereid, gebruikt u precisiehoezenlips met een lage diktevariatie ("nr. 1,5H") om de reproduceerbaarheid te verzekeren.
    2. Bereid de voorraadoplossing van fluorescerende verf-geconjugeerde phalloïdine in 1,5 mL methanol voor en bewaar bij -20 °C. Meng phalloïdenbouillonoplossing in PBS bij de volgende verdunning: 1/100 voor phalloidin met Alexa Fluor 405, 1/1.000 voor falloidine met Alexa Fluor 488 en 1/200 voor falloidin met Alexa Fluor 594.
    3. Vervang de oplossing door 1 mL van het phalloïdenmengsel bereid in stap 1.2.2 en incubeer gedurende 30 minuten bij RT op een rotatieplatform.
    4. Was cellen met 2 mL PBS, 3−5x elk gedurende 10 minuten op een rotatieplatform.
    5. Vervang de oplossing door ~100 μL montagemedium.
      LET OP: De kalibratiemonsters kunnen worden opgeslagen bij 4 °C of -20 °C voor herhaald gebruik.

2. Verwerving van referentiebeelden

  1. Kruistalk-referentieafbeeldingen
    1. Plaats het doelmonster dat in stap 1.1 is bereid op een breedveldmicroscoop.
    2. Verwerf een fluorescentiebeeld van het doel in blauwe, groene en rode kanalen.
      OPMERKING: Voor 3D-afbeeldingen kan de Z-stapgrootte in de referentieafbeelding afwijken van die in de doelafbeelding, zolang het afbeeldingsbestand informatie bevat voor de stapgrootte. De Z-stapgrootte voor referentie- en doelafbeeldingen is bij voorkeur minder dan de helft van de optische resolutie van de Z-as, die wordt berekend figure-protocol-1 door voor een microscopie met een diffractie, waarbij λ de golflengte in nanometers is en NA het numerieke diafragma van de objectieve lens is. Als de axiale resolutie bijvoorbeeld 550 nm is, gebruikt u een Z-stap kleiner dan 275 nm. Er is geen tijdreeks vereist voor de referentieafbeelding.
    3. Vervolgens, om een fluorescentiebeeld van de verwijzing te verwerven, selecteert u het excitatielicht alleen voor DAPI en kiest u ervoor om in blauwe, groene en rode kanalen te verwerven. Verkrijg de referentieafbeelding precies in dezelfde fasepositie en Z-hoogte, in het geval van een 3D-stack.
      OPMERKING: Voor langere emissiegolflengten zijn verhoogde verlichtingsintensiteit en belichtingstijd vereist.
  2. Heldere-veldreferentieafbeeldingen
    1. Plaats het doelmonster dat in stap 1.1 is bereid op een breedveldmicroscoop.
    2. Verwerf een fluorescentiebeeld van het doel in blauwe, groene en rode kanalen.
      OPMERKING: Z stapgrootte voldoet bij voorkeur aan het Nyquist criterium zoals beschreven in stap 2.1.2.
    3. Verkrijg een helder veldbeeld van het doel in blauwe, groene en rode kanalen precies in dezelfde fasepositie als in 2.2.2 en dezelfde Z-hoogte in het geval van een 3D-stack.
  3. Biologische kalibratiereferentiebeelden
    1. Plaats het doelmonster dat in stap 1.1 is bereid op een 3D-SIM microscoop.
    2. Verwerf een fluorescentieafbeelding van het doel in blauwe, groene en rode kanalen door 3D-SIM. Reconstrueren van de super-resolved afbeelding.
      OPMERKING: Het type microscoop kan van elk type zijn, zoals 3D-SIM, confocale, SOA, enz. Z stapgrootte voldoet bij voorkeur aan het Nyquist criterium zoals beschreven in stap 2.1.2.
    3. Verwerf meerdere fluorescentiebeelden van de referentie die in stap 1.2 is opgesteld in verschillende faseposities die vergelijkbaar zijn met de doelafbeelding (stap 2.3.2) door 3D-SIM. Reconstrueren van de super-opgeloste beelden..
      OPMERKING: Het totale aantal pixels in XY moet in alle referentieafbeeldingen gelijk zijn. De stapgrootte in Z moet in alle referentieafbeeldingen hetzelfde zijn. Het totale aantal Z-secties heeft de voorkeur om hetzelfde te zijn als in de doelafbeelding, maar dit is geen absolute vereiste. De XY-positie op het podium voor deze referentiebeelden doet er niet toe omdat de positie of de coverslip al verschilt van de positie van het doelmonster en bovendien het verschil in chromatische verschuiving op een enkele coverslip minder dan 15 nm3is . Beeldvormingsomstandigheden, waaronder objectieve lens, observatietemperatuur, onderdompelingsolie, pinhole size in confocale microscopie, en kantelhoek in zeer hellende verlichting microscopie16, moeten allemaal overeenkomen met de referentie voor de beste prestaties. Als de microscoop meerdere camera's uitrust om meerdere kanalen tegelijk te verwerven, moeten de referentiebeelden zo vaak als wekelijks worden verkregen om de instrumentale drift te corrigeren.

3. Correctie van chromatische verschuiving met chromagnon software

  1. Met behulp van een webbrowser, ga naar https://github.com/macronucleus/Chromagnon/releases,en download de nieuwste binaire release van Chromagnon.
    OPMERKING: Binaire releases zijn beschikbaar voor Windows, Mac en sommige Linux-versies.
  2. Haal het programma eruit en plaats het uitvoerbare bestand op een handige locatie. Dubbelklik op een Windows- of Mac op het bestand om het te openen of voer het binaire bestand uit vanaf de opdrachtregel op een Linux-systeem.
    OPMERKING: De grafische gebruikersinterface zoals in figuur 1 wordt geopend. Het programma kan worden voorkomen dat het wordt geopend door dubbel te klikken voor de eerste keer als gevolg van een reden voor de veiligheid. Gebruik in dit geval de platformafhankelijke methode om het programma te openen dat van het internet is gedownload.

figure-protocol-2
Figuur 1: Een screenshot van chromagnon grafische gebruikersinterface. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

  1. Sleep en drop de referentiebestanden in het vak 'Referentievak'(figuur 1)of klik op Referentiebestanden (figuur 1A) om een dialoogvenster voor bestandskiezer te openen. Afhankelijk van de bestandsindelingen, als het programma vraagt om een Java Development Kit (JDK) te installeren, druk ja en de gebruiker zal worden genavigeerd naar de download pagina. Download en installeer de JDK voor het besturingssysteem zoals geïnstrueerd. Chromagnon moet na het opnieuw opstarten van het programma de afbeeldingsbestandsindeling kunnen lezen.
    LET OP: Chromagnon kan de meeste beeldbestandsformaten lezen (multipage 'tif', 'czi', 'nd2', 'oib', 'lif', 'dv', enz.). De oorspronkelijke afbeeldingsindeling voor de microscoop heeft de voorkeur bij deze stap, omdat metagegevens verloren kunnen gaan wanneer een afbeeldingsindeling wordt geconverteerd naar een tif-bestand met meerdere pagina's. Als de kanaalnaam wordt weergegeven als 0, 1, 2, enz.Figure 2A Chromagnon Zorg er in dit geval voor dat de volgorde van de kanalen en de pixelgrootte in het referentiebestand overeenkomen met die in het doelbestand. Als de volgorde van kanalen in de verwijzing bijvoorbeeld groen en rood is, moet de volgorde van kanalen in het doel ook groen en rood zijn, maar niet rood en groen.

figure-protocol-3
Figuur 2: Voorbeeld screenshot voor het laden van meerdere bestanden. (A) Een geval waarin alle referentiebeelden de bijbehorende doelafbeeldingen hebben. Kanaalnamen worden correct geïdentificeerd door golflengten (aangegeven door een groen vak) in de afbeeldingsbestanden die in dit voorbeeld worden gebruikt. (B) Een geval waarin één referentieafbeelding wordt gebruikt om meerdere doelafbeeldingen te corrigeren. (C) Een geval waarin meerdere referentiebeelden (aangegeven door een rood vak) worden gemiddeld, en de resulterende referentieafbeelding na middeling wordt gebruikt om meerdere doelafbeeldingen te corrigeren. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

  1. Sleep en drop de doelbestanden in het vak Doel (Figuur 1) of klik op Doelbestanden (figuur 1B)om een dialoogvenster voor bestandskiezer te openen.
    OPMERKING: Als er meerdere doelafbeeldingen zijn en elk van deze afbeeldingen overeenkomstige referentieafbeeldingen heeft, moeten de bijbehorende referentieafbeelding en doelafbeelding zich op dezelfde rij bevinden in de respectievelijke referentie- en doelvakken(figuur 2A). Een enkele referentieafbeelding kan ook worden gebruikt om meerdere doelafbeeldingen uit te lijnen(figuur 2B).
  2. Schakel het selectievakje Bijsnijdmarges in als deze niet is aangevinkt(figuur 1C).
    OPMERKING: Als dit selectievakje is ingeschakeld, worden de marges die voortvloeien uit de uitlijning bijgesneden. Controleer deze optie voor algemeen gebruik, maar schakel uit of er een vergelijking op pixelniveau nodig is tussen afbeeldingen voor en na uitlijning.
  3. Kies een uitvoerafbeeldingsindeling in de keuzelijst(figuur 1D).
    LET OP: De beschikbare formaten zijn 'tif' (ImageJ17 formaat), 'dv' en 'ome.tif'; het 'ome.tif'-formaat is alleen beschikbaar na het installeren van JDK.
  4. Geef het achtervoegsel op voor de uitvoerbestandsnaam (Figuur 1E, de standaardwaarde is '_ALN'), die wordt toegevoegd aan de doelbestandsnaam.
  5. Voor crosstalkreferentieafbeeldingen met een hoge signaal-ruisverhouding gebruikt u lokale uitlijning uit de keuzelijst van Lokaal uitlijnen (figuur 1F),kies Projectie om lokale uitlijning te gebruiken en Geen om deze uit te schakelen. Gebruik een minimale venstergrootte van 60(figuur 1G).
    OPMERKING: Bij het gebruik van lokale uitlijning moeten alle doelafbeeldingen overeenkomstige referentieafbeeldingen hebben(figuur 2A). Lokale uitlijning wordt niet aanbevolen voor biologische kalibratiereferentiebeelden, aangezien lokale chromatische verschuivingen van monster tot monster verschillen(tabel 1). Om dezelfde reden kan één lokale uitlijning niet worden toegepast op veel doelafbeeldingen(figuur 2B). Bij wijze van uitzondering kan het worden gebruikt wanneer het monster van belang is alleen aan het oppervlak van de coverslip, en het gezichtsveld is gevuld met heldere objecten, net als de veelkleurige fluorescerende kraal monsters.
  6. Controleer voor meerdere biologische kalibratiereferentieafbeeldingen de optie gemiddelde verwijzingen(figuur 1H) om één uitlijnparameter van de gemiddelde afbeelding te meten en wordt de parameter single alignment toegepast op alle doelafbeeldingen (figuur 2C). Kies Geen voor Lokaal uitlijnen (figuur 1F).
  7. Klik op Alles uitvoeren ( figuur1I) om metingen te starten; de uitlijningsparameters worden toegepast op de doelafbeeldingen.
    OPMERKING: Na het meten van chromatische verschuivingen van de referentiebestanden, maakt het programma bestanden met extensie "chromagnon.csv" of "chromagnon.tif". Het type uitvoerbestand is afhankelijk van de vraag of lokale uitlijning van kracht is (figuur 1F). Als uitlijning wordt uitgevoerd zonder lokale uitlijning, is de uitvoer "chromagnon.csv", terwijl als lokale uitlijning wordt gebruikt, de uitvoer "chromagnon.tif" is. De bestandsnamen zijn hetzelfde als het referentiebestand, met uitzondering van het opgegeven achtervoegsel(figuur 1J, de standaard is zonder achtervoegsel) en de extensie ("chromagnon.csv" of "chromagnon.tif"). Een gedetailleerde beschrijving van het uitlijningsproces is te vinden in het bestand "Chromagnon.log" dat in dezelfde map is gemaakt.
  8. Wacht tot de gecorrigeerde afbeelding in de viewer verschijnt(figuur 3).
    OPMERKING: Als u de afbeelding met de muis sleept, wordt de afbeelding verplaatst en het muiswiel verplaatst, verandert de zoom. Verplaats de schuifregelaar(figuur 3A) om de sectie Z (en/of T indien van toepassing) te wijzigen voor weergave. Als de viewer te traag is om een afbeelding te vernieuwen, klikt u op de knop Hele gegevens laden in het geheugen (figuur 3B) om te voorkomen dat de gegevens op de harde schijf worden geopend. Als u de linker- of rechterrand van kleurvakken(figuur 3C)sleept, u de minimum- of maximumwaarden voor weergave bepalen. Als u op de knop voor elk kanaal(figuur 3D)klikt, schakelt u tussen het weergeven of verbergen van het geselecteerde kanaal in de viewer. Met de rechtermuisknop op het kleurenvak(figuur 3D)kunnen gebruikers de kleuren voor weergave kiezen of de weergaveopties van de kleurenbalk wijzigen, en het stelt gebruikers ook in staat om de exacte minimum- en maximumwaarden voor weergaveschaling op te geven door "schaal naar ..."te kiezen. Als u op de knop Orthogonale weergave (figuur 3E)klikt, worden de afbeeldingen van ZY- en XZ-weergaven weergegeven. Als u de kruislijnen verplaatst, wordt de positie gewijzigd die in de zijweergaven wordt weergegeven.

figure-protocol-4
Figuur 3: Een screenshot van de beeldviewer. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

  1. Als u wilt controleren of de meting correct is uitgevoerd, sleept en zet u de referentieafbeeldingen in het vak 'Referentievak' en 'Doel'. Voer het programma uit en controleer of de afbeeldingen perfect overlappen.
    LET OP: Indien beschikbaar, kunnen "chromagnon.csv" of "chromagnon.tif" bestanden worden gebruikt als referenties om metingen over te slaan. Als de chromatische verschuiving in het beeld ongecorrigeerd blijft, probeert u oplossingen die zijn samengevat in tabel 2.
  2. Open 'chromagnon.csv'-bestanden rechtstreeks met teksteditor of spreadsheetsoftware om toegang te krijgen tot de uitlijnparameters in het voorbeeld of wanneer de uitlijnparameters handmatig moeten worden bewerkt. Wanneer het is bewerkt, slaat u het op als "csv".
    OPMERKING: De waarden zijn in pixels voor "tz", "ty", "tx", en in graden voor "r", en in vergrotingsfactoren voor "mz", "mijn" en "mx".
    1. U ook een bestand chromagnon.csv of chromagnon.tif in het vak Referentie of Doel van Chromagnon(figuur 1)laden en vervolgens dubbelklikken om de uitlijningseditor te openen(figuur 4).
    2. Als u wilt zien hoeveel een kanaal wordt verschoven wanneer de parameters worden bewerkt, sleept en zet u het referentieafbeeldingsbestand op het onderste gebied(figuur 4A) om de afbeelding in de editor te openen. Let bij het bewerken van de waarden in de tabel(figuur 4B)en het raken van de enter/return-toets op hoe de afbeelding van het overeenkomstige kanaal beweegt als de waarden zijn gewijzigd. Klik na het bewerken op opslaan als... (Figuur 4C) om de wijzigingen op te slaan.

figure-protocol-5
Figuur 4: Een schermafbeelding van een uitlijnparametereditor. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

  1. Als u de lokale uitlijnkaart wilt controleren, laadt u de "chromagnon.tif" via het vak Referentie of Doel van Chromagnon(figuur 1)en dubbelklik erop om de uitlijningseditor te openen (figuur 4). Klik op weergave (figuur 4D) om de lokale verschuiving te bekijken die wordt aangegeven door lijnen waarvan de lengtes worden vergroot door de factor die is opgegeven in de lijst met vergrotingskeuze (figuur 4E).
    OPMERKING: Door het 'originele afbeeldingsbestand'(figuur 4F)op te geven, worden de verschuivingen samen met de oorspronkelijke afbeelding in kaart gebracht.

4. Het genereren van een microscoop-specifieke lokale uitlijning kaart

  1. Verdun 2 μL veelkleurige fluorescerende kralen met een diameter van 200 nm in 18 μL ethanol.
  2. Vortex de oplossing en plaats 10 μL van de kraal oplossing in het midden van een glazen bodem schotel. Zorg ervoor dat u #1,5-afdekglas (met een dikte van 0,170 mm) gebruikt voor microscopie met hoge resolutie.
  3. Laat de schotel bij RT 1 uur volledig drogen.
  4. Plaats de schotel op een microscoop te worden gekalibreerd en richten op de fluorescerende kralen.
  5. Verkrijg 2D- of 3D-beelden met de te kalibreren microscopie. Verkrijg meerdere afbeeldingen door de podiumpositie te wijzigen.
  6. Open de grafische gebruikersinterface van Chromagnon.
  7. Sleep en drop de kraalafbeeldingsbestanden in het vak 'Referentievak'(figuur 1)of klik op Referentiebestanden (figuur 1A)om een dialoogvenster voor bestandskiezer te openen.
  8. Controleer de optie gemiddelde referenties (figuur 1H). Kies Projectie uitde keuzelijst Van Lokaal uitlijnen (figuur 1F). Gebruik een minimale venstergrootte van 60(figuur 1G). Klik op Alles uitvoeren ( figuur1I) om metingen te starten.
    OPMERKING: Er wordt een ".chromagnon.tif"-bestand gemaakt, waarin de lokale uitlijningskaart van de microscoop wordt opgeslagen.
  9. Klik na meting op Extra parameters (figuur 1K). Klik in het vak Lokale vervorming van uw microscoopinstrument op de keuzelijst en kies Nieuw... om een dialoogvenster te openen. Sleep en drop het bestand "chromagnon.tif" dat in stap 4.8 is gegenereerd in het vak bestandsnaam of klik op de knop Bestand kiezen om een dialoogvenster voor bestandskiezer te openen. Voer de naam van de microscoop in en klik op OK.
  10. Wanneer u chromatische verschuivingen van kruisspraak of biologische kalibratiereferentieafbeeldingen meet, klikt u op Extra parameters (figuur 1K). Kies uit de lokale vervorming van uw microscoopinstrumentendoos de naam van de microscoop die in stap 4.9 is opgegeven. Klik op OK.
    OPMERKING: De keuze van de "Lokale vervorming van uw microscoopinstrument" wordt niet opgeslagen nadat het programma is uitgeschakeld.
  11. Ga over tot chromatische correctie zonder lokale uitlijning zoals in punt 3.
    LET OP: Het is ook mogelijk om lokale uitlijning te gebruiken in aanvulling op microscoop kalibratie. In dit geval begint lokale uitlijning met microscoopkalibratie.

Resultaten

Een voorbeeld van chromatische verschuivingscorrectie met behulp van een kruistalkreferentieafbeelding wordt weergegeven in figuur 5. Het beeld werd verkregen met een breedveldmicroscoop uitgerust met een enkele camera. Fluorescentie-emissie van DAPI werd gebruikt als referentie (Figuur 5A,B) om de blauwe, groene en rode kanalen te corrigeren. Het beeld bestaat uit 3 kanalen van 60 Z segmenten, elk samengesteld uit 256 x 256 pixels. De beelden werden gedeconvolveerd alvorens de chromatische verschuivingen te meten. Het meten van de lokale chromatische verschuivingen met Chromagnon nam 51 s op een Mac met Intel Core i7 (quad core, 8-threads, 2,7 GHz), 16 GB RAM en 1 TB flashopslag. De uitlijnparameter is toegepast op de doelafbeelding(figuur 5C,D),die exact hetzelfde aantal voxels heeft als de referentieafbeelding. Het voorbereiden van het uitgelijnde bestand duurde 3 s. Als gevolg van het bijsnijden van de randpixels tijdens het uitlijningsproces(selectievakje tussen de marges bijsnijden in figuur 1C),werd het aantal voxels verminderd na uitlijning(figuur 5B, 51 Z-segmenten, 252 x 251 pixels). DNA in de anafasebrug (aangegeven door pijlpunten) wordt verkeerd buiten de nucleaire envelop voor uitlijning(Figuur 5C, duidelijk in het onderste paneel met de XZ-weergave), maar zoals verwacht in de envelop na uitlijning(figuur 5D).

Een voorbeeld van chromatische verschuivingscorrectie met behulp van een biologische kalibratiereferentieafbeelding wordt weergegeven in figuur 6. De beelden werden verkregen met een SIM-microscoop uitgerust met drie camera's. Drie beelden van HeLa cellen bevlekt met phalloidins geconjugeerd aan blauw, groen, en rode kleurstoffen werden gemiddeld (Figuur 6A). De referentieafbeelding bestaat uit 3 kanalen van 76 Z-segmenten, elk samengesteld uit 1.024 x 1.024 pixels. Het meten van chromatische verschuivingen met Chromagnon zonder lokale uitlijning vereist 194 s op het Mac-systeem hierboven beschreven. De parameter werd toegepast op een doelafbeelding bestaande uit 3 kanalen van 73 Z-segmenten, elk samengesteld uit 1.024 x 1.024 pixels. Generatie van het uitgelijnde bestand duurde 25 s. De XZ-weergave toont onjuiste kanaalposities langs de Z en iets langs de X-richtingen(figuur 6A,C), maar deze verkeerde registratie werd gecorrigeerd na uitlijning(figuur 6B,D).

figure-results-1
Figuur 5: Een voorbeeld van uitlijning met een kruistalkreferentieafbeelding. HeLa cellen werden bevlekt met DAPI voor DNA (weergegeven in magenta), Alexa Fluor 488 (weergegeven in geel) voor nucleaire envelop, en Alexa Fluor 555 (weergegeven in blauw) voor microtubuli. Beelden werden verkregen door 3D wide-field microscopie met een enkele camera en gedeconvolved. (A,B) Een representatieve crosstalk referentieafbeelding met DAPI-emissie, voor en na uitlijning door Chromagnon. Drie kleurkanalen worden weergegeven als bedekt. (C,D) Een optisch gedeelte van de 3D-stack in drie kanalen voor en na uitlijning. Axiale chromatische aberratie is duidelijk bij de anaphasebrug die door pijlpunten wordt getoond. Schaalbalk in paneel A geeft 5 μm aan voor alle panelen. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

figure-results-2
Figuur 6: Een voorbeeld van uitlijning met een biologische kalibratiereferentieafbeelding Beelden werden verkregen met 3D-SIM uitgerust met drie camera's. (A,B) Een referentieafbeelding gemiddeld van drie beelden voor (A) en na (B) uitlijning. HeLa cellen werden bevlekt met phalloidin geconjugeerd met Alexa Fluor 405, 488 of 594. (C,D) De doelafbeelding voor (C) en na (D)uitlijning. HeLa cellen werden bevlekt met DAPI voor DNA (weergegeven in magenta), Alexa Fluor 488 (weergegeven in geel) voor nucleaire envelop, en Alexa Fluor 594 (weergegeven in blauw) voor microtubuli. Schaalbalk in paneel A geeft 5 μm aan voor alle panelen. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Discussie

De procedure voor chromatische correctie is een afweging tussen nauwkeurigheid en inspanning. Om onnodige inspanningen te besparen, is het beter om te weten hoeveel nauwkeurigheid nodig is voor uw studie. De hoogste nauwkeurigheid is mogelijk niet vereist voor conventionele beeldvorming op het brede veld (live), en dus zijn heldere veldreferentiebeelden vaak voldoende om de chromatische verschuiving te corrigeren. Op dezelfde manier, wanneer de beeldvormingstoestand en de omgeving constant zijn, zal herhaald gebruik van een biologische kalibratie tijd besparen. Aan de andere kant, als een zeer nauwkeurige registratie gewenst is, zijn hoogwaardige crosstalk- of biologische kalibratiereferentiebeelden noodzakelijk. Voor de beste prestaties moeten referentiebeelden worden verkregen met vergelijkbare omstandigheden en timings als de doelafbeeldingen mogelijk. Zolang zowel referentie- als doelafbeeldingen door dezelfde microscopie worden verkregen, zal een hogere ruimtelijke resolutie de correctienauwkeurigheid verbeteren. Als deconvolution beschikbaar is voor zowel referentie- als doelafbeeldingen, kan het implementeren van deze vóór correctie de correctiennauwkeurigheid verbeteren. Ook voor de beste prestaties moet de bemonsteringsstelling voor de optische (Z)-as worden vervuld in zowel het referentie- als het doelbestand voor nauwkeurige subpixelinterpolatie (protocolstap 2.1.3).

Het niet corrigeren van chromatische verschuiving leidt tot onjuiste conclusies. Bovendien kan het gebruik van de verkeerde kalibratie zelfs de chromatische verschuivingen verergeren in plaats van ze te corrigeren, en dit moet daarom worden vermeden. We hebben de mogelijke oorzaken van mislukkingen en hun gemeenschappelijke oplossingen samengevat in tabel 2. Om de oorzaak van een fout te onderzoeken, is het in de eerste plaats noodzakelijk om visueel te controleren of de chromatische verschuiving in het referentiebeeld precies is gecorrigeerd (protocolstap 3.12). De meeste storingen zijn te wijten aan de kwaliteit van de referentieafbeeldingen en zijn gemakkelijk te verhelpen volgens de beschrijvingen in tabel 2. Wat de kwaliteit van referentiebeelden betreft, is het belangrijk op te merken dat de nauwkeurigheid van de globale uitlijning afneemt als het hele gezichtsveld niet is gevuld met het voorbeeld(figuur 7, tabel 2). Vergeleken met het goede voorbeeld in figuur 7Abevat het slechte voorbeeld in figuur 7B slechts drie nucleaire enveloppen in de linkerbovenhoek en is Chromagnon er niet in geslaagd een deel van dit beeld uit te lijnen. Dit komt omdat de globale uitlijningsmethode van Chromagnon het gezichtsveld splitst in vier regio's(figuur 7C) om de verschillen in rotatie en vergroting met hoge nauwkeurigheid te meten3. Deze methode, indien correct bediend, is een volgorde nauwkeuriger dan andere lineaire methoden, zoals de log polaire transformatie en simplex methoden3. Als een van de vier regio's niet beschikbaar is, schakelt Chromagnon over op minder effectieve lineaire methoden. Daarom zijn de voorbeelden in figuur 7B en figuur 7C voor de beste prestaties ongewenst en moeten de vier regio's worden gevuld met objecten. Gebruikers kunnen controleren of een kwadrataire regio van het gezichtsveld niet beschikbaar is voor metingen door het logboekbestand te bekijken ("Chromagnon.log"; zie protocolstap 3.10). Gelukkig kan dit probleem gemakkelijk worden opgelost door het gemiddelde van meerdere biologische kalibratiebeelden of het gebruik van lokale uitlijning voor crosstalk- of heldere-veldreferentiebeelden(tabel 2). In tegenstelling tot het geval van het niet corrigeren van referentiebeelden, is het moeilijker om doelbeelden te corrigeren. Omdat dergelijke fouten ontstaan als gevolg van verschillen in bestandsformaten, beeldvormingsomstandigheden, beeldtijds, beeldvorming/uitlijningsmethoden tussen de referentie- en doelafbeeldingen(tabel 2),moeten gebruikers altijd voorzichtig zijn bij het gebruik van referentieafbeeldingen die in verschillende omstandigheden/timings van de doelafbeeldingen worden verkregen. Enkele voorbeeldafbeeldingen zijn beschikbaar voor het testen(https://github.com/macronucleus/Chromagnon)om een concreet idee te krijgen van de goede en slechte voorbeeldafbeeldingen.

ProbleemOorzaakOplossing
Kan de referentieafbeelding niet corrigerenLaag contrastVerkrijg indien mogelijk een afbeelding met een hoger contrast. Als een referentieafbeelding met helder veld wordt gebruikt, moet u de afbeelding opnieuw in een oplossing op waterbasis gebruiken om een hoger contrast van de cel te verkrijgen. U ook proberen computationele ruisonderdrukking toe te passen (bijvoorbeeld Gaussian-filtering). Schakel de lokale uitlijning uit, die gevoeliger is voor ruis.
Verontreiniging van niet-gerelateerde beeldenVerwijder indien mogelijk de bron van de niet-gerelateerde afbeeldingen in het voorbeeld. Voor crosstalk referentiebeelden, controleer de excitatie spectra van de kleurstoffen die worden gebruikt voor de doelafbeeldingen. Als de kleurstoffen zijn opgewonden tijdens de verwerving van een crosstalk beeld (bijvoorbeeld Alexa Fluor 568 of 594), overweeg dan andere kleurstoffen (bijvoorbeeld Alexa Fluor 555). Als stof op de camerachip een duidelijk kanaalverschil creëert, reinigt u de camerachip of gebruikt u een computationele flat-fieldingmethode.
Een uiterst lichtpuntje gemaakt door een kosmische straalVerwerf de afbeelding indien mogelijk opnieuw. U ook proberen computationele ruisonderdrukking toe te passen (bijvoorbeeld Median of Gaussian filtering).
Deconvolution artefacten (kunstmatige signalen aan de axiale en laterale randen)Knip de randpixels of Z-secties na deconvolutie bij. Als de ene kant is bijgesneden, moet de andere kant ook worden bijgesneden om het afbeeldingscentrum te behouden.
De Z stap grootte te schaarsEen Z-stack moet worden verworven om te voldoen aan het Nyquist-criterium zoals geschreven in protocol 2.1.3.
Optische aberratieSferische aberratie is de belangrijkste aberratie veroorzaakt door gebruikers. Kies de juiste objectieve lens voor het monster en gebruik een coverslip dikte van 170 μm. Als de objectieve lens is uitgerust met een correctiering, pas deze aan om de positie te vinden waar het hoogste fluorescentiegetal wordt verkregen uit de focus. In het geval van een olie-onderdompeling doelstelling zonder een correctie ring, pas de brekingsindex van de onderdompeling olie die de fluorescentie tellen verhoogt op de focus.
Gezichtsveld is niet gevuld (fig. 7)In het geval van biologische kalibratie referentiebeelden, gemiddeld veel beelden. Gebruik in het geval van crosstalk- of heldere referentieafbeeldingen lokale uitlijning.
Een niet-geïdentificeerde softwarebugMeld het probleem via GitHub(https://github.com/macronucleus/Chromagnon/issues)
Kan de doelafbeelding niet worden gecorrigeerdMetagegevens van het afbeeldingsbestand gaan verlorenGebruik de oorspronkelijke microscoopbestandsindeling die volledige metagegevens bevat en vermijd het converteren naar een tiff-bestand met meerdere pagina's voordat u wordt verwerkt. Gebruik dezelfde volgorde van kanalen als geschreven in protocol 3.3.
Verkeerde uitlijningsmethoden voor de gegeven microscopiePas de lokale uitlijnmethode niet toe bij het meten van biologische kalibratiereferenties op doelafbeeldingen. Gebruik geen kruistalkreferentieafbeeldingen, met uitzondering van microscopie met groot veld.
Verschillen in beeldvormingsvoorwaardenHoud de beeldomstandigheden constant tussen de referentie en de doelafbeeldingen zoals geschreven in protocol 2.3.3.
Verschillen in monster (inclusief coverslip)Gebruik altijd hetzelfde montagemedium, coverslip (bijv. nr. 1,5H) en een vergelijkbare scherptediepte.
Microscoop drift sinds de kalibratie voor het laatst werd gemaaktMaak een kalibratie zo vaak als om de twee weken. Houd de temperatuur constant en gebruik een zwevende tafel om hardwaredrift van de microscoop te voorkomen.

Tabel 2: Probleemoplossing voor chromatische correctie.

figure-discussion-1
Figuur 7: Voorbeelden van referentieafbeeldingen. Nucleaire envelop in splijting gistcellen gelabeld met GFP en mCherry. Beelden werden verworven met conventionele wide-field microscopie. Chromatische verschuivingen werden gecorrigeerd met chromagnon zonder lokale uitlijning met behulp van de beelden zelf als referentiebeelden. Beelden werden vervolgens gedeconvolveerd om de details te tonen. (A) Een goed voorbeeld met veel objecten in het gezichtsveld. (B) Een slecht voorbeeld met objecten alleen in de linkerbovenhoek. Verkeerde uitlijning is duidelijk op een bepaalde regio van het beeld. (C) Een ongewenst voorbeeld waarbij een van de verviervoudiging (gescheiden door stippellijnen) leeg is. Schaalbalk in paneel A geeft 5 μm aan voor de volledige veldweergave en 1,25 μm voor de vergrote weergave en is van toepassing op alle panelen. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

In dit protocol beschreven we drie verschillende referentietypen(tabel 1). Onder hen, crosstalk referentiebeelden en biologische kalibratie referentiebeelden moeten verdere zorgvuldige discussie. Voor crosstalk referentiebeelden kunnen monsters met DAPI of Hoechst 33342 en gemonteerd in glycerol of commerciële montagemedia efficiënt worden gebruikt om de blauwe, groene en rode kanalen uit te lijnen. Alexa Fluor 488 kan ook worden gebruikt om de groene en rode kanalen uit te lijnen. Echter, het verkrijgen van crosstalk fluorescentie is vaak moeilijk, omdat veel blauwe kleurstoffen, behalve DAPI en Hoechst zijn dimmer en verval sneller dan de meeste groene en rode kleurstoffen. Bovendien zijn de emissiespectra van moderne kleurstoffen smaller, wat de uitlijning van meer dan drie kanalen door deze methode uitdagend maakt. Aandacht moet ook worden besteed aan een aantal gemeenschappelijke rode kleurstoffen (bijvoorbeeld Alexa Flour 568 en 594, maar niet Alexa Fluor 555) die kunnen worden opgewekt door violet licht, die voorkomen dat het verkrijgen van hoog contrast crosstalk beelden van blauwe kleurstoffen. Een ander nadeel is dat deze methode de chromatische aberratie van excitatielichtpaden in veelkleurige excitatie niet kan meten, omdat slechts één excitatiegolflengte wordt gebruikt voor excitatie (Tabel 1). Aangezien de meeste geavanceerde microscopie aangepaste verlichtingsoptica gebruikt, is de toepassing van deze methode beperkt. Toch is de hogere correctienauwkeurigheid voldoende voordelig om het in dit protocol te beschrijven. In het algemeen moet een crosstalk-afbeelding worden genomen na een doelafbeelding om bleken of fototoxische effecten te voorkomen. Voor SMLM waargenomen met de breedveldmodus, moet een referentieafbeelding worden verkregen voordat een doelafbeelding wordt verkregen, omdat fluorescentiekleurstoffen kunnen worden gebleekt tijdens het beeldvorming.

Biologische kalibratiereferentiebeelden stellen gebruikers in staat om eenvoudig een gewenst aantal kanalen uit te lijnen ten koste van de extra monstervoorbereiding. Een ander voordeel van biologische kalibratiereferentiebeelden is de beschikbaarheid van "gemiddelde" meerdere verwijzingen die helpt bij het vullen van alle gezichtsvelden. Deze methode kan last hebben van verschillen in beeldvorming als het kalibratiemonster op een andere dia wordt bereid. Het grootste deel van dit probleem kan worden opgelost als zowel de doelstellingen als de referenties op dezelfde dia worden voorbereid met behulp van commerciële chambered coverglasses(tabel 1),en andere beeldvormingsomstandigheden constant worden gehouden zoals in protocolstap 2.3.3. In dit geval kan een correctienauwkeurigheid worden verwacht die vergelijkbaar is met die van kruistalkreferentieafbeeldingen3. Het protocol om phalloidin te gebruiken zoals hier getoond is een van de gemakkelijkste manieren om een enkele cellulaire structuur met meerdere kleuren vlek. Er zijn tal van mogelijke scenario's om biologische kalibratiemonsters voor te bereiden. Voor immunostaining kan een monster worden gelabeld met een enkel primair antilichaam, gevolgd door vlekken met secundaire antilichamen van meerdere kleuren. Op deze manier kan één doelstructuur worden gelabeld met meerdere kleuren. Als alternatief, 5-ethynyl-2'-deoxyuridine, gedetecteerd door "klik" chemie labels nieuw gesynthetiseerd DNA in meerdere kleuren bij hoge dichtheid, zoals beschreven in detail eerder8. Voor levende cellen is het nuttig om een transgene stam te bereiden die twee kopieën van een gen herbergt dat is gesmolten tot GFP of mCherry om dezelfde structuur met twee kleuren te labelen. Als het kopienummer van het gen zo vaak wordt waargenomen voor membraaneiwitten, kan een enkele kopie van het gen samen worden gesmolten tot GFP en mCherry(figuur 7). Fotoconverteerbare fluorescerende eiwitten, zoals mEOS218,kunnen ook worden gebruikt door het verlichten van een matig niveau van violet licht om zowel eiwitsoorten te verkrijgen met of zonder fotoconversie. Onder lage zuurstofomstandigheden kan GFP ook worden gebruikt als fotoconverteerbaar eiwit van groen tot rood19,20. Het kiezen van het juiste kalibratiemonster maakt het experiment robuuster.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

Deze studie werd ondersteund door JSPS KAKENHI Grant Numbers JP19H03202 tot A.M., JP18H05528 en JP17H03636 naar T.H., en JP17H01444 en JP18H05533 tot H.Y. L.S. erkent de steun van de Welcome Trust Strategic Awards 091911 en 107457/Z/15/Z financiering van geavanceerde beeldvorming bij Micron Oxford.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
16% formaldehyde-oplossingPolyscience18814-10
35 mm glasbodemschaalMatTekP35G-1.5-10-C
Alexa Fluor 405 phalloïdineThermo Fisher ScientificA30104
Alexa Fluor 488 phalloïdineThermo Fisher ScientificA12379
Alexa Fluor 594 phalloïdineThermo Fisher ScientificA12381
Rund serumThermo Fisher Scientific16170078
DekglasMatsunamiNo. 1S HT
DAPI (4'6-diamidino-2-fenylindole, dihydrochloride)Thermo Fisher ScientificD1306
Dulbecco's aangepast Eagle Medium met L-Gln en natriumpyruvaatNacalai Tesque08458-16
Montagemedium (VECTASHIELD)Vector LaboratoriesH-1000
Muis anti-tubulin monoklonaal antilichaam (TAT1)Beschreven in Ref 15.
Nunc Lab-Tek II kamerdekglas (8 wel)Thermo Fisher Scientific155409
Konijn anti-emerin polyklonaal antilichaam (ED1)Een geschenk van Hiroshi Yorifuji, Gunma University, Gunma, Japan en Kiichi Arahata, Nationaal Centrum voor Neurologie en Psychiatrie, Tokio, Japan; overleden.
Secundair antilichaam met Alexa Fluor 488Thermo Fisher ScientificA-11034
Secundair antilichaam met Alexa Fluor 555Thermo Fisher ScientificA-21424
Secundair antilichaam met Alexa Fluor 594Thermo Fisher ScientificA-11032
TetraSpeck Microspheres, 0,2 µmThermo Fisher ScientificT7280

Referenties

  1. Schermelleh, L., et al. Super-resolution microscopy demystified. Nature Cell Biology. 21 (1), 72-84 (2019).
  2. Manders, E. M. M. Chromatic shift in multicolour confocal microscopy. Journal of Microscopy. 185 (3), 321-328 (1997).
  3. Matsuda, A., Schermelleh, L., Hirano, Y., Haraguchi, T., Hiraoka, Y. Accurate and fiducial-marker-free correction for three-dimensional chromatic shift in biological fluorescence microscopy. Scientific Reports. 8 (1), 7583(2018).
  4. Grünwald, D., Singer, R. H. In vivo imaging of labelled endogenous β-actin mRNA during nucleocytoplasmic transport. Nature. 467 (7315), 604-607 (2010).
  5. Betzig, E., et al. Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution. Science. 313 (5793), 1642-1645 (2006).
  6. Rust, M. J., Bates, M., Zhuang, X. Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy (STORM). Nature Methods. 3 (10), 793-795 (2006).
  7. Chen, F., Tillberg, P. W., Boyden, E. S. Expansion microscopy. Science. 347 (6221), 543-548 (2015).
  8. Kraus, F., et al. Quantitative 3D structured illumination microscopy of nuclear structures. Nature Protocols. 2, 1011-1028 (2017).
  9. Hell, S. W. Far-Field Optical Nanoscopy. Science. 316 (5828), 1153-1158 (2007).
  10. Gustafsson, M. G. L. Surpassing the lateral resolution limit by a factor of two using structured illumination microscopy. Journal of Microscopy. 198 (2), 82-87 (2000).
  11. Schulz, O., et al. Resolution doubling in fluorescence microscopy with confocal spinning-disk image scanning microscopy. Proceedings of the National Academy of Sciences of United States of America. 110 (52), 21000-21005 (2013).
  12. Müller, C. B., Enderlein, J. Image Scanning Microscopy. Physical Review Letters. 104 (19), 198101(1981).
  13. Hayashi, S., Okada, Y. Ultrafast superresolution fluorescence imaging with spinning disk confocal microscope optics. Molecular Biology of the Cell. 26 (9), 1743-1751 (2015).
  14. Yorifuji, H., et al. Emerin, deficiency of which causes Emery-Dreifuss muscular dystrophy, is localized at the inner nuclear membrane. Neurogenetics. 1 (2), 135-140 (1997).
  15. Woods, A., Sherwin, T., Sasse, R., MacRae, T. H., Baines, A. J., Gull, K. Definition of individual components within the cytoskeleton of Trypanosoma brucei by a library of monoclonal antibodies. Journal of Cell Science. 93 (3), 491-500 (1989).
  16. Tokunaga, M., Imamoto, N., Sakata-Sogawa, K. Highly inclined thin illumination enables clear single-molecule imaging in cells. Nature Methods. 5 (2), 159-161 (2008).
  17. Rueden, C. T., et al. ImageJ2: ImageJ for the next generation of scientific image data. BMC Bioinformatics. 18 (1), 529(2017).
  18. McKinney, S. A., Murphy, C. S., Hazelwood, K. L., Davidson, M. W., Looger, L. L. A bright and photostable photoconvertible fluorescent protein for fusion tags. Nature Methods. 6 (2), 131-133 (2009).
  19. Sawin, K. E., Nurse, P. Photoactivation of green fluorescent protein. Current Biology. 7 (10), 606-607 (1997).
  20. Elowitz, M. B., Surette, M. G., Wolf, P. E., Stock, J., Leibler, S. Photoactivation turns green fluorescent protein red. Current Biology. 7 (10), 809-812 (1997).

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Correctie van chromatische verschuiving3D chromatische verschuivingenChromagnon softwarefluorescentiemicroscopiesuperresolutie beeldvormingpreparatie van biologische monstersacquisitie van referentiebeeldenwidefield microscopie3D SIM microscopieantilichaamkleuringsprotocol

Gerelateerde artikelen