Methodenartikel

Een snelle methode voor multispectrale fluorescentiebeeldvorming van bevroren weefselsecties

DOI:

10.3791/60806

⸱

30 maart 2020

 ,  ,  , 
1Robert Lurie Comprehensive Cancer Center and Department of Dermatology, Feinberg School of Medicine, Northwestern University, 2Department of Pathology, University of Illinois at Chicago, 3Department of Microbiology and Immunology, Feinberg School of Medicine, Northwestern University

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

We beschrijven een snelle kleuringsmethode om multispectrale beeldvorming op bevroren weefsels uit te voeren.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Multispectrale fluorescentiebeeldvorming op formaline-vaste paraffine-embedded (FFPE) weefsels maakt het mogelijk om meerdere markers in één weefselmonster te detecteren die informatie kunnen geven over antigeencoexpressie en ruimtelijke verdeling van de markers. Een gebrek aan geschikte antilichamen voor formaline-vaste weefsels kan echter de aard van de gedetecteerde merkers beperken. Bovendien is de kleurmethode tijdrovend. Hier beschrijven we een snelle methode om multispectrale fluorescentiebeeldvorming uit te voeren op bevroren weefsels. De methode omvat de gebruikte fluorophorecombinaties, gedetailleerde stappen voor het kleuren van muizen- en menselijke bevroren weefsels en de scan-, acquisitie- en analyseprocedures. Voor kleuringsanalyse wordt gebruik gemaakt van een commercieel verkrijgbaar semi-geautomatiseerd multispectral eibeeldbeeldvormingssysteem. Door deze methode werden tot zes verschillende markers gekleurd en gedetecteerd in een enkele bevroren weefsel sectie. De machine learning analyse software kan fenotype cellen die kunnen worden gebruikt voor kwantitatieve analyse. De hier beschreven methode voor bevroren weefsels is nuttig voor de detectie van markers die niet kunnen worden gedetecteerd in FFPE-weefsels of waarvoor antilichamen niet beschikbaar zijn voor FFPE-weefsels.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Recente ontwikkelingen in microscopische beeldvormingstechnieken hebben onze kennis en begrip van biologische processen en ziektetoestanden aanzienlijk verbeterd. In situ detectie van eiwitten in weefsels via chromogene immunohistochemie (IHC) wordt routinematig uitgevoerd in pathologie. Echter, detectie van meerdere markers met behulp van chromogene IHC kleuring is uitdagend1 en nieuwere methoden om multiplex immunofluorescentie (mIF) kleuring benaderingen te gebruiken, waarbij meerdere biologische markers worden gelabeld op een enkel weefsel monster, worden ontwikkeld. De detectie van meerdere biologische markers is nuttig, omdat informatie met betrekking tot weefselarchitectuur, ruimtelijke verdeling van cellen en antigeenco-expressie allemaal worden vastgelegd in één weefselmonster2. Het gebruik van multispectrale fluorescentiebeeldvormingstechnologie heeft detectie van meerdere biologische markers mogelijk gemaakt. In deze technologie kan met behulp van specifieke optiek de fluorescentiespectra van elke afzonderlijke fluorophore worden gescheiden of "ongemengd", waardoor meerdere markers kunnen worden gedetecteerd zonder spectrale kruisspraak3. Multispectrale fluorescentiebeeldvorming wordt een kritische benadering in de celbiologie, preklinische medicijnontwikkeling, klinische pathologie en tumorimmuunprofilering4,5,6. Belangrijk is dat de ruimtelijke verdeling van immuuncellen (met name CD8 T-cellen) kan dienen als een prognostische factor voor patiënten met bestaande tumoren7.

Verschillende benaderingen van multiplex fluorescentie kleuring zijn ontwikkeld en kan gelijktijdig of sequentieel worden uitgevoerd. In de simultaan kleuringmethode worden alle antilichamen als cocktail in één stap bij elkaar opgeteld om het weefsel te labelen. UltraPlex-technologie maakt gebruik van een cocktail van hapten-geconjugeerde primaire antilichamen, gevolgd door een cocktail van fluorophore-geconjugeerde anti-hapten secundaire antilichamen. InSituPlex technologie8 maakt gebruik van een cocktail van unieke DNA-geconjugeerde primaire antilichamen die tegelijkertijd worden toegevoegd aan het weefsel, gevolgd door een versterking stap en ten slotte fluorophore-geconjugeerde sondes die complementair zijn aan elke unieke DNA-sequentie op het primaire antilichaam. Beide technologieën maken de detectie van vier markers plus 4',6-diamino-2-phenylindole (DAPI) voor nucleaire kleuring mogelijk. Twee andere benaderingen voor gelijktijdige multiplex kleuring zijn gebaseerd op secundaire ionenmassaspectrometrie9. Het Hyperion Imaging System maakt gebruik van beeldmassacytometrie10 om tot 37 markers te detecteren. Deze technologie maakt gebruik van een cocktail van met metaal geconjugeerde antilichamen om de weefsels te bevlekken, en specifieke gebieden van de weefsels worden door een laser ontdaan en overgebracht naar een massacytometer waar de metaalionen worden gedetecteerd. Een andere soortgelijke technologie is de IONPath, die multiplexed ionbeam imaging technologiegebruikt 11. Deze technologie maakt gebruik van een gemodificeerde massaspectrometrie instrument en een zuurstof ionen bron in plaats van laser om de metaal-geconjugeerde antilichamen ablate. Hoewel al deze gelijktijdige multiplex vlekken benaderingen de detectie van meerdere markers mogelijk te maken, de kosten die betrokken zijn voor het conjugeren van DNA, haptens, of metalen aan antilichamen, het verlies van weefsel als gevolg van ablatie, en de uitgebreide beeldverwerking voor het niet mengen van de mengmenging kan niet worden onderschat. Bovendien zijn kits en kleuringprotocollen momenteel alleen beschikbaar voor FFPE-weefsels en brengt het ontwikkelen van aangepaste panelen extra tijd en uitgaven met zich mee.

De sequentiële multiplex kleuring methode, in tegenstelling, omvat het etiketteren van het weefsel met een antilichaam aan een marker, strippen om het antilichaam te verwijderen, gevolgd door opeenvolgende herhalingen van dit proces om meerdere markers label12. De tyramide signaalversterking (TSA) is de meest gebruikte sequentiële multiplexing methode. Twee andere multiplexing technologieën maken gebruik van een combinatie van gelijktijdige en sequentiële kleuring methoden. De CODEX platform13 maakt gebruik van een cocktail van antilichamen geconjugeerd om unieke DNA oligonucleotide sequenties die uiteindelijk worden gelabeld met een fluorophore met behulp van een geïndexeerde polymerisatie stap gevolgd door beeldvorming, strippen, en het herhalen van het proces om te detecteren tot 50 markers. De MultiOmyx multiplex kleuring aanpak14 is een iteratie van vlekken met een cocktail van drie tot vier gefluorofe-geconjugeerde antilichamen, beeldvorming, het doven van de fluorophoren, en het herhalen van deze cyclus te detecteren tot 60 markers op een enkele sectie. Vergelijkbaar met de gelijktijdige multiplex kleuring methode, terwijl een breed scala van markers kan worden gedetecteerd, de tijd die betrokken zijn bij kleuring, beeldverwerving, verwerking, en analyse is uitgebreid. De strippen / blussen stap omvat verwarming en / of bleken van het weefsel monster en dus, de sequentiële multiplex kleuring aanpak wordt vaak uitgevoerd op FFPE weefsels die weefsel integriteit te handhaven bij het verwarmen of bleken.

Formaline fixatie en daaropvolgende paraffine inbedding wordt gemakkelijk uitgevoerd in een klinische omgeving, weefselblokken zijn gemakkelijk op te slaan en verschillende multiplex kleuringprotocollen zijn beschikbaar. Echter, de verwerking, inbedding, en deparaffinisatie van FFPE weefsels, evenals antigeen ophalen15, een proces waarbij antilichamen beter toegang epitopes, is tijdrovend. Bovendien draagt de verwerking van FFPE-weefsels bij tot autofluorescentie16 en maskers op epitopen, wat resulteert in de variabiliteit en het gebrek aan antilichaamkloon die beschikbaar is om antigenen in FFPE-weefsels op te sporen17,18,19. Een voorbeeld is de menselijke leukocyteantigeen (HLA) klasse I alleles20. In tegenstelling, snap bevriezing van weefsels omvat geen uitgebreide verwerking stappen voorafgaand aan of na de vaststelling, het omzeilen van de noodzaak voor antigeen terugwinning21,22, en waardoor het gunstig is voor het opsporen van een breder scala van doelen. Daarom kan het gebruik van bevroren weefsels voor multispectrale fluorescentiebeeldvorming waardevol zijn om doelen voor preklinische en klinische studies te detecteren.

Gezien de bovengenoemde beperkingen bij het gebruik van FFPE weefsels, vroegen we of multispectrale fluorescentie beeldvorming kan worden uitgevoerd op bevroren weefsels. Om deze vraag aan te pakken, hebben we een gelijktijdige multiplex kleurmethode getest met behulp van een paneel van gefluorofe-geconjugeerde antilichamen om meerdere antigenen te detecteren en analyseerden we de kleuring met behulp van een semi-geautomatiseerd multispectral imaging systeem. We waren in staat om tegelijkertijd vlek tot zes markers in een enkel weefsel sectie binnen 90 min.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Muismilt en HLF16 muistumorweefsels23 werden verkregen uit ons laboratorium. Menselijk tonsillenweefsel werd gekocht bij een commerciële leverancier. Details zijn opgenomen in de tabel van materialen.

1. Weefselinbedding

  1. Sluit vers weefsel in octop (optimale snijtemperatuur) oplossing en snap bevriezen met behulp van droogijs of vloeibare stikstof.
  2. Bewaar weefsels op -80 °C.

2. Cryosectioning

  1. Snijd 8 μm secties in een cryostat met temperaturen ingesteld op -25 °C.
    LET OP: De gewenste sectiedikte kan worden aangepast om scherpere beelden te genereren.
  2. Plaats secties op geladen glazen platen.
  3. Droog de secties 1 uur lang af bij kamertemperatuur (RT) voordat de histologie koud aceton gedurende 10 minuten wordt vastgesteld.
    LET OP: Aceton veroorzaakt stolling van in water oplosbare eiwitten en extracten lipiden, maar heeft geen invloed op koolhydraathoudende componenten. In tegenstelling, formaline behoudt de meeste lipiden en heeft weinig invloed op koolhydraten24. De keuze van fixatief is belangrijk, afhankelijk van de keuze van de marker wordt gedetecteerd.
  4. Bewaar de dia's op -20 °C.

3. Selectie van antilichamen en fluorophoren

LET OP: Vóór weefselkleuring moeten antilichaamklonen die hun antigenen van belang binnen opeenvolgende secties van acetonvast weefsel robuust en specifiek bevlekken, worden gevalideerd. Sommige antilichamen kunnen een andere fixatieve vereisen, en hun verenigbaarheid met andere antilichamen in het paneel zal ook empirisch moeten worden bepaald. Het doel is ook om fluorophoren te identificeren met minimale overlap die kan worden gedetecteerd met de epifluorescentiefilters voor DAPI, FITC, Cy3, Texas Red en Cy5.

  1. Bevestig vlekken door conventionele IHC- of immunofluorescentiedetectie (IF) in weefselsecties met bekend expressiedoelantigeen.
  2. Met behulp van de excitatie- en emissiefiltersets die beschikbaar zijn op het semigeautomatiseerde beeldvormingssysteem en na het testen van verschillende combinaties van gefluorofe-geconjugeerde primaire antilichamen, bereid fluorophoren voor om te worden gebruikt die minimale spectrale overlap hebben (bijvoorbeeld tabel 1).

4. Kleuring

LET OP: Het weefsel rehydratatie en dia wasbeurten werden uitgevoerd in een Coplin pot. De blokkerende en antilichaam incubatiestappen werden uitgevoerd in een bevochtigde diadoos.

  1. Laat de glijbanen 5-10 min opwarmen tot RT.
  2. Rehydrateren in fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) gedurende 5 min.
  3. Voer een blokkerende stap uit voordat weefsels met antilichamen worden bevlekt. Gebruik voor muissecties gespecialiseerde blokkeringsoplossing (zie Materiaaltafel)gedurende 10 min bij RT. Gebruik voor menselijke secties 10% normaal gepoold menselijk serum (NHS) verdund in PBS gedurende 15 min bij RT.
    LET OP: Verschillende blokkeringsbuffers kunnen zo nodig worden getest om de specifieke eigenschappen van de secties te behouden, afhankelijk van de te gebruiken follow-upprocedures.
  4. Was de dia's gedurende 5 min in PBS na het blokkeren.
  5. Voor multiplex kleuring, bereiden een cocktail van antilichamen met compatibele fluorofofen bij vooraf bepaalde optimale verdunningen.
  6. Voeg de cocktail van fluorophore-geconjugeerde antilichamen toe aan de glijbanen. Voor kleuring met één markering voegt u alleen het primaire geconjugeerde antilichaam toe aan de dia.
  7. Neem een controle onbevlekte dia die dezelfde kleuring procedure ondergaat zonder de toevoeging van een primaire-geconjugeerde antilichaam.
  8. Incubeer de dia's voor 1 uur bij RT in het donker en was vervolgens de dia's 2x met PBS voor 5 min per stuk. Vanaf nu wordt de resulterende dia aangeduid als multiplex-gekleurd.
  9. Om tegenvlekken tegen te gaan, voegt u DAPI toe aan de multiplex-gekleurde dia, incubeert gedurende 7 min in het donker bij RT en was de dia's 2x met PBS voor 5 min per stuk. Niet tegenvlek single-gekleurde en onbevlekte dia's.
  10. Om uit te glijden, voeg een druppel van de montage medium, en voorzichtig plaats het glas coverslip over het weefsel.

5. Voorbereiding van een spectrale bibliotheek

  1. Beeldacquisitie
    1. Stel het lampvermogen in op 100%. Meestal is het vermogen ingesteld op 10%, omdat fluorescentiedetectie op FFPE-weefsels een signaalversterkingsstap bevat.
    2. Begin met het openen van de microscoop werkende software (zie Tabel van materialen).
    3. Selecteer Protocol bewerken en vervolgens Nieuw protocol.
    4. Geef een "Protocolnaam" op en selecteer Fluorescentie onder de imagingmodusen geef een "studienaam" op.
    5. Plaats de enkelbevlekte dia's op het podium en bestudeer elke markering in het bijbehorende fluorescentiekanaal om vlekken te garanderen. Kies een gebied op het weefsel dat het sterkste signaal voor de marker uitdrukt.
    6. Pas de belichtingstijden aan met de opties Autofocus en Autoexpose.
    7. Verwerf momentopnamen voor de dia's met één gekleurd e-bevlekte en niet-bevlekte dia's en sla het protocol op.
      LET OP: De volgende stappen worden uitgevoerd in machine learning software (zie Tabel van materialen),met behulp van de enkele gekleurde en niet-bevlekte dia's om specifieke vlekken te verifiëren en om antilichaam cross talk te bepalen.
    8. Laad onder het tabblad Bibliotheken bouwen in de software elke diaafbeelding met één gekleurde afbeelding, kies de juiste Fluor en klik op Uitpakken. De software haalt automatisch het in de Fluor gekozen fluorescentiesignaal eruit.
    9. Als u de uitgepakte kleur wilt opslaan, klikt u op Opslaan in opslag. Er kan een 'Nieuwe groep' worden gemaakt of de geëxtraheerde kleur kan worden opgeslagen in een bestaande groep.
  2. De spectrale bibliotheek verifiëren
    1. Controleer het emissiespectrale curvevenster, rechts van de geëxtraheerde afbeelding, voor elke filterset.
      LET OP: Het geëxtraheerde signaal is correct als de spectrale curve alleen wordt waargenomen in de filtersets waar de fluoropforen wordt gedetecteerd. Als een spectrale curve wordt waargenomen in de verkeerde filterset, kan dit betekenen dat ofwel het primaire signaal dat in de filterset wordt verwacht niet sterk genoeg is, of dat de software een ander signaal detecteert dat te hoog is, mogelijk als gevolg van spectrale overlap. Probeer in dit geval eerst met het gereedschap Verwerkingsregio's tekenen gebieden te tekenen rond gebieden die de fluorescerende markering en autofluorescentie in de afbeelding uitdrukken. Dit traint de software om het ware signaal te detecteren en storende signalen te verwijderen. Als dit niet werkt, herhaal titratieproces voor de single-gekleurde dia om verschillende antilichaamtitraties te testen.

6. Multispectrale beeldvorming

LET OP: Zodra de spectrale bibliotheek is gemaakt en geverifieerd, voert u de volgende stappen uit voor de met multiplex bevlekte dia.

  1. Hele diascan
    1. Pas de scherpstellings- en belichtingstijden aan op de multiplex-gekleurde dia zoals vermeld in punt 5.1.
    2. Maak onder Dia's scanneneen nieuwe taak en kies het hierboven opgeslagen protocol.
    3. Voer een hele diascan uit op de met multiplex bevlekte dia.
    4. Open de hele diascansoftware met behulp van de hele diascanafbeelding. Dit beeld is niet spectrally ongemengd geweest.
    5. Selecteer interessegebieden (ROI) in de hele diascanafbeelding met het gereedschap Stempel of ROI. Deze ROI's worden gescand met behulp van de in punt 6.1.1 ingestelde blootstellingstijden die moeten worden gebruikt voor spectrale ontmening en analyse.
    6. Klik op Procesdia om ROI's te verwerven bij 20x vergroting
  2. Spectrale unmixing
    1. Zodra de ROI's zijn verworven, in de machine learning-software, onder het tabblad Handmatige analyse, laad de multiplex gekleurde beelden door te klikken op Openen onder Bestand.
    2. Klik in de vervolgkeuzelijst Spectrale bibliotheekbron op Fluor selecteren.
    3. Er gaat een nieuw venster open. Kies hier de spectrale bibliotheek of groep die hierboven is gemaakt.
    4. Laad de niet-bevlekte diaafbeelding. Klik AF op het AF-inktmarkeringspictogram boven de geselecteerde spectrale bibliotheek en teken een lijn of gebied op de niet-bevlekte dia om autofluorescentie in het weefsel te identificeren.
    5. Wijs onder het tabblad Markeringen en kleuren bewerken namen toe voor elke markering. Pseudokleuren kunnen bij deze stap worden toegewezen.
      LET OP: De kleur voor de afbeelding Autofluorescentie standaard wordt ingesteld op DarkSlateGray. Verander dit in Zwart.
    6. Klik op Alles voorbereiden.
  3. Spectrally ongemengde afbeeldingen verifiëren
    OPMERKING:     Wanneer de spectrale ontmeningsstap is voltooid, wordt een samengestelde afbeelding gemaakt die bestaat uit alle kleuren.
    1. Klik op het oogpictogram Weergeven. Hier kan elke kleur in de "Component Display" worden uitgeschakeld of ingeschakeld om de kleuring van elke afzonderlijke markering te bekijken.
    2. Inspecteer visueel de kleuring en de morfologie van de cellen om ervoor te zorgen dat er geen overlapping van marker is, tenzij het biologisch relevant is. Een patholoog kan helpen bij het verifiëren van de kleuring ook.
      LET OP: De kleuring op de multiplexed slide moet worden gevalideerd door het weglaten van een fluoropfore op een moment en herziening van de kleuring patroon. Bovendien zal de validatie ook helpen bij het identificeren van sterke fluorophoren die verschijnen in aangrenzende spectra als gevolg van antilichaam kruispraat of bleed-through.
    3. Klik voor pathologieweergaven, die brightfield-afbeeldingen simuleren voor elke fluorescerende markering, op de knop Een componentafbeelding selecteren. Kies hier een markering om een gesimuleerde brightfieldafbeelding weer te geven.

7. Multispectrale beelden analyseren via celsegmentatie en fenotypering

LET OP: Na het verifiëren van het spectrale ongemengde beeld kan celsegmentatie worden uitgevoerd met behulp van de machine learning-software, die stapsgewijze instructies zal geven. Weefselsegmentatie werd hier niet uitgevoerd. Als het paneel een of meer weefselspecifieke marker bevat en vooral als het weefsel rommelig is, moet weefselsegmentatie worden uitgevoerd.

  1. Selecteer "Cytoplasma" en "Membraan" onder de optie 'Segment'.
    LET OP: "Kernen" is standaard gekozen.
  2. Selecteer een markering in het deelvenster. Configureer de markering om kernen, cytoplasma of membraan te detecteren. DAPI kan bijvoorbeeld worden geselecteerd om kernen en CD3 voor membraan te detecteren.
  3. Klik op de ellipsknop ('...') om een optie te selecteren onder "gebruik dit signaal om te zoeken". Bijvoorbeeld 'kernen' voor DAPI. Meerdere markeringen uit het deelvenster kunnen worden geselecteerd voor segmentatie.
    LET OP: Voor cytoplasmaof membraanmarkers selecteert u de optie "Gebruik dit signaal om te helpen bij nucleaire segmentatie".
  4. De software detecteert en creëert automatisch een masker voor de kern, cytoplasma en membraan in het beeld.
  5. Zorg ervoor dat alle cellen zijn 'gemaskeerd' voor segmentatie. Als u wilt aanpassen, schakelt u over naar de pathologieweergave voor de specifieke markering die in punt 7.3 isgekozen. en gebruik de configuratie-opties in de software.
  6. Klikop " Segment All" om cellen te segmenteren.
  7. Ga na celsegmentatie verder met fenotyperingscellen. Kies in deze stap de markeringen die nodig zijn voor fenotypering en selecteer handmatig ten minste vijf cellen die helder zijn gekleurd met de gekozen markering. Dit traint de software om vervolgens automatisch alle cellen te detecteren die zijn gekleurd met de gekozen markering in de afbeelding.
  8. Er wordt een fenotypekaart gemaakt. Analyseren om ervoor te zorgen dat de cel bevlekt met de marker correct fenotyped is.
    LET OP: Celfenotypering kan een iteratief proces zijn. Als de software niet in staat is om de cellen correct te fenotype, betekent dit dat de training ontoereikend of onjuist is. In dit geval moet de gebruiker handmatig meer cellen selecteren en de software omscholen en deze stap herhalen totdat de gebruiker tevreden is met de training.
  9. Maak een groep met de naam 'Anderen' en voeg cellen toe die niet gekleurd zijn voor een van de markeringen.
    LET OP: Deze stap is belangrijk om de software te trainen om alle niet-gekleurde cellen uit te sluiten van fenotypering.

8. Afbeeldingen en analysetabellen exporteren

  1. Klik op de knop Exporteren om het deelvenster Exportinstellingen weer te geven.
  2. Klik in de map Exporteren op Bladeren om een locatie te selecteren om de afbeeldingen te exporteren.
  3. Kies in de opties voor afbeeldingsexport de indeling Afbeeldingsuitvoer.
  4. Selecteer in de lijst 'Afbeeldingen exporteren' de afbeeldingen die moeten worden geëxporteerd. "Composite image" is het uiteindelijke pseudogekleurde ongemengde beeld. "Pathologieweergaven" zijn de individuele gesimuleerde brightfield-beelden en de "Component Images (multi-image TIFF)" is een TIFF-bestand met meerdere afbeeldingen met componentgegevens dat kan worden gebruikt door analysesoftware van derden.
  5. Klikop deknop Exporteren voor iedereen om de afbeeldingen te exporteren.
    LET OP: Tabellen uit analyse kunnen ook worden geselecteerd en geëxporteerd bij deze stap.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Detectie van enkelbevlekte markeringen op bevroren miltsecties
Aangezien het semi-geautomatiseerde beeldvormingssysteem gebruik maakt van een vloeistofkristaltable filter (LCTF) systeem dat een breder bereik van golflengtedetectie25mogelijk maakt , en omdat hier geen signaalversterkingsstappen zijn uitgevoerd, hebben we eerst de detectie geoptimaliseerd van onze primaire geconjugeerde antilichamen voor elke marker op de microscoop. Een voorbeeld wordt weergegeven in

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bevroren weefsels zijn op grote schaal gebruikt voor mIF-beeldvorming om traditioneel drie tot vier markers31 op een weefsel te detecteren met behulp van de directe en indirecte methode32. In de directe methode worden antilichamen geconjugeerd tot fluorescerende kleurstoffen of quantumdots33 om het weefsel te labelen, terwijl in de indirecte methode een niet-geconjugeerd primair antilichaam wordt gebruikt om het weefsel te labelen, gevolgd door een d...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs hebben geen belangenconflicten te onthullen.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Imaging en analyse begeleiding werd verstrekt door het Research Resources Center - Research Histology and Tissue Imaging Core aan de Universiteit van Illinois in Chicago opgericht met de steun van het kantoor van de vice-kanselier voor onderzoek. Het werk werd ondersteund door NIH/NCI RO1CA191317 aan CLP, door NIH/NIAMS (SBDRC grant 1P30AR075049-01) aan Dr. A. Paller, en door ondersteuning van het Robert H. Lurie Comprehensive Cancer Center aan de Immunotherapy Assessment Core aan de Northwestern University.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Acetone (histologische kwaliteit)Fisher ScientificA16F-1GALFixeren van weefsels
Alexa Fluor 488 anti-muis CD3BioLegend100212Clone - 17A2; primaire geconjugeerde antilichaam
Alexa Fluor 488, eBioscience anti-menselijk CD20ThermoFisher Scientific53-0202-82Clone - L26; primaire geconjugeerde antilichaam
Alexa Fluor 555 Muis anti-Ki-67BD Biosciences558617Primaire geconjugeerde antilichaam
Alexa Fluor 594 anti-menselijk CD3BioLegend300446Clone - UCHT1; primaire geconjugeerde antilichaam
Alexa Fluor 594 anti-muis CD8aBioLegend100758Clone - 53-6.7; primaire geconjugeerde antilichaam
Alexa Fluor 647 anti-menselijk CD8aBioLegend372906Clone - C8/144B; primaire geconjugeerde antilichaam
Alexa Fluor 647 anti-muis CD206 (MMR)BioLegend141711Clone - C068C2; primaire geconjugeerde antilichaam
Alexa Fluor 647 anti-muis CD4 AntilichaamBioLegend100426Clone - GK1.5; primaire geconjugeerde antilichaam
C57BL/6 MuisCharles River Laboratories27Ingevrozen muisweefsels gebruikt voor multispectrale training
Coplin PotSigma AldrichS6016-6EARehydrateren en wassen van slides
DAPI OplossingBD Biosciences564907Nucleïnezuurkleuring
Diamond White Glass Charged SlidesDOT ScientificDW7590WAanbrengen van weefselsecties
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline 1x (zonder Ca en Mg)Fisher ScientificMT21031CVWassen en verdunning
Gold Seal DekglasjesThermoFisher Scientific3306Beschermen van gekleurd weefsel
Menselijk Normaal Tonsil OCT ingevroren weefselblokAMSBioAMS6023Menselijk ingevroren weefsel gebruikt voor multispectrale kleuring
Menselijk Serum 1xGemini Bio-Products100-512Blokking en verdunning voor menselijk weefsel
inFormAkoya BiosciencesVersie 2.4.1Machine learning software
PerCP/Cyanine5.5 anti-menselijk CD4BioLegend300529Clone - RPA-T4; primaire geconjugeerde antilichaam
PerCP-Cy 5.5 Rat Anti-CD11bBD Biosciences550993Clone - M1/70; primaire geconjugeerde antilichaam
PhenochartAkoya BiosciencesVersie 1.0.8Whole slide scan software
ProLong Diamond Antifade MountantThermoFisher ScientificP36965Montagemedium
Research CryostatLeica BiosystemsCM3050 SSeceren van weefsels
Superblock 1xThermoFisher Scientific37515Blokking van muisweefsels
Tissue-Tek O.C.T OplossingSakura Finetek4583Inbedding van weefsels
Vectra 3.0 Automatisch Kwantitatief Pathologie Beeldvormingssysteem, 6 SlideAkoya BiosciencesCLS142568Semi-automatisch multispectral beeldvormingssysteem
Vectra SoftwareAkoya BiosciencesVersie 3.0.5Software om microscoop te bedienen

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. van der Loos, C. M. Chromogens in Multiple Immunohistochemical Staining Used for Visual Assessment and Spectral Imaging: The Colorful Future. Journal of Histotechnology. 33 (1), 31-40 (2010).
  2. Stack, E. C., Wang, C., Roman, K. A., Hoyt, C. C. Multiplexed immunohistochemistry, imaging, and quantitation: A review, with an assessment of Tyramide signal amplification, multispectral imaging and multiplex analysis. Methods. 70 (1), 46-58 (2014).
  3. Bian, L., et al. Multispectral imaging using a single bucket detector. Scientific Reports. 6, 24752(2016).
  4. Zhou, L., El-Deiry, W. S. Multispectral fluorescence imaging. Journal of Nuclear Medicine. 50 (10), 1563-1566 (2009).
  5. Parra, E. R., et al. Validation of multiplex immunofluorescence panels using multispectral microscopy for immune-profiling of formalin-fixed and paraffin-embedded human tumor tissues. Scientific Reports. 7 (1), 13380(2017).
  6. Wickenhauser, C., et al. Immune Checkpoint Blockade: Methods and Protocols. Pico de Coaña, Y. , Springer. New York. 13-31 (2019).
  7. Feng, Z., et al. Multispectral imaging of formalin-fixed tissue predicts ability to generate tumor-infiltrating lymphocytes from melanoma. Journal for ImmunoTherapy of Cancer. 3 (1), 47(2015).
  8. Manesse, M., Patel, K. K., Bobrow, M., Downing, S. R. The InSituPlex((R)) Staining Method for Multiplexed Immunofluorescence Cell Phenotyping and Spatial Profiling of Tumor FFPE Samples. Methods in Molecular Biology. 2055, 585-592 (2020).
  9. Gamble, L. J., Anderton, C. R. Secondary Ion Mass Spectrometry Imaging of Tissues, Cells, and Microbial Systems. Microscopy Today. 24 (2), 24-31 (2016).
  10. Giesen, C., et al. Highly multiplexed imaging of tumor tissues with subcellular resolution by mass cytometry. Nature Methods. 11 (4), 417-422 (2014).
  11. Angelo, M., et al. Multiplexed ion beam imaging of human breast tumors. Nature Medicine. 20 (4), 436-442 (2014).
  12. Tsujikawa, T., et al. Quantitative Multiplex Immunohistochemistry Reveals Myeloid-Inflamed Tumor-Immune Complexity Associated with Poor Prognosis. Cell Reports. 19 (1), 203-217 (2017).
  13. Goltsev, Y., et al. Deep Profiling of Mouse Splenic Architecture with CODEX Multiplexed Imaging. Cell. 174 (4), 968-981 (2018).
  14. Gerdes, M. J., et al. Highly multiplexed single-cell analysis of formalin-fixed, paraffin-embedded cancer tissue. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (29), 11982-11987 (2013).
  15. Shi, S. R., Key, M. E., Kalra, K. L. Antigen retrieval in formalin-fixed, paraffin-embedded tissues: an enhancement method for immunohistochemical staining based on microwave oven heating of tissue sections. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 39 (6), 741-748 (1991).
  16. Viegas, M. S., Martins, T. C., Seco, F., do Carmo, A. An improved and cost-effective methodology for the reduction of autofluorescence in direct immunofluorescence studies on formalin-fixed paraffin-embedded tissues. European Journal of Histochemistry. 51 (1), 59-66 (2007).
  17. Sorensen, I. V., et al. Characterization of anti-TIMP-1 monoclonal antibodies for immunohistochemical localization in formalin-fixed, paraffin-embedded tissue. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 54 (10), 1075-1086 (2006).
  18. Parra, E. R., Villalobos, P., Mino, B., Rodriguez-Canales, J. Comparison of Different Antibody Clones for Immunohistochemistry Detection of Programmed Cell Death Ligand 1 (PD-L1) on Non-Small Cell Lung Carcinoma. Applied Immunohistochemistry & Molecular Morphology. 26 (2), 83-93 (2018).
  19. Boger, C., Kalthoff, H., Goodman, S. L., Rocken, C. Validation and comparison of anti-alphavbeta3 and anti-alphavbeta5 rabbit monoclonal versus murine monoclonal antibodies in four different tumor entities. Applied Immunohistochemistry & Molecular Morphology. 21 (6), 553-560 (2013).
  20. Torigoe, T., et al. Establishment of a monoclonal anti-pan HLA class I antibody suitable for immunostaining of formalin-fixed tissue: unusually high frequency of down-regulation in breast cancer tissues. Pathology International. 62 (5), 303-308 (2012).
  21. Dapson, R. W. Macromolecular changes caused by formalin fixation and antigen retrieval. Biotechnic & Histochemistry. 82 (3), 133-140 (2007).
  22. Sompuram, S. R., Vani, K., Hafer, L. J., Bogen, S. A. Antibodies Immunoreactive With Formalin-Fixed Tissue Antigens Recognize Linear Protein Epitopes. American Journal of Clinical Pathology. 125 (1), 82-90 (2006).
  23. Cassetti, M. C., et al. Antitumor efficacy of Venezuelan equine encephalitis virus replicon particles encoding mutated HPV16 E6 and E7 genes. Vaccine. 22 (3-4), 520-527 (2004).
  24. Kiernan, J. A. Histological and Histochemical Methods: Theory and Practice, 3rd Edition. Shock. 12 (6), 479(1999).
  25. Favreau, P., et al. Thin-film tunable filters for hyperspectral fluorescence microscopy. Journal of Biomedical Optics. 19 (1), 011017(2014).
  26. van Kempen, M. J., Rijkers, G. T., Van Cauwenberge, P. B. The immune response in adenoids and tonsils. International Archives of Allergy and Immunology. 122 (1), 8-19 (2000).
  27. Klein, U., Dalla-Favera, R. Germinal centres: role in B-cell physiology and malignancy. Nature Reviews Immunology. 8 (1), 22-33 (2008).
  28. Eiben, G. L., et al. Establishment of an HLA-A*0201 Human Papillomavirus Type 16 Tumor Model to Determine the Efficacy of Vaccination Strategies in HLA-A*0201 Transgenic Mice. Cancer Research. 62, 5792-5799 (2002).
  29. Gonzalez, H., Hagerling, C., Werb, Z. Roles of the immune system in cancer: from tumor initiation to metastatic progression. Genes & Development. 32 (19-20), 1267-1284 (2018).
  30. Sica, A., Schioppa, T., Mantovani, A., Allavena, P. Tumour-associated macrophages are a distinct M2 polarised population promoting tumour progression: potential targets of anti-cancer therapy. European Jorunal of Cancer. 42 (6), 717-727 (2006).
  31. Au-Granier, C., et al. Multiplexed Immunofluorescence Analysis and Quantification of Intratumoral PD-1+ Tim-3+ CD8+ T Cells. Journal of Visualized Experiments. (132), e56606(2018).
  32. Odell, I. D., Cook, D. Immunofluorescence Techniques. Journal of Investigative Dermatology. 133 (1), 1-4 (2013).
  33. Xing, Y., et al. Bioconjugated quantum dots for multiplexed and quantitative immunohistochemistry. Nature Protocols. 2 (5), 1152-1165 (2007).
  34. Schubert, W., et al. Analyzing proteome topology and function by automated multidimensional fluorescence microscopy. Nature Biotechnology. 24 (10), 1270-1278 (2006).
  35. de Vries, N. L., et al. High-dimensional cytometric analysis of colorectal cancer reveals novel mediators of antitumour immunity. Gut. , 03(2019).
  36. Scalia, C. R., et al. Antigen Masking During Fixation and Embedding, Dissected. The Journal of Histochemistry and Cytochemistry : Official Journal of the Histochemistry Society. 65 (1), 5-20 (2017).
  37. Sorrelle, N., et al. Improved Multiplex Immunohistochemistry for Immune Microenvironment Evaluation of Mouse Formalin-Fixed, Paraffin-Embedded Tissues. Journal of Immunology. 202 (1), 292-299 (2019).
  38. Ackerman, L. V., Ramirez, G. A. The indications for and limitations of frozen section diagnosis; a review of 1269 consecutive frozen section diagnoses. British Journal of Surgery. 46 (198), 336-350 (1959).
  39. Mezheyeuski, A., et al. Multispectral imaging for quantitative and compartment-specific immune infiltrates reveals distinct immune profiles that classify lung cancer patients. The Journal of Pathology. 244 (4), 421-431 (2018).
  40. Feng, Z., et al. Multiparametric immune profiling in HPV- oral squamous cell cancer. JCI insight. 2 (14), 93652(2017).
  41. Yang, L., Liu, Z., Tan, J., Dong, H., Zhang, X. Multispectral imaging reveals hyper active TGF-β signaling in colorectal cancer. Cancer Biology & Therapy. 19 (2), 105-112 (2018).
  42. Blom, S., et al. Systems pathology by multiplexed immunohistochemistry and whole-slide digital image analysis. Scientific Reports. 7 (1), 15580-15580 (2017).
  43. Roy, S., Axelrod, H. D., Valkenburg, K. C., Amend, S., Pienta, K. J. Optimization of prostate cancer cell detection using multiplex tyramide signal amplification. Journal of Cellular Biochemistry. 120 (4), 4804-4812 (2019).
  44. Vickovic, S., et al. High-density spatial transcriptomics arrays for in situ tissue profiling. bioRxiv. , 563338(2019).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

FluorofoorcombinatiesCreatie van Spectrale BibliotheekMachine Learning analyseCelsegmentatieAntilichaamkleuringsprotocolSpectrale OntmengingWhole Slide ScanFenotypemapping

Gerelateerde artikelen