Method Article

Het meten van Erythroocyte Complement Receptor 1 met behulp van Flow Cytometrie

DOI:

10.3791/60810

⸱

May 19th, 2020

 ,  ,  ,  ,  , 
1Oncogeriatric Coordination Unit, Reims University Hospitals, Maison Blanche Hospital, 2Faculty of Medicine, University of Reims Champagne-Ardenne, 3URCACyt, Flow cytometry technical platform, University of Reims Champagne-Ardenne, 4Department of Immunology, Reims University Hospitals, Robert Debre Hospital, 5Department of Internal Medicine and Geriatrics, Reims University Hospitals, Maison Blanche Hospital, 6Faculty of Medicine, University of Reims Champagne-Ardenne

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Het doel van deze methode is om de CR1-dichtheid in de erytrocyten van elk onderwerp te bepalen door te vergelijken met drie proefpersonen waarvan de erytrocyten CR1-dichtheid bekend is. De methode maakt gebruik van flow cytometrie na immunostaining van de erytrocyten van de proefpersonen door een anti-CR1 monoklonale antilichaam gekoppeld aan een versterkt systeem met behulp van fycoerythrin (PE).

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

CR1 (CD35, Complement Receptor type 1 voor C3b/C4b) is een hoog moleculair gewicht membraan glycoproteïne van ongeveer 200 kDa dat de activering van de activatie regelt, immuuncomplexen vervoert en deelneemt aan humorale en cellulaire immuunreacties. CR1 is aanwezig op het oppervlak van vele celtypes, waaronder erythrocyten, en vertoont polymorfismen in lengte, structuur (Knops, of KN, bloedgroep), en dichtheid. De gemiddelde dichtheid van CR1 per erythrocyte (CR1/E) is 500 moleculen per erythrocyt. Deze dichtheid varieert van individu tot individu (100-1.200 CR1/E) en van de ene erytrocyt tot de andere in hetzelfde individu. We presenteren hier een robuuste flow cytometrie methode om de dichtheid van CR1/E te meten, ook in onderwerpen die een lage dichtheid uitdrukken, met behulp van een versterkend immunostaining systeem. Deze methode heeft ons in staat gesteld om het verlagen van CR1 erytrocytenexpressie te tonen bij ziekten zoals de ziekte van Alzheimer (AD), systemische lupus erythematosus (SLE), AIDS of malaria.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

CR1 (complement receptor type 1, CD35) is een 200 kDa transmembraan glycoproteïne aanwezig op het oppervlak van vele celtypes, zoals erythrocyten1, B lymfocyten2,monocytische cellen, sommige T-cellen, folliculaire dendritische cellen3,foetale astrocyten4, en glomeraire podocyten5. CR1 die zijn liganden C3b, C4b, C3bi6,,7,8,,9verstoort, een subeenheid van de eerste complementcomponent, C1q10 en MBL (m....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Het protocol voor het verzamelen en behandelen van menselijk bloed werd herzien en goedgekeurd door de regionale ethische commissie (CPP Est II), en het protocolnummer is 2011-A00594-37. Omdat het volgende protocol de behandeling van menselijk bloed beschrijft, moeten institutionele richtlijnen voor het verwijderen van biogevaarlijk materiaal worden gevolgd. Laboratoriumveiligheidsuitrusting, zoals laboratoriumjassen en handschoenen, moet worden gedragen.

1. Erytrocyten wassen

OPMERKING: Bereid de dag voor de behandeling een PBS-BSA-buffer voor met fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) die 0,15% van het runderserum....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De erytrocyten van drie proefpersonen waarvan de dichtheid van CR1 bekend is ("laag" onderwerp [180 CR1/E], "medium" onderwerp [646 CR1/E], en "hoog" onderwerp [966 CR1/E]), en van twee proefpersonen waarvan de CR1-dichtheid moest worden bepaald, werden immunostained door een anti-CR1-antilichaam gekoppeld aan een versterkingssysteem met behulp van het fycoerythrinfluorchroom. In het begin werd de CR1-dichtheid van de proefpersonen uit het lage bereik bepaald door de Scatchard-methode29 met behulp.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Er zijn verschillende technieken beschikbaar om de dichtheid van erythrocyte CR1 (CR1/E) te bepalen. De eerste gebruikte technieken waren de agglutinatie van rode bloedcellen door anti-CR1 antilichamen31 en de vorming van rozetten in aanwezigheid van erytrocyten bekleed met C3b32. Deze rudimentaire technieken werden snel vervangen door immunobevlekmethoden met behulp van anti-CR1-antilichamen met behulp vanradiolabel1 1,3.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs hebben niets te onthullen.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wij danken alle leden van de URCACyt, flow cytometrie technisch platform, het personeel van de afdeling Immunologie, en het personeel van de afdeling Interne Geneeskunde en Geriatrie, die hebben bijgedragen aan het optimaliseren en valideren van het protocol. Dit werk werd gefinancierd door de universitaire ziekenhuizen van Reims (subsidienummer AOL11UF9156).

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
1000E Barrier TipThermo Fischer Scientific , F-67403 Illkirch, France2079Esample pipetting
1-100 µL Bevelled, filter tipStarlab GmbH, D-22926 Ahrenburg, GermanyS1120-1840sample pipetting
Biotinylated anti-CR1 monoclonal antibody (J3D3)Home production of non-commercial monoclonal antibody, courtesy of Dr J. Cookimmunostaining
Blouseprotection
Bovin serum albumin (7,5%)Thermo Fischer Scientific , F-67403 Illkirch, France15260037cytometry
CentrifugeThermo Fischer Scientific , F-67403 Illkirch, France11176917centrifugation
Clean SolutionBD, F-38801 Le Pont de Claix, France340345cytometry
Comorack-96Dominique DUTSCHER SAS, F-67172 Brumath944060Prack
Cytometer Setup & Tracking Beads KitBD, F-38801 Le Pont de Claix, France655051cytometry
Formaldehyde solution 36.5 %Sigma Aldrich, F-38070 Saint Quentin Fallavier, FranceF8775-25MLFixation
10 µL Graduated, filter tipStarlab GmbH, D-22926 Ahrenburg, GermanyS1121-3810sample pipetting
LSRFORTESSA Flow CytometerBD, F-38801 Le Pont de Claix, France647788cytometry
Microman Capillary PistonsDominique DUTSCHER SAS, F-67172 Brumath067494sample pipetting
Micronic 1.40 mL round bottom tubesDominique DUTSCHER SAS, F-67172 BrumathMP32051mix
Micropipette Microman - type M25 -Dominique DUTSCHER SAS, F-67172 Brumath066379sample pipetting
Phosphate buffered Saline (PBS)Thermo Fischer Scientific , F-67403 Illkirch, France10010031cytometry
Pipette PS 325 mm, 10 mLDominique DUTSCHER SAS, F-67172 Brumath391952sample pipetting
powder-free Nitrile Exam glovesMedline Industries, Inc, Mundelein, IL 60060, USA486802sample protection
Reference 2 pipette, 0,5-10 µLEppendorf France SAS, F-78360 Montesson, France4920000024sample pipetting
Reference 2 pipette, 20-100 µLEppendorf France SAS, F-78360 Montesson, France4920000059sample pipetting
Reference 2 pipette, 100-1000 µLEppendorf France SAS, F-78360 Montesson, France4920000083sample pipetting
Rinse SolutionBD, F-38801 Le Pont de Claix, France340346cytometry
Round bottom tubeSarstedt, F-70150 Marnay, France55.1579cytometry
Safe-Lock Tubes, 1.5 mLEppendorf France SAS, F-78360 Montesson, France0030120086mix
streptavidin R-PETebu Bio, F-78612 Le Perray-en-Yvelines, FranceAS-60669immunostaining
Tapered Centrifuge Tubes 50 mLThermo Fischer Scientific , F-67403 Illkirch, France10203001mix
Vector anti streptavidin biotinEurobio Ingen, F-91953 Les Ulis, FranceBA-0500immunostaining
Vortex-Genie 2Scientific Industries, Inc, Bohemia, NY 111716, USASI-0236mix

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Fearon, D. T. Identification of the membrane glycoprotein that is the C3b receptor of the human erythrocyte, polymorphonuclear leukocyte, B lymphocyte, and monocyte. Journal of Experimental Medicine. 152 (1), 20-30 (1980).
  2. Ross, G. D., Winchester, R. J., Rabellino, E. M., Hoffman, T.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Erythrocyte Complement Receptor 1Flow Cytometry AnalysisCR1 Density MeasurementImmunostaining ProtocolAntibody Amplification SystemBlood Cell PreparationFluorescence DetectionReceptor QuantificationDisease Biomarker AnalysisCell Surface Markers

Related Articles