Productie van autoloog bloedplaatjesrijk plasma voor het stimuleren van in vitro menselijke fibroblastexpansie

Samenvatting

Dit protocol presenteert een apparaat dat PRP produceert om de in vitro expansie van cellen in een 100% autoloog fibroblastkweeksysteem te stimuleren.

Samenvatting

Er is momenteel grote klinische belangstelling voor het gebruik van autologe fibroblasten voor huidherstel. In de meeste gevallen is kweek van huidcellen in vitro vereist. Celkweek met behulp van xenogene of allogene kweekmedia heeft echter enkele nadelen (d.w.z. risico op overdracht van infectieuze agentia of langzame celexpansie). Hier wordt een autoloog kweeksysteem ontwikkeld voor de uitbreiding van menselijke huidfibroblastcellen in vitro met behulp van het eigen bloedplaatjesrijke plasma (PRP) van een patiënt. Menselijke dermale fibroblasten worden geïsoleerd van de patiënt tijdens het ondergaan van abdominoplastiek. Culturen worden gedurende maximaal 7 dagen gevolgd met behulp van een medium aangevuld met foetaal runderserum (FBS) of PRP. Bloedcelgehalte in PRP-preparaten, proliferatie en fibroblastdifferentiatie worden beoordeeld. Dit protocol beschrijft de methode voor het verkrijgen van een gestandaardiseerd, niet-geactiveerd preparaat van PRP met behulp van een speciaal medisch hulpmiddel. Het preparaat vereist alleen een medisch hulpmiddel (CuteCell-PRP) en centrifuge. Dit apparaat is geschikt onder voldoende medische praktijkomstandigheden en is een eenstaps, apyrogeen en steriel gesloten systeem dat een enkele, zachte centrifugatie van 1.500 x g gedurende 5 minuten vereist. Na centrifugatie worden de bloedbestanddelen gescheiden en wordt het bloedplaatjesrijke plasma gemakkelijk verzameld. Dit apparaat maakt een snelle, consistente en gestandaardiseerde bereiding van PRP mogelijk die kan worden gebruikt als een celkweeksupplement voor in vitro expansie van menselijke cellen. De hier verkregen PRP bevat een 1,5-voudige bloedplaatjesconcentratie in vergelijking met volbloed samen, met een preferentiële verwijdering van rode en witte bloedcellen. Het is aangetoond dat PRP een stimulerend effect heeft op celproliferatie in vergelijking met FBS (7,7x) en dat fibroblasten worden geactiveerd bij PRP-behandeling.

Inleiding

Regeneratieve geneeskunde is gericht op het genezen of vervangen van weefsels en organen die zijn beschadigd door leeftijd, ziekte of trauma, evenals het corrigeren van aangeboren afwijkingen. Bij autologe therapie worden cellen of weefsel van een patiënt teruggetrokken, uitgebreid of gemodificeerd en vervolgens opnieuw aan de donor geïntroduceerd. Deze vorm van therapeutica heeft een breed potentieel op het gebied van dermatologie¹. Bij autologe fibroblasttherapie worden de fibroblasten van een patiënt gekweekt en opnieuw geïnjecteerd om rimpels, rijmden of acnelittekens te behandelen. Aangezien fibroblasten de belangrijkste functionele cellen in de dermis zijn, kan injectie van autologe fibroblasten gunstiger zijn dan andere therapieën bij gezichtsverjonging².

In de huid zijn fibroblasten verantwoordelijk voor de synthese en afscheiding van extracellulaire eiwitten (d.w.z. collageen, elastine, hyaluronzuur en glycosaminoglycanen). Ze geven ook groeifactoren vrij die de celfunctie, migratie en cel-matrix / cel-cel interacties reguleren in normale huidhomeostase en wondgenezing³. Dermale fibroblasten zijn al geïntroduceerd als een potentiële klinische celtherapie voor huidwondgenezing⁴, weefselregeneratie⁵ of dermale fillers in esthetische en plastische chirurgieprocedures⁶. Sommige studies suggereren zelfs dat, in de context van regeneratieve geneeskunde, fibroblasten een meer praktische en effectieve celtherapie kunnen zijn dan mesenchymale stamcellen⁷.

Om een voldoende aantal fibroblasten voor klinische toepassingen te verkrijgen, is celuitbreiding meestal verplicht. Ex vivo /in vitro celkweek vereist basaal medium aangevuld met groeifactoren, eiwitten en enzymen om celadhesie en proliferatie te ondersteunen. Foetaal runderserum (FBS) is een veel voorkomend supplement voor celkweekmedia, omdat foetaal bloed 1) rijk is aan groeifactoren in vergelijking met volwassen bloed en 2) een^{laag antilichaamgehalte} 8 vertoont. Naarmate de celtherapie vordert, zijn er zorgen over de veiligheid van klassieke celkweekomstandigheden waarbij FBS aan het kweekmedium wordt toegevoegd. Verder is er nu een tendens om FBS te vervangen door alternatieven⁹. Verschillende FBS-vervangers hebben veelbelovende resultaten laten zien¹⁰.

Het alternatief voor bloedplaatjesrijk plasma (PRP) is hier geselecteerd en we hebben een medisch hulpmiddel ontwikkeld om een gestandaardiseerd preparaat van PRP te produceren, genaamd CuteCell-PRP. Het beoogde gebruik van dit apparaat is de bereiding van autologe PRP voor gebruik als kweekmediasupplement voor in vitro expansie van autologe cellen onder GMP-omstandigheden.

PRP wordt gedefinieerd als een geconcentreerde bloedplaatjessuspensie in plasma. Omdat er tal van voorbereidingsprotocollen zijn, die verschillen in 1) de hoeveelheid bloed die nodig is, 2) soorten apparaten die worden gebruikt en 3) centrifugatieprotocol, variëren de resulterende bloedplaatjesconcentraties van iets boven tot meer dan 10x de bloedbasislijnwaarde. Bovendien bevatten PRP-preparaten variabele niveaus van rode en witte bloedcelbesmetting. De terminologie "PRP" wordt dus gebruikt om producten te beschrijven die sterk variëren in hun biologische samenstelling en potentiële therapeutische effecten.

In de meeste onderzoeken wordt FBS-substitutie bereikt met behulp van verschillende concentraties PRP die worden geactiveerd (door trombine of calcium). Deze kunstmatige activering veroorzaakt een onmiddellijke en belangrijke afgifte van bloedplaatjesgroeifactoren van 15 min tot 24 h¹¹. Daarom wordt aangenomen dat bloedplaatjesactivering ongewenst is voor toepassingen in celculturen, waarbij de langzame afgifte van groeifactoren uit geleidelijke bloedplaatjesdegranulatie vereist is.

PRP-therapie omvat de bereiding van autologe bloedplaatjes in geconcentreerd plasma¹². De optimale bloedplaatjesconcentratie is onduidelijk en er is een breed scala aan commerciële apparaten beschikbaar om PRP¹³ te bereiden. Dit gebrek aan standaardisatie is het gevolg van inconsistentie tussen studies en heeft geleid tot een zwarte doos met betrekking tot de dosering en timing van injectie. Dit protocol beschrijft een procedure om autologe PRP te verkrijgen met behulp van dit speciale PRP-apparaat om huidfibroblasten uit te breiden in een 100% autoloog ex vivo cultuurmodel.

Protocol

Het onderzoeksprotocol voldeed aan de Verklaring van Helsinki en alle patiënten gaven schriftelijke geïnformeerde toestemming voordat ze aan het onderzoek deelnamen. Huidmonsters worden verkregen van gezonde vrouwen die abdominoplastiek ondergaan op de afdeling Plastische, Reconstructieve en Esthetische Chirurgie van de Universitaire Ziekenhuizen van Genève (Genève, Zwitserland). De procedure is in overeenstemming met de principes van de Verklaring van Helsinki en werd goedgekeurd door de lokale institutionele ethische commissie (protocol # 3126).

1. Bereiding van PRP

OPMERKING: De CuteCell-PRP-buizen (Table of Materials) zijn ontworpen voor de snelle bereiding van PRP uit een klein volume van het bloed van de patiënt in een gesloten circuitsysteem.

1. Afname van volbloed
   OPMERKING: Oogst autoloog bloed uit een perifere ader van de arm met behulp van een vlindernaald die rechtstreeks is aangesloten op de PRP-buis, volgens het verzamelprotocol van het medisch instituut. Bloed kan direct worden teruggetrokken via de veneuze canule als de patiënt onder narcose is.
   1. Open de blisterverpakking van de buis. Voer de veneuze punctie uit en vul het gewenste aantal PRP-buizen met volbloed. Het vacuüm in de buizen maakt automatische verzameling van het benodigde bloedvolume (~ 10 ml) mogelijk.
   2. Draai de buisjes voorzichtig meerdere keren ondersteboven om het bloed te mengen met antistollingsmiddel.
   3. Verwijder in een bioveiligheidskast (klasse 2) 100 μL totaal volbloed met behulp van een spuit van 1 ml voor verdere tellingen van het aantal bloedcellen.
2. Centrifugeren
   OPMERKING: Zorg ervoor dat de centrifuge correct is gebalanceerd voordat u deze start.
   1. Zodra het bloed is verzameld in de PRP-buizen, bereidt u indien nodig een contragewichtbuis (afzonderlijk geleverd) voor met water op hetzelfde niveau als het bloed in de PRP-buis. Plaats de gevulde buizen in de centrifuge tegenover elkaar en zorg ervoor dat de machine in balans is.
   2. Centrifugemonsters op 1.500 x g gedurende 5 min.
      OPMERKING: Stel het bijbehorende toerental in volgens de instructies van de centrifugefabrikant. Na centrifugeren wordt het bloed gefractioneerd. De rode en witte bloedcellen zitten gevangen onder de gel en bloedplaatjes nestelen zich op het oppervlak van de gel (figuur 1).
3. Keer de PRP-buis 20x voorzichtig om om de bloedplaatjesafzetting in het plasmasupernatant te resuspenderen.
   OPMERKING: Zorg ervoor dat de bloedplaatjes volledig los zijn van de gel. Het plasma moet veranderen van helder en transparant naar troebel. Als er bloedplaatjesaggregaten aanwezig zijn, moeten deze met het plasma worden verzameld.
4. Om PRP te verzamelen, neemt u de plasma-oplossing uit de buis met behulp van een spuittransferapparaat dat is aangesloten op een spuit van 10 ml.
   OPMERKING: Ongeveer 5 ml PRP wordt verkregen uit elke buis. De PRP-oplossing is nu klaar om te mengen in de uiteindelijke mediumbereiding. De oplossing kan bij kamertemperatuur (RT) onder de veiligheidskast worden bewaard tot de toekomstige stappen met betrekking tot hematologieanalysator en gebruik.
5. Voordat u de PRP gebruikt, bepaalt u de bloedplaatjesconcentratie, het gemiddelde bloedplaatjesvolume en het aantal rode en witte bloedcellen met behulp van een geautomatiseerde hematologieanalysator (materiaaltabel). Trek hiervoor voorzichtig 100 μL van de oplossing op en breng over in een buis van 1,5 ml.
   OPMERKING: PRP wordt gebruikt als een autoloog cultuursupplement in een concentratie tussen 5-20% v / v. De optimale concentratie PRP moet voor elke cellijn worden bepaald. Om de vorming van fibrinestolsels te voorkomen, moeten de uiteindelijke kweekmedia worden aangevuld met 2 U / ml heparine.

2. Isolatie van autologe fibroblasten en cultuur in FBS- of PRP-aangevulde media

1. Was huidmonsters in fosfaat-gebufferde zoutoplossing (PBS) door voorzichtig te schudden in een polypropyleenbuis van 50 ml.
2. Als het huidmonster relatief groot is (>10 cm 2), plaats het monster dan op het deksel van een weefselkweekschaal van 150 cm² (epidermale kant naar beneden). Verwijder het onderhuidse vetweefsel met een tang en schaar. Om te voorkomen dat het weefsel uitdroogt, spoelt u het weefsel om de paar minuten in PBS.
   OPMERKING: Gebruik een kleinere weefselkweekschaal voor kleinere monsters.
3. Wanneer het trimmen van vet is voltooid, snijdt u het weefsel in stroken van ongeveer 0,5 cm x 1,5 cm met behulp van een steriel scalpel.
4. Voeg 5 ml collagenase-dispase mix (materiaaltafel; 14 Wünsch-eenheden/ml) toe aan een steriele buis van 15 ml.
5. Breng het gesneden weefsel over naar de buis en zorg ervoor dat de weefselstukken in de oplossing worden ondergedompeld. Sluit de buis goed af.
6. Plaats de buizen in een incubator bij 37 °C met orbitaal schudden gedurende 150 minuten. Plaats na incubatie de buis met het weefsel in de bioveiligheidskast.
7. Plaats het deksel van een steriele kweekschaal van 100 mm ondersteboven in de bioveiligheidskast. Breng de verteerde weefseloplossing over op de bodem van de 100 mm kweekschaal, zonder te spatten. Als er stukjes weefsel in de buis achterblijven, gebruik dan een steriele pipet van 1 ml of een steriele tang om de weefselstukken over te brengen naar de bodem van de kweekschaal van 100 mm.
8. Met de epidermisstrip naar boven gericht, scheidt u het intacte epidermisvel van de dermis met behulp van twee paar tangen. Houd de dermis van de weefselstrip vast met een tang en de rand van de opperhuid met een andere tang. Schil de dermis en opperhuid in twee stukken uit elkaar en houd de gescheiden stukken op hetzelfde deksel. Probeer deze stap snel uit te voeren en herhaal de manipulatie voor elk stukje weefsel.
9. Breng de dermale stukjes over in een nieuwe 100 mm kweekschaal met PBS.
10. Plaats met behulp van een laboratoriumtang de dermale stukjes in een polypropyleenbuis van 15 ml met 3 ml 0,3% trypsine / PBS. Incubeer gedurende 10-20 minuten in een waterbad van 37 °C en keer per 2−3 min de buis om.
11. Om de enzymatische reactie te stoppen, voegt u 3−5 ml ijskoud compleet groeimedium toe (Dulbecco's gemodificeerde Eagle medium [DMEM] of RPMI met 10% FBS). Vortex de buis krachtig meerdere keren. Filter de fibroblastsuspensie door een 85 μm nylon gaas (geplaatst over de bovenkant van een buis van 50 ml) om huidresten te verwijderen.
12. Centrifugeer gedurende 10 minuten bij 150 x g, bij 4 °C. Zuig het supernatant op en resuspensie de pellet in 100−1.000 μL volledig groeimedium.
13. Gebruik trypan blue (verdunningsfactor van x2) gemengd met de celsuspensie het aantal totale en levensvatbare cellen door de kamer van de hemocytometer te vullen.
    OPMERKING: De levensvatbaarheid van cellen hangt af van de omstandigheden die worden gebruikt voor enzymatische spijsvertering. Om het celherstel en de levensvatbaarheid van de cel te vergroten, kan het huidmonster in kleinere stukjes worden gesneden.
14. Plaat 3−10 x 10⁴ cellen in 5 ml compleet FBS-groeimedium (DMEM, 10% FBS-warmte-geïnactiveerd gedurende 60 minuten bij 56 °C, 1% 1 M HEPES-bufferoplossing, 1% 100x niet-essentieel aminozuurmengsel, 1% 100x L-glutamine, 1% 100x penicilline/streptomycine, 1% 100x natriumpyruvaat) in een weefselkweekkolf van 25 cm² . Incubeer bij 37 °C.
    OPMERKING: Levensvatbare fibroblasten hechten zich binnen 24 uur aan de kolf en beginnen de spilvorm binnen 2-3 dagen te vertonen.
15. Zuig op dag 2 het medium met niet-adherente cellen op en voeg vers medium toe.
    OPMERKING: Aangezien dode cellen in het kweekmedium de groei van levensvatbare fibroblasten beïnvloeden, moeten niet-adhese, dode cellen uit de cultuur worden verwijderd.
16. Verander het medium elke 3−4 dagen totdat de cultuur 70−80% samenvloeiing bereikt.
17. Om fibroblasten te oogsten, wassen met PBS en incuberen met trypsine / EDTA-oplossing gedurende 3 minuten bij 37 °C in de incubator.
18. Om de reactie te stoppen, voegt u 3-5 ml warm volledig groeimedium toe (DMEM of RPMI met 10% FBS). Neem een aliquot van de celsuspensie om de cellen te tellen met de hemocytometer. Centrifugeer de suspensie gedurende 5 minuten bij 200 x g en verwijder het medium door aspiratie.
19. Kweek de fibroblast in PRP-medium (DMEM, 20% PRP, 1% 1 M HEPES-bufferoplossing, 1% 100x niet-essentieel aminozuurmengsel, 1% 100x L-glutamine, 1% 100x penicilline / streptomycine, 1% 100x natriumpyruvaat, 2 U / ml heparine) in de incubator bij 37 °C.
    OPMERKING: De aanbevolen minimale celdichtheid is 4.000 levensvatbare cellen/cm².
20. Om PRP-effecten op fibroblastproliferatie te beoordelen, zaadfibroblasten (passage 2) in 24 putplaten met een dichtheid van 8 x 10³ cellen per put in PRP-medium met verschillende PRP-concentraties (1%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40% en 50%) en met 2 U / ml heparine of onder klassieke kweekmediumomstandigheden (10% FBS). Voeg na 7 dagen kweek een vitale kleurstof (celproliferatieviolet) toe aan cellen en beoordeel de proliferatie door flowcytometrie.
21. Om cytoskeletale herschikkingen te bestuderen, werden zaadcellen in 96 putzwarte/heldere platte bodemplaten in een concentratie van 1 x 10 5 cellen/ml in volledige FBS-groei-DMEM (zie stap 2.14) aangevuld met^0,5 % FBS gedurende 24 uur. Behandel cellen met 10% FBS of verschillende PRP-concentraties (1%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40% en 50%) gedurende 7 dagen.
    1. Fixeer de fibroblasten met 4% paraformaldehyde gedurende 10 minuten en permeabiliseer met 0,1% Triton X-100 gedurende 5 minuten bij RT. Bevlek de fibroblasten met 50 ml 5 U / ml falloidine, was 2x met PBS en markeer met 50 ml 1 mg / ml 4 ′, 6-diamidino-2-fenylindool (DAPI) gedurende 5 minuten. Cytation 3 cell imaging multimode reader (BioTek) werd gebruikt om falloidinekleuring te visualiseren.

Resultaten

Deze gepatenteerde technologie is een eenvoudig, snel en reproduceerbaar medisch hulpmiddel dat wordt gebruikt om gestandaardiseerde PRP-preparaten te produceren. Het is een volledig gesloten systeem in één stap dat de bereiding van PRP uit veneus volbloed mogelijk maakt na 5 minuten centrifugeren bij 1.500 x g (vanwege de scheidende geltechnologie). De PRP verkregen na centrifugatie wordt geklaard uit rode en witte bloedcellen, die onder de gel zitten. Na verschillende buisinversies worden de bloedplaatjes die ...

Discussie

De voordelen van het gebruik van autologe fibroblasten als een natuurlijk alternatief in vergelijking met andere vulmaterialen in wondceltherapie omvatten een goede biocompatibiliteit, minimale bijwerkingen en gemak van oogsten en gebruik. Voordat deze therapieën echter in een dagelijkse klinische omgeving worden gebruikt, zijn goede preklinische studies nodig om de groeikenmerken te identificeren en de biologische functie en veiligheid van geïsoleerde fibroblasten zowel voor als na transplantatie te beoordelen. Direct n...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
96 well black clear flat bottom	BD Falcon	353219	32/case
Cell trace Violet Dye	Thermo Fischer Scientific	C34557	180 assays
CuteCell PRP	Regen Lab SA	CC-PRP-3T	3 tubes per package
DAPI	Sigma	D9542	1 mg
DMEM	Gibco	52400-025	500 mL
FBS	Gibco	10270106	500 mL
Glutamine 200 mM	Gibco	25030024	100 mL
Hematology Counter	Sysmex	KK-21N
Heparin 5000E Liquemine	Drossapharm AG		0.5 mL
HEPES Buffer Solution 1M	Gibco	15630-056	100 mL
Liberase DH	Roche	5401054001	2x 5 mg per package
MEM NEAA 100x	Gibco	11140-035	100 mL
Na Pyruvate 1mg/mL	Gibco	11360-039	100 mL
Penicillin streptomycin	Gibco	15140122	100 mL
Phalloidin alexa Fluor 488	Molecular Probes	A12379	300 units
RPMI	Gibco	31966-021	500 mL
Trypsin 1x 0.25%	Gibco	25050-014	100 mL
Trypsin EDTA 0.25%	Gibco	25200056	100 mL