Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Homogene Glycoconjugaat geproduceerd door gecombineerde onnatuurlijke aminozuur integratie en click-chemie voor vaccindoeleinden

4.9K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/60821

⸱

19 december 2020

 ,  ,  ,  , 
1Université de Nantes, CNRS, Unité Fonctionnalité et Ingénierie des Protéines (UFIP), UMR 6286

In dit artikel

Samenvatting

Genetische code uitbreiding wordt toegepast voor de introductie van een onnatuurlijk aminozuur met een biorthogonale functionele groep op een drager eiwit op een gedefinieerde site. De biorthogonale functie wordt verder gebruikt voor de plaatsselectieve koppeling van een koolhydraatantgeen om een homogeen glycoconjugaatvaccin te bieden.

Samenvatting

Genetische code uitbreiding is een krachtig instrument om onnatuurlijke aminozuren (IA's) in eiwitten te introduceren om hun kenmerken te wijzigen, om nieuwe eiwitfuncties te bestuderen of te creëren of om toegang te hebben tot eiwitconjugaten. Stop codon onderdrukking, in het bijzonder amber codon onderdrukking, is naar voren gekomen als de meest populaire methode om genetisch te introduceren UAAs op gedefinieerde posities. Deze methode wordt hierin toegepast op de bereiding van een dragereiwit dat een UAA bevat die een bioorthogonale functionele groep herbergt. Deze reactieve handgreep kan vervolgens worden gebruikt om specifiek en efficiënt een synthetische oligosaccharide hapten te transplanteren om een homogeen glycoconjugaatvaccin te leveren. Het protocol is beperkt tot de synthese van glycoconjugates in een 1:1 koolhydraat hapten /drager eiwit verhouding, maar vatbaar voor tal van paren van biorthogonal functionele groepen. Glycococonjugate vaccin homogeniteit is een belangrijk criterium om volledige fysisch-chemische karakterisering te waarborgen, waardoor, voldoen aan meer en meer veeleisende drug regelgevende instantie aanbevelingen, een criterium dat wordt onvervuld door klassieke vervoeging strategieën. Bovendien maakt dit protocol het mogelijk om de structuur van het eigenlijke conjugaatvaccin nauwkeurig af te stemmen, wat aanleiding geeft tot instrumenten om structuur-immunogeniciteitsrelaties aan te pakken.

Inleiding

Glycoconjugate vaccins zijn essentiële elementen van het vaccin arsenaal beschikbaar voor de profylactische behandeling van infectieziekten. Ze zijn veilig, goed verdragen en efficiënt in een brede leeftijdsgroep met inbegrip van jonge zuigelingen. Ze bieden de optimale afweer tegen infecties veroorzaakt door gekapseizeerde bacteriën zoals meningokokken, pneumokokken of Haemophilus influenzae type b1. Glycococonjugate vaccins zijn gemaakt van gezuiverde bacteriële polysaccharides die de capsules van bacteriën of synthetische oligosadariden die deze oppervlakte-uitgedrukte polysaccharidesnabootsen 2, die covalent zijn gekoppeld aan een drager eiwit. De aanwezigheid van een dragereiwit is essentieel om beschermende humorale immuunreacties te bevorderen gericht tegen de antigene determinant uitgedrukt door de koolhydraatantigenen3. Afgezien van een zorgvuldige selectie en productie van het koolhydraatantgeen, zijn de kenmerken waarvan bekend is dat ze een invloed uitoefenen op de werkzaamheid van een glycoconjugaatvaccin: de aard van het dragereiwit, de vervoegingschemie (inclusief de aard en de lengte van de linker indien gebruikt), of de saccharide/eiwitverhouding3. Uiteraard zijn de posities waarin de saccharide is vervoegd aan het eiwit en het aantal verbindingspunten relevant voor immunogeniciteit. Tot op heden zijn deze twee parameters nauwelijks bestudeerd omdat de voorbereiding van de glycoconjugates grotendeels empirisch blijft. Hun synthese is meestal gebaseerd op het gebruik van amine- of carboxylzuurfuncties van respectievelijk lysine of aspartic/glutaminezuurzijketenresten die op de dragereiwitsequentie aanwezig zijn. Dit leidt niet tot een enkele, maar tot een heterogeen mengsel van glycoconjugates.

Spelen op de reactiviteit, toegankelijkheid of distributie van de aminozuurresten in het eiwit geeft aanleiding tot meer gedefinieerde glycoconjucten die betrouwbaarder zijn om het effect van saccharide/eiwitconnectiviteit te documenteren4. Een stap voorwaarts in de richting van dit doel kan worden bereikt door het toepassen van eiwitglycan koppelingstechnologie, een recombinant proces dat de productie van gecontroleerde glycoconjugaatvaccins in celfabrieken5,6mogelijk maakt . De glycosylation vindt echter uitsluitend plaats bij een aspergesidu in D/EXNYS/T-sequons (waarbij X een van de 20 natuurlijke aminozuren is), die niet van nature aanwezig zijn op de dragereiwitten.

Plaats selectieve mutagenese en in het bijzonder de integratie van cysteines om hun zeer en selectieve reactiviteit te benutten lijkt een alternatief7,8. Productie van drager-eiwitten waarin UAA's in hun volgorde zijn verwerkt, kunnen nog meer flexibiliteit bieden voor homogene glycoconjugaatvaccinpreparaatatie. Meer dan 100 NAA's zijn ontwikkeld en verder opgenomen in verschillende eiwitten9,10. Velen van hen bevatten bioorthogonale functies meestal gebruikt voor het uitvoeren van post translationele wijzigingen11 of om biofysische sondes12 of drugs13 enten, maar die ideale handvatten voor verdere vervoeging met koolhydraat antigenen. Succesvolle voorbeelden zijn geclaimd door Biotech14 met behulp van cel-vrije eiwitsynthese15, maar de voorbereiding van glycoconjugaat vaccins volgens deze strategie wacht nog steeds op steeds gepopulariseerd.

De toepassing van de in vivo strategie voor de productie van gemuteerde dragereiwit vergt een gewijzigde translationele machinerie die een specifieke codon, een tRNA dat de codon erkent en een aminoacyl-tRNA synthetase (aaRS) die specifiek de overdracht van de UAA op tRNA(Figuur 1)16) katalyseert . De pyrrolysine amber stop codon onderdrukking is een van de meest gebruikte methoden om UAA op te nemen, met name de propargyl-lysine (PrK)17. Deze laatste kan op zijn beurt reageren met azido-gefunctionaliseerde koolhydraathaten om volledig gedefinieerde, homogene glycoconjugates te bieden. In het onderhavige manuscript beschrijven we hoe we het propargyl-L-lysine, een UAA met een alkynegreep, kunnen synthetiseren, hoe het tijdens de vertaling in een bacterie in een doeleiwit worden opgenomen en hoe je vervoeging uitvoeren tussen het gemodificeerde eiwit en een hapten die een azide-functie dragen met behulp van klikchemie.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

1. Synthese van de VAA: propargyl-lysine (PrK)

  1. Synthese van Nα-Boc-propargyl-lysine18
    1. Los 500 mg Boc-L-Lys-OH (2,03 mmol) op in een mengsel van waterige 1 M NaOH (5 mL) en THF (5 mL) in een kolf en pas de kolf in met een siliciumepma.
    2. Koel de kolf in een ijsbad en voeg vervolgens 158 μL propargylchloroforme (1,62 mmol) dropwise (over een periode van 2-3 minuten) toe met behulp van een microsyring tijdens het roeren.
    3. Verwarm het reactiemengsel op kamertemperatuur en blijf 10 uur roeren.
    4. Koel oplossingen af van 50 mL diethylether, 50 mL waterig 1 M zoutzuur en 60 mL ethylacetaat in een ijsbad.
    5. Koel het ruwe reactiemengsel in een ijsbad en giet het mengsel in een scheidingstrechter. Haal het mengsel uit met 50 mL diethylether. Gooi de organische laag weg.
    6. Voorzichtig waterig 1 M zoutzuur toevoegen aan de waterige fase in de scheidingstrechter. Haal vervolgens de waterige laag twee keer uit met 30 mL ethylacetaat. Controleer de aanwezigheid van N-Boc-propargyl-lysine in de organische fase door TLC met CH2Cl2-methanol (9:1) als eluent.
    7. Droog de gecombineerde organische lagen over MgSO4,filter de vaste fase af en concentreer het filtraat onder verminderde druk op een roterende verdamper.
    8. Los een monster van de ruwe olieachtige Nα-Boc-propargyl-lysine op in deuterated chloroform (CDCl3)en controleer de identiteit met 1H NMR.
      LET OP: Extractie kan leiden tot een ophoping van druk. Laat elke drukopbouw vaak los.
  2. Synthese van het onnatuurlijke aminozuur propargyl-L-lysine (PrK)
    1. Introduceer Nα-Boc-propargyl-lysine in een ronde bodemkolf uitgerust met een septum.
    2. Voeg 4 mL waterhydroous dichloormethaan (CH2Cl2) toe aan de kolf onder argon om de Nα-Boc-propargyl-lysine op te lossen.
    3. Voeg 4 mL trifluoroacetisch zuur (TFA) dropwise toe met behulp van een spuit tijdens het roeren.
    4. Roer het reactiemengsel 1 uur bij RT. Monitor de reactie van TLC met CH2Cl2-methanol (9:1) als eluent.
    5. Concentreer het reactiemengsel onder verminderde druk.
    6. Voeg diethylether toe aan het ruwe residu en incubieer het bij 4 °C gedurende 1 uur om de PrK neer te halen. Bij het werken op hogere schaal, als de PrK niet volledig neergeslagen is, trituraat te precipitaten en de incubatietijd indien nodig uit te breiden.
    7. Filter de PrK in de vorm van een witte vaste stof op een gefriteerd glas.
    8. Los een aliquot van de PrK op in D2O. Voer vervolgens NMR-analyses uit om de identiteit en zuiverheid ervan te controleren.
    9. Los voor verder gebruik het onnatuurlijke aminozuur PrK op in gedestilleerd water bij een uiteindelijke concentratie van 100 mM en bewaar bij -20 °C als 1 mL aliquots.

2. Productie van het door PrK gemodificeerde recombinant eiwit

  1. Plasmid voorbereiding
    1. Bouw een expressie plasmid (pET24d-mPsaAK32TAG-ENLYFQ-HHHHHH) die het doelrijpe Pneumokokkenoppervlak adhesine A (mPsaA) gen (mPsaA) bevat pET24d-mPsaA-WT) gevolgd door een Tabaks Etch Virus (TEV) protease sequentie door het klonen van de insert tussen de BamHI en XhoI beperking sites van de pET24d plasmid. Dit zal een His6 tag introduceren op het C-eindpunt van het eiwit. Vervang de codon van lysine-32 door de amber codon (TAG), met behulp van conventionele site-directed mutagenesis techniek.
    2. Bouw een tweede expressie plasmide (pEVOL-MmPylRS) met twee kopieën van de gencoding voor de pyrrolysyl-tRNA synthetase van Methanosarcina mazei (MmPylRS) en de gencoding voor de overeenkomstige tRNAPyr zoals eerder beschreven19. Gebruik deze speciaal ontworpen plasmidevector pEVOL voor een efficiënte integratie van UTI's.
      OPMERKING: De gedetailleerde plasmidsinformatie wordt beschreven in supplementisch dossier 1.
  2. Co-transformatie van plasmiden in de expressiestam
    1. Ontdooi een 100 μL aliquot van chemisch bevoegde Escherichia coli BL21 (DE3) op ijs gedurende 5 min.
    2. Voeg 1 μL van elke plasmid (50-100 ng van elk) in de cellen en incubeer gedurende 30 minuten op ijs.
    3. Breng de 1,5 mL microbuis met de ontdooide bevoegde cellen in een couveuse op 42 °C voor 45 s en verplaats het vervolgens 2 min terug naar ijs.
    4. Voeg 900 μL LB-medium en incubaat onder schudden toe gedurende 1 uur bij 37 °C om de expressie van antibiotica mogelijk te maken. Zet de bacteriën vervolgens op LB agar met 25 μg/mL kanamycine en 30 μg/mL chlooramfenicol. Laat bacteriëngroei 's nachts bij 37 °C.
  3. Expressie van eiwitten gewijzigd met PrK
    1. Inenting van een enkele co-getransformeerde kolonie in 5 mL LB-medium met antibiotica (25 μg/mL kanamycine en 30 μg/mL chlooramfenicol). Incubeer 's nachts bij 37 °C met schudden.
    2. Verdun de primaire cultuur (5 mL) tot 500 mL auto-inductiemedium met antibiotica, 0,02% L-arabinose en 1 mM van het onnatuurlijke aminozuur PrK en broed het bij 37 °C gedurende 24 uur met schudden. Neem een negatieve controle door het uitvoeren van de cultuur zonder PrK in parallel en een positieve controle door het uitvoeren van de cultuur van een kloon met het wt-eiwit.
    3. Aliquot 5 mL uit de 500 mL cultuur medium en centrifuge voor 10 min op 5.000 x g. Gooi de supernatant weg en vries de pellet in bij -20 °C. Oogst cellen van de resterende 495 mL door centrifugatie gedurende 10 min bij 5.000 x g. Gooi de supernatant weg en vries de pellet in bij -20 °C.
  4. Analyseer ruwe celextracten uit de 5 mL-cultuurmonsters door SDS-PAGE en western Blot-analyse
    1. Resuspend 5 mL celpellets in 250 μL lyse buffer (50 mM Na2HPO4/NaH2PO4, 150 mM NaCl, pH 8, 5 mM imidazole, 0.2 mM PMSF) en breng het over in een 1,5 mL microtube.
    2. Lyse cellen door het bevriezen van de buizen in vloeibare stikstof, ontdooien in een 42 °C bad en vortexing op hoge snelheid voor 30 s. Herhaal deze stap 3 keer.
    3. Centrifugemonsters van 17.000 x g gedurende 10 minuten om celpuin te elimineren.
    4. Neem 10 μL van de supernatant en voeg 5 μL water en 5 μL laadbuffer toe (bromofenolblauw, SDS, β-mercaptoethanol). Verwarm de monsters gedurende 5 minuten bij 100 °C en voer SDS-PAGE- en western Blot-analyses uit.
  5. Eiwitzuivering door zwaartekracht flow-bench affiniteit chromatografie met behulp van Nickel-NTA kralen
    1. Resuspend de celpellets (van de 495 mL cultuur) in 20 mL lyse buffer (50 mM Na2HPO4/NaH2PO4, 150 mM NaCl, pH 8, 5 mM imidazole, 0,2 mM PMSF).
    2. Voeg 5 μL DNase I (1 mg/mL) en 500 μL lysozyme (50 mg/mL) toe aan de ophanging en laat lyse toe door de suspensie gedurende 30 minuten bij 37 °C uit te broeden.
    3. Sonicate de cellen gedurende 5 min (cycli van 5 s-5 s, amplitude 50%) en verwijder vervolgens het celpuin door centrifugatie op 20.000 x g gedurende 30 minuten, gevolgd door filtratie op 0,45 μm filter.
    4. Voeg Ni-NTA hars toe aan de suspensie (500 μL voor 500 mL celkweek) en meng voorzichtig bij 4 °C gedurende 1 uur.
    5. Giet de suspensie in een polypropyleenkolom en verzamel de niet-gebonden fractie.
    6. Was de hars met 10 mL wasbuffer met 50 mM Na2HPO4/NaH2PO4,150 mM NaCl, 10 mM imidazole. Was de hars een tweede keer met 5 mL wasbuffer (50 mM Na2HPO4/NaH2PO4, 150 mM NaCl, 20 mM imidazole). Verzamel de wasfracties.
    7. Elute het zijn-gelabelde eiwit met 1 mL elution buffer (50 mM Na2HPO4/NaH2PO4, 150 mM NaCl, 300 mM imidazole). Herhaal deze stap 4 keer en verzamel alle elution fracties.
    8. Analyseer de ruwe lysate evenals de 7 zuiveringsfracties door SDS-PAGINA op een 12% acrylamide gel.
    9. Combineer de fracties met zuiver Zijn-gelabelde eiwit en dialyseren tegen 1 L van TEV protease buffer (50 mM Tris-HCl, 0,5 mM EDTA, pH 8) 's nachts met behulp van een dialyse (membraan cut-off MW 6000-8000 Da). Meet de concentratie van het eiwit op 280 nm met een molaire extinctiecoëfficiënt van 37 360 cm-1∙M-1 en een moleculair gewicht van 34,14 kDa voor mPsaA.

3. Verwijdering van de histidinetag door TEV protease spijsvertering

  1. Verzamel het eiwitmonster in een buis van 50 mL en voeg tev-buffer (50 mM Tris HCl, 0,5 mM EDTA, pH 8) tot 1 mL toe bij een concentratie van 2 mg/mL.
    LET OP: De concentratie kan variëren afhankelijk van eerdere resultaten. Eiwitconcentraties die we hebben getest bevinden zich in een typisch 2-3 mg/mL-bereik.
  2. Voeg 100 μL TEV protease toe (voeg 1 μL met 10 eenheden TEV protease toe voor 20 μg eiwit om te verteren).
  3. Voeg 50 μL van 0,1 M dithiothreitol (DTT) toe.
  4. Compleet met TEV buffer (50 mM Tris HCl, 0,5 mM EDTA, pH 8) tot 5 mL.
  5. Incubeer 's nachts bij 4 °C met langzaam schudden.
    OPMERKING: Als de spijsvertering niet voltooid is, voeg dan meer TEV protease toe, broed voor langere tijd of bij een hogere temperatuur tot 30 °C.
  6. Dialyze het verteerde eiwit om EDTA 's nachts bij 4 °C te verwijderen met behulp van een dialysemembraan (cut-off 6000-8000 Da) tegen fosfaatbuffer (50 mM Na2HPO4/NaH2PO4, 150 mM NaCl, 5 mM imidazole).
  7. Om de TEV protease en het onverteerde eiwit te elimineren, ontcunooit u de mix met Ni-NTA kralen en meng voorzichtig gedurende 1 uur bij 4 °C.
  8. Giet de suspensie in een polypropyleenkolom. Verzamel de niet-gebonden fractie en was de kolom met 5 mL wasbuffer (50 mM Na2HPO4/NaH2PO4, 150 mM NaCl, 10 mM imidazole)
    OPMERKING: Het eiwit van belang moet worden teruggewonnen in de niet-gebonden en wassen fracties.
  9. Elute de TEV protease en het onverteerde eiwit door toevoeging van 5 mL elutiebuffer (50 mM Na2HPO4/NaH2PO4, 150 mM NaCl, 300 mM imidazole) op de kolom. Controleer de breuken op eiwitgehalte op 280 nm en door SDS-PAGE analyse.
  10. Controleer de efficiëntie van de spijsvertering door verteerde monsters op een SDS-pagina te laden met het onverteerd eiwit als controle.
  11. Dialyseer het verteerde eiwit tegen 1 L klikbuffer (50 mM Na2HPO4/NaH2PO4, pH8) bij 4 °C 's nachts met een dialysemembraan (cut-off 6000-8000 Da) om imidazole te verwijderen en om de buffer te wisselen, en meet de concentratie van het eiwit op 280 nm met molaire extinctiecoëfficiënt en moleculair gewicht van mPsaA (37 360 cm-1∙M-1 en MW 34,14 kDa).

4. Beoordeling van de onnatuurlijke aminozuur propargyl-lysine toegankelijkheid en functionaliteit voor klik chemie

OPMERKING: Vervoeg de mPsaA met 6-hexachloorein-fluorescein-azide met behulp van het protocol beschreven door Presolski et al.20 voor klikchemie.

  1. Neem 432,5 μL prk-gemuteerd eiwit met een concentratie van 57,8 μM in een 2 mL microbuis.
    OPMERKING: Een minimumconcentratie van 2 μM alkyne is aanvaardbaar. Als de eiwitconcentratie lager is, concentreer het met een centrifugale concentrator of bevoordeel het saldo van de reactie door de verhouding tussen azide/alkyne te verhogen.
  2. Voeg 10 μL cuso4-oplossing toe bij 20 mM en 7,5 μL Tris(benzylzostrlylmethyl)amine (THPTA) op 50 mM (voorraadoplossingenconcentraties).
    1. Voeg 25 μL waterige 100 mM aminoguanidine hydrochloride toe.
    2. Voeg 25 μL van 20 mg/mL een extemporaneously bereide waterige oplossing van natrium ascorbaat toe.
    3. Sluit de buis, meng door meerdere keren om te keren en incubeer op kamertemperatuur gedurende 2 uur.
    4. Stop de reactie door 50 μL 0,5 M EDTA toe te voegen.
    5. Neem 15 μL van het reactiemengsel en zet het een microbuis, voeg 5 μL laadbuffer toe (bromophenolblauw, SDS, β-mercaptoethanol), verwarm het mengsel op 100 °C gedurende 5 minuten en laad het vervolgens in een 12% acrylamidegel. Visualiseer na de migratie de fluorescerende conjugaat op de gel onder UV-licht op 312 nm.

5. Vervoeging van mPsaA met een azido-gefunctionaliseerd koolhydraatantigeen (Pn14TS-N3) door klikchemie

  1. Koppeling
    1. Neem 432,5 μL prk-gemuteerd eiwit bij 57,8 μM in een 2 mL microbuis.
    2. Voeg 10 μL van 5 mM Pn14TS-N321 toe in water en voeg vervolgens een premix van 2,5 μL CuSO4-oplossing toe op 20 mM en 7,5 μL THPTA bij 50 mM.
      OPMERKING: Synthese van Pn14TS-N3, een tetrasaccharide die de Streptococcus pneumoniae serotype 14 capsular polysaccharide nabootst, is beschreven in referentie 21. Theoretisch kan elk koolhydraatantgeen dat een azidefunctie bevat, worden gebruikt.
    3. Voeg 25 μL van 100 mM aminoguanidine hydrochloride toe.
    4. Voeg 25 μL van 20 mg/mL extemporaneously bereide waterige oplossing van natrium ascorbaat toe.
    5. Sluit de buis, meng door meerdere keren om te keren en in te broeden op RT gedurende 2 uur.
    6. Stop de reactie door 50 μL 0,5 M EDTA toe te voegen.
    7. Neem 15 μL monsters en analyseer door SDS-PAGE.
  2. Gelfiltratie zuivering van het glycoconjugaat
    1. Zuiver het glycoconjugaat door het toe te passen op een steric exclusion agarose kolom (15 x 600 bedafmetingen, 3.000-70.000 fractioneringsbereik), geëquilibrated met 100 mM PBS buffer, pH 7.3 bij een 0.8 mL/min stroom met detectie op 280 nm.
    2. Verzamel de fracties met de glycoconjugaat.
      OPMERKING: Voor langdurige opslag dialyseert u de glycoconjugaat tweemaal tegen 1 L van H2O gedurende 2 uur en 's nachts bij 4 °C met behulp van dialysemembraan (cut-off Mw 6000-8000 Da), vries vervolgens droog en bewaar het glycoconjugaat bij -80 °C.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

In dit project werd een homogeen glycoconjugaatvaccin voorbereid met behulp van de amberstopcodononderdrukkingsstrategie om een UAA in te voeren op een gedefinieerde locatie(figuur 1). Pneumokokken oppervlak adhesine A werd geselecteerd als de drager eiwit moiety. Dit eiwit wordt zeer geconserveerd en uitgedrukt door alle stammen van Streptococcus pneumoniae22. Het is zeer immunogeen en eerder gebruikt als drager in pneumokokk...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Site-directed mutagenesis is een eenvoudige strategie om specifieke aminozuren op te nemen in een gedefinieerde positie van een eiwit dat nauwelijks wordt gebruikt met het doel om glycoconjugate vaccins7,8,14voor te bereiden . Klassieke mutagenesis op basis van de 20 natuurlijke aminozuren aanpak is zeer efficiënt, omdat er geen wijziging van de vertaalmachines nodig is. Cysteïne mutaties zijn meestal gericht op verdere verkenni...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

E.C. erkent dankbaar de financiële steun van La Région Pays de la Loire (Pari Scientifique Program "BioSynProt"), in het bijzonder een doctoraatsbeurs voor T.V. We erkennen ook Dr. Robert B. Quast (INRA UMR0792, CNRS UMR5504, LISBP, Toulouse, Frankrijk) voor zijn kostbare technische adviezen.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
AIM (autoinductif medium)FormediumAIMLB0210Vaste poeder
Boc-Lys-OHAlfa-AesarH63859Vaste poeder
BL21(DE3)Merck Novagen69450E. coli str. B, F- ompT gal dcm lon hsdSB(rB-mB-) λ(DE3 [lacI lacUV5-T7p07 ind1 sam7 nin5]) [malB+]K-12(λS)
Dialyse membraan
DNAseI
Filter 0.45 µm
L-arabinose
lysozyme
Ni-NTA harsMachery NagelProtinoNi-NTA kralen in suspensie in 20% ethanol
Pall centrifugeapparaat
pET24d-mPsaAK32TAG-ENLYFQ-HHHHHHdeze studiegelijk aan pET24d-mPsaA-WT maar met een K32TAG mutatie in het mPsaA gen
pET24d-mPsaA-WTdeze studiepET24d plasmide met het Wt mPsaA gen gekloneerd tussen de BamHI en XhoI restrictieplaatsen met een TEV protease sequentie gevolgd door een His6 tag aan het C-terminale uiteinde van mPsaA gen en dragend het kanamycine weerstandsgen
pEVOL plasmidegeschenk van Edward Lemke EMBL (ref 19)plasmide met p15A oorsprong, twee kopieën van MmPylRS (een onder GlnS promotor en een onder pAra promotor), één kopie van de tRNACUA onder de ProK promotor, het chlooramfenicol weerstandsgen
Propargyl chloroformaatSigma-Aldrich460923Vloeistof
SonicatorThermo FisherFB120-220

Referenties

  1. Rappuoli, R. Glycoconjugate vaccines: Principles and mechanisms. Science Translational Medicine. 10 (456), (2018).
  2. Verez-Bencomo, V., et al. A synthetic conjugate polysaccharide vaccine against Haemophilus influenzae type b. Science (New York, N.Y). 305 (5683), 522-525 (2004).
  3. Berti, F., Adamo, R. Antimicrobial glycoconjugate vaccines: an overview of classic and modern approaches for protein modification. Chemical Society Reviews. 47 (24), 9015-9025 (2018).
  4. Stefanetti, G., et al. Sugar-Protein Connectivity Impacts on the Immunogenicity of Site-Selective Salmonella O-Antigen Glycoconjugate Vaccines. Angewandte Chemie (International Ed. in English). 54 (45), 13198-13203 (2015).
  5. Kay, E., Cuccui, J., Wren, B. W. Recent advances in the production of recombinant glycoconjugate vaccines. NPJ Vaccines. 4, 16(2019).
  6. Ma, Z., Zhang, H., Wang, P. G., Liu, X. W., Chen, M. Peptide adjacent to glycosylation sites impacts immunogenicity of glycoconjugate vaccine. Oncotarget. 9 (1), 75-82 (2018).
  7. Grayson, E. J., Bernardes, G. J. L., Chalker, J. M., Boutureira, O., Koeppe, J. R., Davis, B. G. A coordinated synthesis and conjugation strategy for the preparation of homogeneous glycoconjugate vaccine candidates. Angewandte Chemie (International Ed. in English). 50 (18), 4127-4132 (2011).
  8. Pillot, A., et al. Site-Specific Conjugation for Fully Controlled Glycoconjugate Vaccine Preparation. Frontiers in Chemistry. , (2019).
  9. Neumann-Staubitz, P., Neumann, H. The use of unnatural amino acids to study and engineer protein function. Current Opinion in Structural Biology. 38, 119-128 (2016).
  10. Dumas, A., Lercher, L., Spicer, C. D., Davis, B. G. Designing logical codon reassignment - Expanding the chemistry in biology. Chemical Science. 6 (1), 50-69 (2015).
  11. Chen, H., Venkat, S., McGuire, P., Gan, Q., Fan, C. Recent Development of Genetic Code Expansion for Posttranslational Modification Studies. Molecules (Basel, Switzerland). 23 (7), (2018).
  12. Adumeau, P., Sharma, S. K., Brent, C., Zeglis, B. M. Site-Specifically Labeled Immunoconjugates for Molecular Imaging--Part 2: Peptide Tags and Unnatural Amino Acids. Molecular imaging and biology: MIB: the official publication of the Academy of Molecular Imaging. 18 (2), 153-165 (2016).
  13. Kularatne, S. A., et al. A CXCR4-targeted site-specific antibody-drug conjugate. Angewandte Chemie (International Ed. in English). 53 (44), 11863-11867 (2014).
  14. WIPO. Patent US20180333484 Polypeptide-Antigen Conjugates with Non-Natural Amino Acids. , https://patentscope.wipo.int/search/en/detail.jsf?docId=US233548973&recNum=65&docAn=15859251&queryString=(GBS)&maxRec=11858 (2018).
  15. Quast, R. B., Mrusek, D., Hoffmeister, C., Sonnabend, A., Kubick, S. Cotranslational incorporation of non-standard amino acids using cell-free protein synthesis. FEBS letters. 589 (15), 1703-1712 (2015).
  16. Wang, L. Engineering the Genetic Code in Cells and Animals: Biological Considerations and Impacts. Accounts of Chemical Research. 50 (11), 2767-2775 (2017).
  17. Brabham, R., Fascione, M. A. Pyrrolysine Amber Stop-Codon Suppression: Development and Applications. Chembiochem: A European Journal of Chemical Biology. 18 (20), 1973-1983 (2017).
  18. Oller-Salvia, B. Genetic Encoding of a Non-Canonical Amino Acid for the Generation of Antibody-Drug Conjugates Through a Fast Bioorthogonal Reaction. , https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Genetic+Encoding+of+a+Non-Canonical+Amino+Acid+for+the+Generation+of+Antibody-Drug+Conjugates+Through+a+Fast+Bioorthogonal+Reaction (2019).
  19. Young, T. S., Ahmad, I., Yin, J. A., Schultz, P. G. An enhanced system for unnatural amino acid mutagenesis in E. coli. Journal of Molecular Biology. 395 (2), 361-374 (2010).
  20. Presolski, S. I., Hong, V. P., Finn, M. G. Copper-Catalyzed Azide-Alkyne Click Chemistry for Bioconjugation. Current Protocols in Chemical Biology. 3 (4), 153-162 (2011).
  21. Prasanna, M., et al. Semisynthetic glycoconjugate based on dual role protein/PsaA as a pneumococcal vaccine. European Journal of Pharmaceutical Sciences: Official Journal of the European Federation for Pharmaceutical Sciences. 129, 31-41 (2019).
  22. Morrison, K. E., et al. Confirmation of psaA in all 90 serotypes of Streptococcus pneumoniae by PCR and potential of this assay for identification and diagnosis. Journal of Clinical Microbiology. 38 (1), 434-437 (2000).
  23. Lin, H., Lin, Z., Meng, C., Huang, J., Guo, Y. Preparation and immunogenicity of capsular polysaccharide-surface adhesin A (PsaA) conjugate of Streptococcuspneumoniae. Immunobiology. 215 (7), 545-550 (2010).
  24. Safari, D., et al. Identification of the smallest structure capable of evoking opsonophagocytic antibodies against Streptococcus pneumoniae type 14. Infection and Immunity. 76 (10), 4615-4623 (2008).
  25. Wang, Q., Parrish, A. R., Wang, L. Expanding the genetic code for biological studies. Chemistry & Biology. 16 (3), 323-336 (2009).
  26. Lawrence, M. C., Pilling, P. A., Epa, V. C., Berry, A. M., Ogunniyi, A. D., Paton, J. C. The crystal structure of pneumococcal surface antigen PsaA reveals a metal-binding site and a novel structure for a putative ABC-type binding protein. Structure (London, England: 1993). 6 (12), 1553-1561 (1998).
  27. Wright, T. H., Davis, B. G. Post-translational mutagenesis for installation of natural and unnatural amino acid side chains into recombinant proteins. Nature Protocols. 12 (10), 2243-2250 (2017).
  28. Dadová, J., Galan, S. R., Davis, B. G. Synthesis of modified proteins via functionalization of dehydroalanine. Current Opinion in Chemical Biology. 46, 71-81 (2018).
  29. Worst, E. G., et al. Residue-specific Incorporation of Noncanonical Amino Acids into Model Proteins Using an Escherichia coli Cell-free Transcription-translation System. Journal of Visualized Experiments. (114), (2016).
  30. Carboni, F., et al. GBS type III oligosaccharides containing a minimal protective epitope can be turned into effective vaccines by multivalent presentation. The Journal of Infectious Diseases. , (2019).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Tags

Glycoconjugaatvaccinexpansie van de genetische codeonderdrukking van het amber-codoneiwitzuiveringgelfiltratiemassaspectrometrieSDS-PAGEWestern blot
Homogene Glycoconjugaat geproduceerd door gecombineerde onnatuurlijke aminozuur integratie en click-chemie voor vaccindoeleinden
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan de bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleidsoverzicht

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.