Parallelle ondervraging van β-Arrestin2 Recruitment for Ligand Screening op een GPCR-Brede Schaal met presto-Tango Assay

Samenvatting

Aangezien GPCRs aantrekkelijke geneesmiddelendoelstellingen zijn, is GPCR ligandscreening dus onmisbaar voor de identificatie van loodverbindingen en voor deorphanisatiestudies. In de richting van deze inspanningen beschrijven we PRESTO-Tango, een open-source resource platform dat wordt gebruikt voor gelijktijdige profilering van voorbijgaande β-arrestin2 werving bij ongeveer 300 GPCRs met behulp van een TEV-gebaseerde reporter test.

Samenvatting

Als de grootste en meest veelzijdige gensuperfamilie en bemiddelaars van een gamma van cellulaire signaleringstrajecten vormen G-eiwitgekoppelde receptoren (GPCRs) een van de meest veelbelovende doelstellingen voor de farmaceutische industrie. Ergo, het ontwerp, de uitvoering, en optimalisatie van GPCR ligand screening tests is van cruciaal belang, omdat ze afstandsbediening tools voor de ontdekking van geneesmiddelen en voor het manipuleren van GPCR farmacologie en resultaten vertegenwoordigen. In het verleden typeerde G-eiwitafhankelijke testen dit onderzoeksgebied, detecteerde ligand-geïnduceerde gebeurtenissen en kwantificeerde de generatie secundaire boodschappers. Echter, sinds de komst van functionele selectiviteit, evenals een toegenomen bewustzijn van een aantal andere G-eiwit-onafhankelijke trajecten en de beperkingen in verband met G-eiwit afhankelijke testen, is er een grotere druk op het creëren van alternatieve GPCR ligand screening testen. In de richting van deze inspanning beschrijven we de toepassing van een dergelijke bron, de PRESTO-Tango platform, een luciferase reporter-based systeem dat de parallelle en gelijktijdige ondervraging van de menselijke GPCR-ome mogelijk maakt, een prestatie die eerder werd beschouwd technisch en economisch onhaalbaar. Op basis van een G-eiwit onafhankelijke β-arrestin2 recruitment test, de universaliteit van β-arrestin2-gemedieerde handel en signalering bij GPCRs maakt PRESTO-TANGO een geschikt instrument voor het bestuderen van ongeveer 300 niet-olfactorische menselijke GPCRs, waaronder ongeveer 100 weesreceptoren. PreSTO-Tango's gevoeligheid en robuustheid maken het geschikt voor primaire high-throughput schermen met behulp van samengestelde bibliotheken, gebruikt om nieuwe GPCR-doelen voor bekende geneesmiddelen te ontdekken of om nieuwe liganden voor weesreceptoren te ontdekken.

Inleiding

G-eiwit-gekoppelde receptoren (GPCRs) vormen de grootste en meest diverse familie van transmembraan eiwitten, die werken als communicatie-interfaces tussen een cel en zijn omgeving¹. De veelzijdigheid van GPCRs wordt benadrukt door hun vermogen om een divers scala van ligands-detecteren-van neurotransmitters tot nucleotiden, peptiden tot fotonen, en nog veel meer-evenals hun vermogen om tal van downstream signalering cascades die betrokken zijn bij cellulaire groei, migratie, differentiatie, apoptose, cel vuren, etc.^2,3te reguleren. Gezien hun alomtegenwoordigheid en betrokkenheid bij een veelheid van fysiologische processen, deze receptor familie is van het grootste therapeutische belang, tentoongesteld door het feit dat meer dan een derde van de momenteel beschikbare voorgeschreven medicijnen richten GPCRs⁴. Echter, deze bestaande therapieën alleen gericht op een kleine subset van de superfamilie (naar schatting 10%), en de farmacologie van veel GPCRs blijft onopgehelderd. Bovendien bestaan er meer dan 100 GPCRs als weesreceptoren, omdat ze niet zijn gekoppeld aan een endogene ligand⁵. Zo is GPCR ligand screening van cruciaal belang in deorphanisatie en de ontwikkeling van geneesmiddelen, omdat het de weg naar loodontdekking en -optimalisatie, en mogelijk naar de klinische onderzoeksfase, effent.

Methoden voor GPCR ligand screening zijn traditioneel gedaald in een van de twee categorieën, G-eiwit afhankelijk of G-eiwit onafhankelijke functionele testen⁶. GPCR-signalering wordt geregeld door heterotrimeric G-eiwitten (Gαβγ), die worden geactiveerd door de uitwisseling van GTP voor het BBP gebonden op de Gα-subeenheid⁷. Signalen van de geactiveerde receptor worden door G-eiwitten via secundaire boodschappers, zoals cAMP, Calcium, DAG en IP3, omgezet om downstream signalering te bemiddelen bij downstream-effectoren⁸. De aard van de functionele gevolgen van G-eiwitsignalering is benut om celgebaseerde testen te creëren die receptoractivering weerspiegelen. Deze methoden, die proximale (directe) of distale (indirecte) gebeurtenissen in G-eiwitsignalering meten, worden het vaakst gebruikt voor GPCR ligandscreening en zijn voornamelijk werkzaam in deorphanisatiestudies⁶. Voorbeelden van tests die rechtstreeks gpcr-gemedieerde G-eiwit activering meten zijn de [35S]GTPγS bindende test, die de binding van een radiolabeled en niet-hydrolyzable GTP analoog aan de Gα subunit, en Förster / bioluminescentie resonantie energieoverdracht (FRET / BRET, respectievelijk) sondes meet om GPCR-Gα en Gα/Gγ interacties te monitoren, die in de loop der jaren^9,10meer tractie hebben gekregen . Tests dat monitordistale gebeurtenissen de meest gebruikte tools zijn voor GPCR-profilering; cAMP en IP1/3-testen meten bijvoorbeeld intracellulaire accumulatie van G-eiwit afhankelijke secundaire boodschappers, terwijl [Ca²⁺] flux- en reportertests met specifieke responselementen die betrokken zijn bij de activering van G-eiwit (CRE, NFAT-RE, SRE, SRF-RE) gebeurtenissen verder onderzoeken stroomafwaarts de signaleringscascade¹¹. Hoewel de meeste bovengenoemde tests op een hoog doorvoerniveau kunnen worden uitgevoerd, zijn vrij gevoelig, en beschikken over bepaalde testspecifieke voordelen (bijvoorbeeld discriminatie tussen full/partagonisten, neutrale antagonisten en omgekeerde agonisten in het geval van GTPγS binding, of testfunctionaliteit op levende cellen zoals [Ca²⁺] en IP1/3)^6,er zijn helaas geen bestaande G-eiwit afhankelijke methoden die passen bij de ondervraging van de gehele druggable GPCR-ome. Dit is grotendeels te wijten aan de inheemse koppeling van meerdere G-eiwit subfamilies aan GPCRs, wat resulteert in signalering bij verschillende cascades en de onbekende G-eiwit koppeling bij wees-GPCRs. Om dit probleem te verzachten, zijn tests ontwikkeld om promiscue G-eiwitkoppeling te dwingen door middel van een gemeenschappelijke signaleringsuitlezing, zoals cAMP, en Ca²⁺, zij het dat de meeste van hen een lage doorvoer hebben¹².

Een belangrijk aspect van de GPCR-levenscyclus is de beëindiging van G-eiwitafhankelijke signalering, die voor een groot deel plaatsvindt door de aanwerving van β-arrestinen die dissociatie van het G-eiwit induceert, en uiteindelijk de receptor desensibiliseren, die is gericht op clathrin-coated internalisatie¹³. De meest alomtegenwoordig uitgedrukte isovormen van β-arrestinzijn de niet-visuele β-arrestin1 en β-arrestin2, ook aangeduid als arrestin-2 en arrestin-3, respectievelijk¹⁴. Voer G-eiwit onafhankelijke cel-gebaseerde tests, die een nieuwe dimensie toe te voegen aan GPCR ligand screening; receptor handel, label-vrije hele cel, en β-arrestin werving testen zijn allemaal opmerkelijke voorbeelden. GPCR-smokkeltests maken gebruik van fluorophore-gelabelde liganden of co-geïnternaliseerde antilichamen gericht op de receptor¹⁵, terwijl labelvrije hele celtesten biosensoren gebruiken die cellulaire veranderingen vertalen die door ligandbinding worden veroorzaakt in kwantificeerbare uitgangen, zoals elektrische of optische signalen¹⁶. Met name, typische GPCR-β-arrestin interacties mode de β-arrestin recruitment test als een aantrekkelijk instrument in het repertoire van functionele testen¹⁷. Het Tango-systeem, voor het eerst ontwikkeld door Barnea et al. slechts tien jaar geleden, omvat de introductie van drie exogene genetische elementen: een eiwitfusie bestaande uit β-arrestin2 met een tabak etch virus protease (TEVp), een tetracycline transactivator (tTA) die via een tabak aan een GPCR is gebonden etsvirus protease decolleté site (TEVcs) en wordt voorafgegaan door een sequentie uit de C-terminus van de V2 vasopressine receptor (V2 staart) om arrestaties bij werving te bevorderen, en een reporter luciferase gen waarvan de transcriptie wordt geactiveerd door de tTA transcriptiefactor translocatie naar de kern, die na β-arrestin2 aanwerving(figuur 1) 18 wordt bevrijd van de membraanverankering ( figuur 1 )¹⁸. Kwantitatieve metingen van GPCR-activering en β-arrestin2-rekrutering kunnen vervolgens worden bepaald door te lezen voor luminescentie. Een opmerkelijk onderscheid is dat, terwijl receptorhandel en labelvrije hele celmethoden relatief lage doorvoer zijn, de Tango verschillende voordelen heeft, waaronder selectieve uitlezing die specifiek is voor de doelreceptor en gevoeligheid als gevolg van signaalintegratie, waardoor het een geschikte kandidaat is voor ligandscreening op grotere schaal¹⁸.

Met het oog op deze strategische kenmerken ontwikkelden Kroeze et al. PRESTO-Tango (Parallel Receptor-ome Expression and Screening via Transcriptional Output-Tango), een high-throughput open-source platform dat de Tango-aanpak gebruikt om de druggable GPCR-ome parallel en gelijktijdig te profileren¹⁹. PreSTO-Tango maakt gebruik van de "promiscue" rekrutering van β-arrestin2 voor bijna alle GPCRs, en is de eerste-van-zijn-soort in termen van op cellen gebaseerde functionele testen, waardoor snelle "eerste ronde" screening van kleine molecuulverbindingen bij bijna alle niet-reukgvr's, inclusief wezen, onafhankelijk van de G-eiwit subfamiliekoppeling mogelijk is.

Protocol

1. Primaire screening: celcultuur en plaatzaaien

1. Voor de bereiding van poly-L-lysine (PLL)-gecoate platen, moet 20 μL/put van een 25 μg/mL-oplossing van PLL in witte of zwarte 384-well optische bodemplaten worden voorzien met behulp van een elektronische meerkanaals pipet of een reagensdispenser. Incubeer de platen bij kamertemperatuur voor 0,5-2 uur.
   LET OP: Als u de zwarte 384-putplaten gebruikt, verwacht dan dat het achtergrondsignaal lager is in vergelijking met de witte platen. Zwarte platen worden aanbevolen om het bloeden van luminescentie tussen aangrenzende putten te verminderen.
2. Om de gecoate platen te behouden en de overtollige PLL af te wassen, verwijdert u de PLL door deze over de gootsteen te vegen, droog over een papieren handdoek te tikken en 40 μL/put verdunde 1x-oplossing van antibiotica-antimycotisch toe te voegen met behulp van een elektronische meerkanaals pipet of een reagensdispenser. Bewaar PLL-gecoate platen bij 4 °C tot het klaar is voor het zaaien van platen.
3. Onderhouden HTLA cellen (vriendelijk verstrekt door Dr Richard Axel)-een menselijke embryonale niercel lijn (HEK293T) stabiel uitdrukken β-arrestin2-TEV en tTA-gedreven luciferase-in complete Dulbecco's gemodificeerde Eagle's medium (DMEM) aangevuld met 5% van foetale bovine serum, 5% van het runderkalfsserum, 2,5 μg/mL puromycine, 50 μg/mL hygromycine, 100 U/mL penicilline en 100 μg/mL streptomycine bij 37 °C in een bevochtigde incubator met 5% CO₂.
4. Kweek HTLA-cellen in 150 mm gerechten en passeren cellen twee keer per week bij een verdunningsfactor van 1:10, met een optimaal celpassagegetal van 5-25. Zorg ervoor dat een voldoende aantal 150 mm gerechten zijn confluent de dag van 384-goed plaat zaaien, afhankelijk van de schaal van het primaire scherm.
   OPMERKING: Gebruik van HTLA-cellen groter dan passage 25 kan leiden tot verminderde levensvatbaarheid, wat suboptimale resultaten oplevert.
5. Om HTLA-cellen voor het primaire scherm te zaaien, spoelt u de confluente schotel(es) voorzichtig af met 1x fosfaatbufferde zoutlijn (PBS), pH 7.4. Maak cellen los met ongeveer 6 mL van 0,05% Trypsin/0,53 mM EDTA en breng over naar een centrifugebuis met ten minste een gelijke hoeveelheid voltooid Dulbecco's gemodificeerde Eagle medium (DMEM) om de trypsine te neutraliseren.
6. Draai HTLA-cellen op 500 x g voor 3 min en bredig de celpellet opnieuw op met een dichtheid van 0,22 x 10⁶ cellen/mL in volledige DMEM, waarbij de toevoeging van 2,5 μg/mL puromycine en 50 μg/mL hygromycine wordt weggenomen omdat ze de transfection-werkzaamheid kunnen verminderen.
7. Incubeer de nodige 384-well PLL-gecoate platen bij 37 °C om ze op te warmen voordat cellen worden zaaien. Verwijder de opslagoplossing van 1x antibiotica-antimycotic van de 384-goed PLL-gecoate plaat(s) door de plaat over de gootsteen te vegen en over een papieren handdoek te tikken om te drogen.
8. Zaadcellen in de 384-well PLL-gecoate platen bij een uiteindelijke dichtheid van 10.000 cellen/goed door 45 μL van de 0,22 x 10⁶ cellen/mL HTLA-ophanging af te geven met behulp van een elektronische meerkanaals pipet. Incubeer platen bij 37 °C 's nachts. Als een transfection op dezelfde dag de voorkeur heeft, voeren zaadcellen met een dichtheid van 16.000 cellen/put de transfection 4 uur later uit.
   OPMERKING: Voor een hoge transfection-efficiëntie is 50-70% celsamenvloeiing optimaal.

2. Primaire screening: DNA-plaatvoorbereiding en transfections

1. Ter voorbereiding van de 384-well DNA bronplaat voor transfection zoals weergegeven in figuur 2, distribueer de plasmid cDNAs codering van de GPCR-Tango constructies van belang in een 96-well plaat, met een andere GPCR / goed. Het plasmide-DNA moet worden opgehangen in 0,1x Tris-EDTA (TE) buffer bij een concentratie van 50 ng/μL.
   OPMERKING: De 96-well DNA-platen kunnen worden verzegeld en opgeslagen bij -20 °C, en opnieuw worden gebruikt voor meerdere screeningexperimenten. Alle cDNA-codering GPCR-Tango constructies zijn commercieel verkrijgbaar (zie de Tabel van Materialen)en zijn gekloond in de pcDNA3.1 neomycine plasmid. De PRESTO-Tango GPCR Kit bestaat uit vier 96-well platen, die 80 GPCRs elk, een paar putten met een lege vector als negatieve controles, en positieve controle putten die de dopamine receptor D2 (DRD2) bevatten, en putten die een plasmid codering van een fluorescerend eiwit (YFP) om transfection efficiëntie te volgen.
2. Met behulp van een multichannel pipet, handmatig overdracht DNA-oplossing van de 96-goed naar de een 384-well DNA bronplaat, het toevoegen van 10 μL per 384-well. Om ervoor te zorgen dat elke voorwaarde van het experiment wordt geassaid in vierbanden, zal de helft van de 96-well DNA-plaat (rijen A-D of E-H) een volledige 384-putplaat bedekken door elke GPCR in twee kwadranten te verdelen (eerste kwadrant = - compound, tweede kwadrant = + compound), zodanig dat dezelfde GPCR zal worden getransfected in 8 putten van de 384-well plate (zie figuur 2 als gids).
3. Stel de volgende transfection reagentia samen die nodig zijn voor de calciumfosfaatneerslagmethode, zoals beschreven door Jordanië et al.²⁰: 0,1x TE buffer (1 mM Tris-HCl en 0,1 mM EDTA); 2,5 M CaCl 2-oplossing; 2x Hepes buffer, pH 7.05 (50 mM HEPES, 280 mM NaCl, 1.5 mM Na₂HPO₄). Steriliseer alle oplossingen door filtratie en opslag op 4 °C. De dag van de transfection, laat de reagentia op kamertemperatuur te bereiken voor gebruik.
4. Verdun de 2,5 M CaCl_{2-voorraadoplossing} in 0,1x TE (1:8 verdunning) tot een eindconcentratie van 0,313 M CaCl₂ en vortex. Breng 40 μL van 0,313 M CaCl₂ over op de 384-well DNA-bronplaat en meng door op en neer te besmelijken met een handbediende meerkanaalspipet of een geautomatiseerde benchtop 384-kanaals pipet.
5. Voeg 50 μL van 2x Hepes buffer toe aan de 384-well DNA bronplaat, meng opnieuw door op en neer te stampen en 1 min te laten staan; elke 384-put zal een voldoende hoeveelheid DNA / transfection mengsel voor de transfection van negen 384-put platen, afhankelijk van het aantal verbindingen die moeten worden getest. Breng 10 μL van het DNA/transfection mengsel over van de 384-well DNA-bronplaat naar de ingezaaide HTLA-cellen en broed de platen 's nachts uit bij 37 °C.

3. Primaire screening: Celstimulatie

1. Vierentwintig uur later, decanteren de transfected cel media door zachtjes flicking de 384-put plaat over de gootsteen en taping het over een papieren handdoek, of met een aspirator hoofd. Voeg langzaam 40 μL uitgehongerde media toe (DMEM aangevuld met 1% dialyseerd foetaal runderserum (dFBS) en 1x antibioticum/antimycotisch), voorzichtig om te voorkomen dat de cellen direct raken.
2. Pipet 20 μL van de verbinding van belang bij een concentratie van 3x (de uiteindelijke concentratie van het medicijn in de celplaat zal 1x zijn) in de afwisselende rijen met (+) stimulatie, en 20 μL voertuigbuffer voor de afwisselende rijen zonder (-) verbinding. Breng de celplaat terug bij 37 °C in 5% CO₂ en incubeer gedurende ten minste 16 uur.

4. Primaire screening: Luminescentielezing

1. Bereid de Glo reagent, gewijzigd van Baker en Boyce²¹: 108 mM Tris-HCl; 42 mM Tris-Base, 75 mM NaCl, 3 mM MgCl2, 5 mM Dithiothrei-tol (DTT), 0,2 mM Coenzyme A, 0,14 mg/ml D-Luciferin, 1,1 mM ATP, 0,25% v/v Triton X-100, 2 mM Natriumhydrosulfie.
   LET OP: Voorraadoplossingen van de reagentia kunnen van tevoren worden gemaakt, met uitzondering van D-Luciferin, die altijd vers wordt toegevoegd aan de Glo reagens in zijn poedervorm. Als zwarte platen werden gebruikt, kan de hoeveelheid D-Luciferin worden verhoogd tot 0,25 mg/mL.
2. Op 16-24 uur na stimulatie, decanteren de transfected cel media door zachtjes flicking de 384-goed plaat over de gootsteen en taping het over een papieren handdoek. Voeg 20 μL/well glo reagens toe en incubeer de plaat bij kamertemperatuur gedurende 5-20 min. Lees de platen met behulp van een microplate luminescentieteller, met een integratietijd van 1 s/well.

5. Primaire screening: Gegevensanalyse

1. Exporteer de opgeslagen bestanden vanuit de luminescentieteller als spreadsheet. resultaten worden geregistreerd in relatieve luminescentie-eenheden (RLU). Op basis van de lay-out van de 384-putplaat berekent u de activering (vouwverandering) van elke receptor met behulp van de volgende formule:
   
   OPMERKING: Hier voorbeeld RLU verwijst naar de waarde van elk van de vier repliceren putten van de gestimuleerde (+ samengestelde) kwadrant, Gemiddelde achtergrond RLU is het gemiddelde van de negatieve controles op de plaat, en Gemiddelde basale RLU verwijst naar het gemiddelde van het onbehandelde kwadrant van diezelfde receptor (- samengestelde). Bereken bovendien de standaarddeviatie van de 4 gegevenspunten om de kwaliteit van de resultaten te controleren. Het wordt aanbevolen om een log2-transformatie uit te voeren op het gemiddelde van de vouwwijzigingen om elke heteroskedasticity te corrigeren; de log2 basis is een praktische keuze om positieve hits te helpen identificeren. Stel empirisch de positieve hitdrempels in; opgemerkt moet worden dat sommige receptoren zo laag als 2-voudige toename en tot 40-voudige toename voor anderen met volledige agonist kunnen hebben.
2. Selecteer op basis van de resultaten de GPCRs die potentiële positieve hits zijn voor secundaire screening.

6. Secundaire screening: Celzaaien en transfections

1. Subcultuur HTLA-cellen in 100 mm schotels met een totale celdichtheid van 5 x 10⁶ cellen in 11 mL volledige media (4,55 x 10⁵/mL) en uitbroeden bij 37 °C gedurende 24 uur. Als een transfection op dezelfde dag de voorkeur heeft, worden zaadcellen met een dichtheid van 7,5 x 10⁶ cellen en voeren ze de transfection 4 uur later uit.
2. Verwarm de reagentia die nodig zijn voor calciumfosfaatneerslag bij kamertemperatuur voor. Combineer 450 μL 0,1x TE-buffer met 50 μL van 2,5 M CaCl₂ en snel vortex; deze bedragen zijn specifiek voor een 100 mm schotel, gebaseerd op het volume van de groei medium houdt.
3. Voeg in een buis 500 μL van de TE/CaCl_2-oplossing toe aan 10 μg GPCR cDNA en vortex. Voeg 500 μL 2x Hepes bufferoplossing in de buis toe, schud krachtig (niet vortex) en incubeer gedurende 1 min.
   OPMERKING: 1 μg van een plasmid die een fluorescerend eiwit codeert (bijvoorbeeld YFP, mCherry, enz.) kan co-transfect zijn met 9 μg GPCR cDNA voor een totaal van 10 μg. Het fluorescerende eiwit wordt gebruikt om transfection-efficiëntie bij te houden, en deze minimale hoeveelheid zal de test niet verstoren.
4. Onmiddellijk na de korte incubatie, moet u de 1 mL-oplossing dropwise op de cellen afgeven. Wieg de plaat voorzichtig heen en weer om het neerslag gelijkmatig te verdelen, zorg ervoor dat de plaat niet wervelt en uitbroedt bij 37 °C gedurende 24 uur.
5. De volgende dag, let op de transfection efficiëntie door te kijken naar de expressie van het fluorescerende eiwit onder een fluorescerende cel imager; transfections groter dan 50% dekking zijn ideaal.
6. Incubeer de benodigde 384-well PLL-gecoate plaat(s) in de couveuse bij 37 °C om het op te warmen voordat cellen worden zaaien. Verwijder de opslagoplossing van 1x antibiotica-antimycotic van de 384-goed PLL-gecoate plaat(s) door de plaat over de gootsteen te vegen en over een papieren handdoek te tikken om te drogen.
7. Spoel de getransfected cellen voorzichtig af met Versene-oplossing (1X PBS, pH 7.4; 0,53 mM EDTA) en maak ze los door 3 mL van 0,05% trypsin/0,53 mM EDTA aan de schotel toe te voegen. Breng de inhoud over naar een centrifugebuis met ten minste een gelijke hoeveelheid volledige DMEM om de trypsine te neutraliseren.
8. Draai de cellen op 500 x g voor 3 min en bredig de cellen opnieuw op met een dichtheid van 0,4 x 10⁶ cellen/mL in uitgehongerde media. Zaadcellen in de 384-well PLL-gecoate plaat(en) bij een uiteindelijke dichtheid van 25.000 cellen/put door 45 μL van de celvering uit te delen met behulp van een elektronische meerkanaals leiding. Breng de platen gedurende minimaal 4 uur terug naar de 37 °C, zodat de cellen zich goed aan de putten kunnen hechten voordat ze naar de stimulatie gaan.

7. Secundaire screening: Voorbereiding van de drugsplaat voor dosiscurve met 16 punten (half log)

1. Voeg in een 96-putplaat 270 μL 1X HBSS-medicijnbuffer (1x Hank's Balanced Salt Solution [HBSS], 20 mM HEPES pH 7.4, 1x antibioticum-antimycotisch), met uitzondering van de laatste rij (rij H) van de plaat, zoals weergegeven in figuur 4.
   OPMERKING: Voor peptiden, colloïdale moleculen en slecht in water oplosbare verbindingen wordt de toevoeging van 0,1–1% BSA voorgesteld. Om oxidatie van geneesmiddelen te voorkomen, kan ook tot 0,01% ascorbinezuur worden toegevoegd.
2. Uit de drugsvoorraad, bereiden een drug oplossing (aangeduid als de "Hoge" concentratie) door het berekenen van een laatste 3x concentratie (de uiteindelijke concentratie van het geneesmiddel in de celplaat zal 1x). Als voorbeeld, voor een dosis-respons curve met 10 μM als de hoogste concentratie, bereiden de "Hoge" concentratie op 30 μM. Pipet 300 μL van "Hoge" concentratie in putten in rij H.
3. Bereid in een andere buis de "Lage" concentratie voor, die de "Hoge" concentratie vertegenwoordigt, gedeeld door 3,16 (half-log). Op basis van het vorige voorbeeld zou de "Lage" concentratie 9,49 μM zijn. Pipet 300 μL van "Lage" concentratie in putten in rij H, grenzend aan de "Hoge" putten.
   OPMERKING: Het totale aantal 96-putten dat nodig is in rij H, is afhankelijk van het aantal cellen en stimulatieomstandigheden. Vier putten (twee "Hoog" en twee "Low") hebben voldoende medicijnoplossing om een volledige 384 putplaat te stimuleren.
4. Voer een seriële verdunning uit door 30 μL medicijnoplossing te beluchten van de "Hoge" en "Lage" putten van rij H tot de vorige rij (rij G) en meng door handmatig op en neer te stampen, of zoals aanbevolen, met behulp van een elektronische meerkanaals pipet met de functie "Pipette and Mix". Herhaal deze stap omhoog tot de eerste en meest verdunde rij (rij A), terwijl het weggooien van tips tussen verdunningen.
   OPMERKING: Indien gewenst kunnen de seriële verdunningen worden gestopt vóór rij A, wat een interne controle zonder medicijn vertegenwoordigt, met andere woorden, een "echte nul".
5. Met behulp van figuur 4 als referentie, stimuleren transfected cellen door ppetteren 20 μL van de "Lage" kolom verdunningen van de 96-put plaat naar rijen A-O van de eerder gezaaide 384-put plaat, evenals 20 μL van de "Hoge" kolom verdunningen naar putten B-P. Incubeer de plaat op 37 °C voor een minimum van 16 uur.

8. Secundaire screening: Luminescentielezing en gegevensanalyse

1. Op 16-24 uur na stimulatie, decanteren de transfected cel media door zachtjes flicking de 384-goed plaat over de gootsteen en taping het over een papieren handdoek. Voeg 20 μL/well glo reagens toe en incubeer de plaat bij kamertemperatuur gedurende 5-20 min. Lees de platen met behulp van een microplate luminescentieteller, met een integratietijd van 1 s/well.
2. Exporteer de opgeslagen bestanden vanuit de luminescentieteller als spreadsheet. resultaten worden geregistreerd in relatieve luminescentie-eenheden (RLU). Breng de gegevens van de 384-putplaat over naar een statistiekensoftware om de resultaten te analyseren met behulp van de ingebouwde XY-analyse voor niet-lineaire regressiecurvefit. Selecteer de ingebouwde stimulatiefunctie 3-parameter dosisrespons "Log(agonist) versus respons (drie parameters)",
   
   OPMERKING: Hier boven en onder zijn plateaus in de eenheden van de Y-as, respectievelijk de maximale respons en basale niveau, EC50 is de concentratie van de agonist dat 50% respons genereert tussen Boven en Onder, en X verwijst naar de logconcentratie van de agonist. Dit model gaat ervan uit dat de dosis-respons curve heeft een standaard Hill helling van 1.

Resultaten

Met behulp van de PRESTO-Tango protocol hierin gepresenteerd, een chromafinegranulaat (CG) extract werd gescreend tegen 168 niet-reukGPCR doelen, met de meerderheid wezen weesreceptoren. Profilering van dit extract werd uitgevoerd door het onderzoeken van β-arrestin2 mobilisatie op de gekozen receptoren, gebaseerd op het principe ontworpen door Barnea et al.¹⁸ (Figuur 1). Plasmid cDNA van de GPCRs van belang werd genomen uit de PRESTO-Tango GPCR Kit en gemonteerd in t...

Discussie

De conformatiedynamische GPCRs zijn krachtpatsers van signaaltransductie. De fysiochemische eigenschappen van de bindende zakken van deze heptahelical receptoren, evenals hun fysiologische relevantie onderstrepen de noodzaak van GPCR ligand screening tools. Zoals hierboven gepresenteerd, de PRESTO-Tango test is snel, gevoelig en gebruiksvriendelijk, lenen zich aan de ontwikkeling van geneesmiddelen. Niet alleen meet deze test agonist-geïnduceerde activering, maar het kan ook worden gebruikt om de activiteit van antagonis...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
384 Well Optical Bottom Plates, Polystyrene Polymer Base, Cell Culture Treated, BLACK, with lid, Sterile	NUNC	12-566
384 Well Optical Bottom Plates, Polystyrene Polymer Base, Cell Culture Treated, White, with lid, Sterile	NUNC	12-566-1
384 Well Round Bottom, Polypropylene, Non-Treated, Blue, non-sterile, without lid	ThermoFisher	12-565-390
Antibiotic-Antimycotic	Wisent	450-115-EL
D-Luciferin, sodium salt	GoldBio	LUCNA
DMEM with L-Glutamine, 4.5g/L Glucose and Sodium Pyruvate	Corning	10-013-CV
Eppendorf Xplorer, 12-channel, variable, 15–300 µL	Eppendorf	4861000155
Eppendorf Xplorer, 12-channel, variable, 5–100 µL	Eppendorf	4861000139
Matrix Platemate 2x3	ThermoFisher	801-10001
MicroBeta 1450 Wallac	Perkin Elmer
Penicilin-Streptomycin	Wisent	450-201-EL
Poly-L-Lysine hydrobromide	Millipore-Sigma	P2636-500MG
Roth Lab PRESTO-Tango GPCR Kit	Addgene	Kit #1000000068