We presenteren een murinemodel van hersendoodinductie om de invloed van zijn pathofysiologische effecten op organen en op opeenvolgende grafts in het kader van vaste orgaantransplantatie te evalueren.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Brain Death Inductie bij muizen met behulp van intra-arteriële bloeddruk monitoring en ventilatie via tracheostomie
* These authors contributed equally
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Hoewel zowel levende donatie als donatie na de dood van de bloedsomloop alternatieve mogelijkheden bieden voor orgaantransplantatie, is donatie na donorhersendood (BD) nog steeds de belangrijkste bron voor vaste transplantaties. Helaas, het onomkeerbare verlies van de hersenfunctie is bekend dat meerdere pathofysiologische veranderingen veroorzaken, met inbegrip van hemodynamische evenals hormonale wijzigingen, uiteindelijk leidt tot een systemische ontstekingsreactie. Modellen die een systematisch onderzoek naar deze effecten in vivo mogelijk maken, zijn schaars. We presenteren een murine-model van BD-inductie, dat onderzoek kan helpen naar de verwoestende effecten van BD op de allograft-kwaliteit. Na het uitvoeren van intra-arteriële bloeddrukmeting via de gemeenschappelijke halsslagader en betrouwbare ventilatie via een tracheostomie, wordt BD veroorzaakt door gestaag toenemende intracraniale druk met behulp van een ballonkatheter. Vier uur na BD-inductie kunnen organen worden geoogst voor analyse of voor verdere transplantatieprocedures. Onze strategie maakt een uitgebreide analyse van donor BD in een murinemodel mogelijk, waardoor een diepgaand inzicht in BD-gerelateerde effecten bij vaste orgaantransplantatie mogelijk is en mogelijk de weg wordt vrijgemaakt voor geoptimaliseerde orgaanconditionering.
Inleiding
Transplantatie is momenteel de enige curatieve behandeling voor orgaanfalen in het eindstadium. Tot nu toe, hersendood (BD) patiënten zijn de belangrijkste bron voor orgaandonaties, hoewel levende donatie en donatie na de bloedsomloop dood zijn waardevolle alternatieven1. BD wordt gedefinieerd door een onomkeerbare coma (met een bekende oorzaak), de afwezigheid van hersenstamreflexen en apneu2. Helaas, BD organen tonen inferieure resultaten in de lange termijn graft overleving onafhankelijk van menselijke leukocyten antigeen (HLA)-mismatch en koude ischemische tijd3. Ondertussen is intensief onderzoek naar deze antigeen-onafhankelijke risicofactor uitgevoerd wat resulteert in drie belangrijke aspecten van pathofysiologische veranderingen die als gevolg van BD werden bemiddeld: hemodynamisch, hormonaal enontstekingsgebied 4.
Tot op heden zijn experimentele BD-modellen bij knaagdieren meestal uitgevoerd met ratten. Om meer inzicht te krijgen in de immunologische gevolgen voor vaste organen na BD, wilden we een murinemodel van BD opzetten, omdat momenteel alleen muismodellen uitgebreide onderzoeken naar genetische of immunologische factoren mogelijk maken. In deze context biedt het muissysteem een grotere verscheidenheid aan analytische hulpmiddelen.
Het principe van BD-inductie zoals hier beschreven is gebaseerd op een toename van de intracraniale druk veroorzaakt door de inflatie van een ballonkatheter die onder de schedel wordt ingebracht. Verhoogde intracraniale druk bootst het fysiologische mechanisme van BD na door de perfusie van de cerebrum, cerebellum en hersenstam5,6te blokkeren. Om voldoende perfusie van perifere organen te garanderen, is bloeddrukmeting verplicht tijdens de procedure. De katheter die voor dit doel wordt gebruikt dient tegelijkertijd voor zoute toediening om de bloeddruk te stabiliseren door vloeistofsubstitutie. Aangezien BD gepaard gaat met het stoppen van spontane ademhaling, moet voldoende ventilatie worden gegarandeerd. Een elektrische deken handhaaft fysiologische kernlichaamstemperatuur.
Samengevat zal dit model diepgaande studies mogelijk maken naar de invloed van BD-geïnduceerde schade, op leukocytenmigratie7, complimentactivering8,ischemische reperfusieletsel9en andere factoren.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
Dierproeven werden uitgevoerd in overeenstemming met de principles of Laboratory Animal Care geformuleerd door de National Society for Medical Research en de Guide for the Care and Use of Laboratory Animals opgesteld door de National Academy of Science en gepubliceerd door de National Institutes of Health (NIH Publicatie nr. 86-23, herzien 1985). Alle experimenten werden goedgekeurd door het Oostenrijkse ministerie van Onderwijs, Wetenschap en Cultuur (BMWF-66.011/0071-II/3b/2012).
1. Arteriële katheterisatie
- Verdoof de muis met een intraperitoneale injectie van ketamine en xylazine10 en een pijnstiller volgens de lokale praktijk (bijvoorbeeld buprenorfine). Knijp de achterste ledematen met tangen om de juiste diepte van anesthesie te bevestigen.
OPMERKING: Voor deze studie werden mannelijke C57BL/6N muizen gebruikt op de leeftijd van 8−12 weken (gewicht 20−25 g). De auteurs hebben mannelijke BALB/c van de zelfde leeftijd niet succesvol getest maar hebben geen andere spanningen geprobeerd (zie Bespreking). - Verwijder het haar in de gebieden van belang (hoofd, nek) met behulp van een elektrisch scheermes. Zorg ervoor dat er geen los haar overblijft om wondbesmetting te voorkomen. Desinfecteer vervolgens het chirurgische veld met 70% ethanol/chlorhexidine/ betadine en plaats de muissupine met het hoofd tegenover de chirurg.
- Maak een cervicale middellijn incisie met het ontleden van een schaar.
- Ontleed de submdibulaire klieren en nekspierweefsel en scheid ze om de gemeenschappelijke halsslagader bloot te leggen. Gebruik meestal botte dissectie via tangen.
- Plaats drie 8-0 zijde ligaturen onder de juiste gemeenschappelijke halsslagader.
- Plaats een klem op de proximale ligatuur en breng spanning in de slagader, zodat de stroom wordt opgeschort.
- Sluit de meest distale ligatuur.
- Steek de arteriële katheter door een klein, voorgevormd huidgat op het schedelaspect van de incisie. Knijp en vervorm het lumen van de katheter als het te groot lijkt om de terugstroom van de bloedstroom te verminderen. Fixeren met alle drie de ligaturen.
- Fixer de katheter op de huid om dislocatie te voorkomen. Doe dit door een hechting (bijvoorbeeld 5-0 monofilament, niet-absorberend) te gebruiken die de katheter met de huid verbindt in het gebied van het voorgevormde huidgat.
2. Tracheostomie
- Ontleed de pre-tracheale spierstelsel bot weg met behulp van tangen.
- Plaats twee 8-0 zijdeligaturen onder de luchtpijp.
- Tracheotomize met behulp van micro schaar zo proximale mogelijk om eenzijdige ventilatie te voorkomen. Gebruik een horizontale snijlijn tussen twee tracheale kraakbeen.
- Steek de ventilatiebuis in en fixeer met beide voorbereide ligaturen.
LET OP: Het proximale uiteinde van de luchtpijp hoeft niet te worden vastgemaakt. - Sluit de huid met een lopende hechting (bijvoorbeeld 6-0 monofilament, niet-absorberend).
- Ventileer de muis met een frequentie van 150/min en een getijdenvolume van 200 μL.
3. Hersendood inductie
- Schik de muis op de gevoelige positie.
- Verwijder de huid van de schedel met behulp van een chirurgische schaar en tangen om de huid vast te houden.
- Boor een 1 mm kaliber boorgat paramediaal boven de linker pariëtale cortex. Stop met boren voordat u het binnenste compacte bot en de dura mater doorbreekt.
- Doordringt de laatste weefselbrug van de schedel met behulp van stompe tangen, het verwijderen van scherpe randen.
- Plaats de ballonkatheter, zodat deze zich volledig in de schedelholte bevindt. Zorg ervoor dat de ballon is voorgevuld met zouten en alle lucht wordt geëvacueerd.
- Begin de inflatie bij ~0,1 mL/min over een periode van 10−15 min (totaal volume van 0,8−1,2 mL) met behulp van een spuitpomp.
LET OP: De muis zal vertonen myoclonus, mydriasis, verdere inbeslagneming activiteit en agonaal snikken. - Spreek de muis hersenen dood zodra de staart van de muis is stijf gegaan en opgericht.
OPMERKING: BD wordt bevestigd door een karakteristieke initiële bloeddrukpiek (Cushing reflex), de afwezigheid van hersenstamreflexen en spontane ademhaling. Regelmatige apneutesten moeten tijdens experimenten worden vermeden, omdat muizen in stabiele circulatie kunnen worden als gevolg van een gebrek aan zuurstof. - Stop de inflatie van de ballonkatheter.
- Leg een verwarmingsdeken over de muis om onderkoeling te voorkomen.
4.
- Controleer en documenteer regelmatig de bloeddruk. Sluit muizen met een langdurige hypotensieve fase uit (gemiddelde arteriële druk [MAP] < 50 mmHg voor >30 min).
- Infuus 0,1 mL zout om de 30 min om de bloeddruk van de muis te stabiliseren.
LET OP: In totaal werd in deze studie 0,8 mL zout oplossing toegediend aan elke muis. - Na 4 uur BD-duur, oogst muisorganen / weefsels. Sluit de muis uit van het experiment als het hart van de muis niet klopt aan het einde van het experiment.
5. Schijnprocedure
- Uitvoeren van stappen 1.1−3.3.
LET OP: Open het binnenste compacte bot niet. Plaats een ballonkatheter niet in of blaas deze niet op. - Blijf dicht bij de muis en observeer het dier voortdurend. Knijp herhaaldelijk de achterste ledematen met tangen om de juiste diepte van anesthesie te bevestigen. Breng extra anesthesie onderhuids aan (ongeveer 1/2 van de startdosis) als de muis tekenen van ontwaken vertoont, wat naar onze ervaring ongeveer na 2-3 uur na anesthesie gebeurt.
- Breng dezelfde hoeveelheid intraveneuze zoutsoorten aan als bij de BD-muizen.
LET OP: De sham muis zal weer spontane ademhaling na stopzetting van de ventilatie. De BD muis niet. Apneu testen moet worden gedaan tijdens de vaststelling van het model, maar tijdens experimenten moet worden vermeden als gevolg van onnodige fysiologische stress.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Het murine BD model werd met succes meer dan 100 keer uitgevoerd met een slagingspercentage van meer dan 90%. Bovendien is postinterventionele orgaantransplantatie van hart en nieren veilig uitgevoerd7.
BD induceert een verscheidenheid aan pathofysiologische veranderingen die verder kunnen worden onderzocht met behulp van dit model. Zoals blijkt uit figuur 1, de bloeddruk too...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
BD, een risicofactor voor allograft kwaliteit bij multi-orgaandonoren, brengt een overvloed aan pathofysiologische veranderingen met zich mee, die alleen voldoende kunnen worden beoordeeld met behulp van in vivo modellen. Hemodynamische veranderingen, cytokine storm, hormonale veranderingen en hun uiteindelijke impact op orgaangraft kwaliteit en overleving kan niet worden geanalyseerd in vitro4. De meerderheid van de basistransplantatie en immunologisch onderzoek is afhankelijk van geavanceerde di...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs hebben niets te onthullen.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| Arteriale katheter (BD Neoflon 26G) | BD | 391349 | |
| Bloeddruk Transducers (APT300) | Harvard Apparatus Inc. | 73-3862 | |
| Fogarty Arterial Embolectomy Katheter N° 3 | Edwards Lifesciences Corporation | 120403F | |
| Pincet | FST | 11271-30 | |
| Homeothermische dekensystemen met flexibele sonde | Harvard Apparatus Inc. | 55-7020 | |
| Ketansol | Graeub | 6680110 | |
| Micro schaar | FST | 15018-10 | |
| Naaldhouder | FST | 12060-02 | |
| Prolene 5-0 | Ethicon | 8698H | |
| Pomp 11 Elite Infusie Alleen Enkel | Harvard Apparatus Inc. | 70-4500 | |
| Schaar | FST | 14075-11 | |
| Stereotactisch microscoop | Olympus | SZX7 | |
| Transpore Tape | 3M | 1527-1 | |
| Onderlaken | Molinea.A | 274301 | |
| Ventilator voor muizen (MiniVent Model 845) | Harvard Apparatus Inc. | 73-0043 | |
| Xylasol | Graeub | 7630109 |
Referenties
- Hart, A., et al. OPTN/SRTR 2017 Annual Data Report: Kidney. American Journal of Transplantation. 19 (Suppl 2), 19(2019).
- The Quality Standards Subcommittee of the American Academy of Neurology. Practice parameters for determining brain death in adults (summary statement). Neurology. 45 (5), 1012-1014 (1995).
- Terasaki, P. I., Cecka, J. M., Gjertson, D. W., Takemoto, S. High survival rates of kidney transplants from spousal and living unrelated donors. New England Journal Medicine. 333 (6), 333-336 (1995).
- Pratschke, J., Neuhaus, P., Tullius, S. G. What can be learned from brain-death models? Transplant International. 18 (1), 15-21 (2005).
- Wilhelm, M. J., et al. Activation of the heart by donor brain death accelerates acute rejection after transplantation. Circulation. 102 (19), 2426-2433 (2000).
- Pomper, G., et al. Introducing a mouse model of brain death. Journal of Neuroscience Methods. 192 (1), 70-74 (2010).
- Ritschl, P. V., et al. Donor brain death leads to differential immune activation in solid organs but does not accelerate ischaemia-reperfusion injury. Journal of Pathology. 239 (1), 84-96 (2016).
- Atkinson, C., et al. Donor brain death exacerbates complement-dependent ischemia/reperfusion injury in transplanted hearts. Circulation. 127 (12), 1290-1299 (2013).
- Oberhuber, R., et al. Treatment with tetrahydrobiopterin overcomes brain death-associated injury in a murine model of pancreas transplantation. American Journal of Transplantation. 15 (11), 2865-2876 (2015).
- Floerchinger, B., et al. Inflammatory immune responses in a reproducible mouse brain death model. Transplant Immunology. 27 (1), 25-29 (2012).
- Steen, P. A., Milde, J. H., Michenfelder, J. D. No barbiturate protection in a dog model of complete cerebral ischemia. Annals of Neurology. 5 (4), 343-349 (1979).
- Cooper, D. K., Novitzky, D., Wicomb, W. N. The pathophysiological effects of brain death on potential donor organs, with particular reference to the heart. Annals of the Royal College of Surgeons of England. 71 (4), 261-266 (1989).
- Herijgers, P., Leunens, V., Tjandra-Maga, T. B., Mubagwa, K., Flameng, W. Changes in organ perfusion after brain death in the rat and its relation to circulating catecholamines. Transplantation. 62 (3), 330-335 (1996).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
