Synthese van gefunctionaliseerde magnetische nanodeeltjes, hun vervoeging met de Siderophore Feroxamine en de evaluatie voor bacteriën detectie

Samenvatting

Dit werk beschrijft protocollen voor de bereiding van magnetische nanodeeltjes, de coating met SiO₂, gevolgd door de amine functionalisatie met (3-aminopropyl)triethoxysilane (APTES) en de vermenging met deferoxamine met behulp van een succinyl moiety als linker. Een diepe structurele karakteriseringsbeschrijving en een vangstbacteriëntest met behulp van Y. enterocolitica voor alle tussenliggende nanodeeltjes en de uiteindelijke conjugaat worden ook in detail beschreven.

Samenvatting

In het huidige werk, de synthese van magnetische nanodeeltjes, de coating met SiO₂, gevolgd door de amine functionalisatie met (3-aminopropyl)triethoxysilane (APTES) en de vervoeging met deferoxamine, een siderophore erkend door Yersinia enterocolitica, met behulp van een succinyl moiety als een linker worden beschreven.

Magnetische nanodeeltjes (MNP) van magnetiet (Fe₃O₄) werden bereid volgens de solvothermale methode en bekleed met SiO₂ (MNP@SiO₂) met behulp van het Stöber-proces gevolgd door functionalisatie met APTES (MNP@SiO₂@NH₂). Vervolgens werd feroxamine geconjugeerd met de MNP@SiO₂@NH₂ door carbodiimide koppeling om MNP@SiO₂@NH₂@Fa te geven. De morfologie en eigenschappen van de conjugaat en tussenproducten werden onderzocht door acht verschillende methoden, waaronder poeder X-Ray diffractie (XRD), Fourier transformeren infrarood spectroscopie (FT-IR), Raman spectroscopie, Röntgenfoto elektronenspectroscopie (XPS), transmissie elektronenmicroscopie (TEM) en energiedispersieve X-Ray (EDX) mapping. Deze uitputtende karakterisering bevestigde de vorming van het conjugaat. Ten slotte, om de capaciteit en specificiteit van de nanodeeltjes te evalueren, werden ze getest in een vangst bacteriën test met behulp van Yersinia enterocolitica.

Inleiding

De bacteriedetectiemethoden met behulp van MNP zijn gebaseerd op de moleculaire herkenning van antilichamen, aptamers, bioproteïne, koolhydraten die door de pathogene^bacteriënaan MNP worden geconjugeerd. Rekening houdend met het feit dat siderophores worden herkend door specifieke receptoren op het buitenste membraan van bacteriën, kunnen ze ook gekoppeld zijn aan MNP om hun specificiteit te verhogen². Siderophores zijn kleine organische moleculen die betrokken zijn bij de Fe³⁺ opname door bacteriën^3,4. De voorbereiding van conjugaten tussen siderophores en MNP samen met hun evaluatie voor het vangen en isoleren van bacteriën is nog niet gemeld.

Een van de cruciale stappen in de synthese van conjugaten van magnetische nanodeeltjes met kleine moleculen is de selectie van het type binding of interactie tussen hen om ervoor te zorgen dat het kleine molecuul is bevestigd aan het oppervlak van de MNP. Om deze reden was de procedure voor de voorbereiding van de conjugaat tussen magnetische nanodeeltjes en feroxamine - de siderophore erkend door Yersinia enterocolitica- gericht op het genereren van een aanpasbaar oppervlak van de MNP om het covalent te koppelen aan de siderophore door carbodiimide chemie. Om een uniforme magnetiet nanodeeltjes (MNP) te krijgen en om de nucleatie- en groottecontrole te verbeteren, werd een solvolysereactie met benzylalcohol in een thermisch blok gedragen zonder te schudden⁵. Vervolgens werd een silica coating gegenereerd door Stöber methode om bescherming te verlenen en de stabiliteit van de nanodeeltjes suspensie in waterige media⁶te verbeteren. Rekening houdend met de structuur van de feroxamine is de introductie van aminegroepen noodzakelijk om geschikte nanodeeltjes (MNP@SiO₂@NH₂) te produceren die met de zijroprhore moeten worden geconjugeerd. Dit werd bereikt door condensatie van (3-aminopropyl)triethoxysilane (APTES) met de alcoholgroepen die aanwezig zijn op het oppervlak van de silica gemodificeerde nanodeeltjes (MNP@SiO₂) met behulp van een sol-gel methode⁷.

Tegelijkertijd werd het feroxamineijzer(III) complex bereid door de complexiteit van de commercieel verkrijgbare deferoxamine met ijzeracetylacetonaat in waterige oplossing. NN-succinylferoxamine, met succinylgroepen die als linkers zullen fungeren, werd verkregen door de reactie van feroxamine met barnische anhydride.

De conjugatie tussen MNP@SiO₂@NH₂ en N-succinylferoxamine om MNP@SiO₂@NH_@Fa te geven werd uitgevoerd door middel van carbodiimide chemie met behulp van als koppeling reagentia benzotriazole-1-yl-oxy -tris-(dimethylamino)-fosfonium hexafluorfosfaat (BOP) en 1-hydroxybenzotriazool (HOBt) in een zachte basismedia om de terminalzuurgroep in N-succinylferoxamine⁸te activeren. N

Zodra de parlementsleden werden gekarakteriseerd, evalueerden we de mogelijkheden van kale en gefunctionaliseerde magnetische nanodeeltjes om wild type (WC-A) en een mutant van Y. enterocolitica zonder feroxaminereceptor FoxA (FoxA WC-A 12-8) vast te leggen. Gewone parlementsleden, gefunctionaliseerde parlementsleden en de conjugaat MNP@SiO₂@NH_@Fa mochten communiceren met elke Y. enterocolitica stam. De bacteriën-conjugaat aggregaten werden gescheiden van de bacteriën suspensie door de toepassing van een magnetisch veld. De gescheiden aggregaten werden twee maal gespoeld met fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS), opnieuw opgehangen in PBS om seriële verdunningen voor te bereiden en vervolgens werden ze verguld voor het tellen van kolonies. Dit protocol toont elke stap van de synthese van MNP@SiO₂@NH@Fa, de structurele karakterisering van alle tussenproducten en de conjugaat, en een bacterievangsttest als een gemakkelijke manier om de specificiteit van het conjugaat ten opzichte van de tussenproducten te evalueren. ^9.

Protocol

OPMERKING: Voor de reacties die onder inerte atmosfeeromstandigheden worden uitgevoerd, werd al het glaswerk eerder gedroogd in een oven bij 65 °C, verzegeld met een rubberen septum en drie keer met argon gezuiverd.

1. Synthese van magnetische nanodeeltjes geconjugeerd met feroxamine

1. Synthese van Fe₃O₄ magnetische nanodeeltjes (MNP's)
   1. Voeg 0,5 g Fe(acac)₃ toe in een glazen flacon van 20 mL en meng vervolgens met 10 mL benzylalcohol.
   2. Soniceer dit mengsel gedurende 2 minuten, breng vervolgens over op een verwarmingsblok en verwarm 72 uur op 180 °C.
   3. Laat de flesjes afkoelen, spoel de nanodeeltjes af met 96% ethanol en centrifuge bij 4000 x g gedurende 30 minuten. Herhaal de centrifugatie minstens tweemaal.
   4. Scheid de nanodeeltjes van de supernatant door magnetische aantrekkingskracht met behulp van een neodymium (NdFeB) magneet en gooi het resterende oplosmiddel.
   5. Spoel af met 96% ethanol herhalen stap 1.1.4. en gooi de supernatant af die afgewisseld wordt met sonicatie in een bad gedurende 1 min op 40 kHz totdat het oplosmiddel er duidelijk uitziet.
2. Magnetische nanodeeltjes SiO₂ coating (MNP@SiO₂)
   1. Bereid een suspensie van 2 g MNP in 80 mL isopropanol en voeg vervolgens 4 mL van 21% ammoniak, 7,5 mL gedestilleerd water en 0,56 mL tetraethyl orthosilicaat (TEOS) (in deze volgorde) toe in een ronde bodemkolf met een magnetische roerstaaf.
   2. Verwarm het mengsel 2 uur met continu roeren op 40 °C en vervolgens 1 uur sonisch.
   3. Scheid de MNP met een magneet, gooi het supernatant weg en verdeel deze in 30 mL isopropanol.
   4. Herhaal stap 1.2.1. en 1.2.2.
   5. Verwijder en was de magnetische roerstaaf met 96% ethanol om al het materiaal terug te krijgen.
   6. Scheid de nanodeeltjes van de supernatant door magnetische aantrekkingskracht met behulp van een magneet.
   7. Gooi de supernatant weg en spoel de nanodeeltjes met 96% ethanol drie keer afgewisseld met sonicatie.
   8. Droog de nanodeeltjes onder vacuüm op kamertemperatuur gedurende 12 uur.
3. Functionalisatie van MNP@SiO₂ met (3-aminopropyl)triethoxysilane (APTES)
   1. Spoel 500 mg van de MNP@SiO₂ verkregen uit de vorige stap met N,N-dimethylformamide (DMF) onder inerte atmosfeer en sonicate vervolgens gedurende 1 min op 40 kHz. Gooi vervolgens de supernatant weg en herhaal dit proces drie keer.
   2. Stel de deeltjes opnieuw op in een ronde bodemkolf, onder roeren met een magnetische roerstaaf en voeg 9 mL APTES toe.
   3. Roer het mengsel 12 uur op 60 °C.
   4. Gooi de supernatant weg en spoel de nanodeeltjes met 96% ethanol drie keer afgewisseld met sonicatie.
4. Synthese van feroxamine
   1. Los 100 mg (0,15 mmol) deferoxamine mesylaatzout en 53,0 mg (0,15 mmol) Fe(acac) 3 op₅ mL gedestilleerd water op en roer het mengsel 's nachts op kamertemperatuur.
   2. Was het resulterende product drie maal met 20 mL EtOAc in een scheidingstrechter en verwijder het organische oplosmiddel onder vacuüm met behulp van een rotator.
   3. Vriesdroog de waterige fase om feroxamine als rode vaste stof te betalen.
5. Synthese Nvan N-succinylferoxamine
   1. Voeg 350 mg (3,50 mmol) barnsteenzuurzuur uit aan een oplossing van 100 mg feroxamine in 5 mL pyridine in een 50 mL afgeronde kolf onder inerte atmosfeer.
   2. Roer het resulterende mengsel 16 uur op kamertemperatuur. Na die tijd, verwijder de overmaat van pyridine onder verminderde druk in een rotatory verdamper om een donkerrode vaste stof te geven.
   3. Los de reactie ruwe in 3 mL van methanol.
   4. Breng de methanoloplossing over in een Sephadex-kolom (20 cm Sephadex in een kolom met een diameter van 20 mm) en elute op 0,5 mL/min.
   5. Verzamel de rode fractie en verwijder de methanol onder vacuüm met behulp van een rotatorverdamper.
6. Synthese van de conjugaat MNP@SiO₂@NH@Fa
   1. Spoel 30 mg droge MNP@SiO₂@NH₂ twee maal met DMF en soniceer de nanodeeltjes in een Erlenmeyer-kolf van 100 m L gedurende 30 minuten onder inerte atmosfeer.
   2. Bereid een oplossing voor van N-succinylferoxamine (200 mg, 0,30 mmol), benzotriazool-1-yl-oxy-tris-(dimethylamino)-fosfoniumhexafluofofofofofosfaat (BOP, 173 mg, 0,45 mmol), 1-hydroxybenzotriazool (HOBt, 46 mg, 0,39 mmol) en N,N-diisopropylethylamine (DIPEA, 128,8 mg, 1,21 mmol) in 10 mL DMF (Mix A) in een 50 mL ronde kolf onder inert atmosfeer. N
   3. Hang de eerder gespoelde MNP@SiO₂@NH₂ in 3 mL DMF onder sonicatie in droge omstandigheden met behulp van een argongasatmosfeer (Mix B).
   4. Voeg mix A toe om B dropwise te mengen.
   5. Schud het uiteindelijke mengsel met behulp van een orbitale shaker bij kamertemperatuur 's nachts.
   6. Scheid de resulterende conjugaat (MNP@SiO₂@NH@Fa) met behulp van een magneet van de suspensie.
   7. Spoel de resulterende vaste stof en vervolgens, sonicate het vijf keer met 10 mL ethanol.
   8. Droog de vaste stof onder vacuüm gedurende 24 uur.

2. Bacteriële test met Y. enterocoliticastammen om de vangst van pathogene bacteriën met nanodeeltjes te kwantificeren

1. Bereid een suspensie van alle tussenliggende nanodeeltjes en de uiteindelijke conjugaat in PBS op 1 mg/mL in steriele 2 mL buizen.
2. Bereid een cultuur van Y. enterocolitica voor in 5 mL Luria Bertani (LB) bouillon 's nachts uitbroeden bij 37 °C.
3. Bereid een 5 mL ijzertekort tryptische sojabouillon (TSB) door toevoeging van 50 μL van 10 mM 2,2′-bipyridyl.
4. Inenting de 5 mL van ijzertekort TSB met 50 μL van de nachtelijke cultuur van Y. enterocolitica en vervolgens, incubeer bij 37 °C met agitatie tot een OD₆₀₀ = 0,5\u20120.8 wordt bereikt.
5. Neem 100 μL van de cultuur verkregen in stap 2.4 en verdun in een 2,0 mL buis met 900 μL PBS om een eerste 1/10 verdunning te verkrijgen. Bereid vervolgens een verdunning van 1/100 van de eerste verdunning met dezelfde procedure om een concentratie bacteriële cellen te krijgen bij 1 x 10⁶ Colony Forming Units (CFU)/mL ongeveer.
6. Voeg 100 μL nanodeeltjes suspensie toe bij 1 mg/mL tot 1 mL van de 1/100 verdunning van bacteriële suspensie in een buis van 2,0 mL en homogeniseren met vortex.
7. Broed de cultuur op 20 °C voor 1 uur.
8. Scheid de MNP/bacterieaggregaten met behulp van een magneet en gooi de supernatant voorzichtig weg.
9. Spoel de gescheiden nanodeeltjes twee keer af met 1 mL PBS met behulp van een vortex.
10. Hang de nanodeeltjes op in 1 mL PBS om de hoeveelheid bacteriële afvang in CFU/mL te tellen.
11. Bereid vier opeenvolgende 1/10 verdunningen van de voormalige suspensie tot een 1 x 10^-4 verdunning is bereikt.
12. Plaat 10 μL van elke verdunning op TS agarplaten en incuberen ze 's nachts bij 37 °C.
13. Fotografeer de plaat met een gel digitalisator in epi witte modus. Verwerk de afbeelding met een geschikte software om een plek te versterken om het aantal afzonderlijke kolonies te tellen.
    LET OP: Elke MNP intermediair werd gekenmerkt om de voortgang van de synthese op te volgen. Ten eerste werden kale parlementsleden door XRD bestudeerd om de kristallijne structuur te controleren. Vervolgens werd het FT-IR-spectrum van elke tussenpersoon uitgevoerd om de veranderingen te controleren die zich in de overeenkomstige reactie hebben voorgedaan. Raman spectroscopie analyse van elke intermediair werd ook uitgevoerd om de conclusies afgeleid van FT-IR spectra te bevestigen. TGA analyse stelde ons in staat om het gewichtsverlies van de tussenproducten met organisch materiaal in de structuur te schatten. De morfologie en grootte van elke intermediair werd bestudeerd door TEM. Ten slotte was de XPS-analyse van cruciaal belang om de atomoxidatietoestanden op elk MNP-tussenoppervlak te bepalen en de covalente bindingsvorming in de conjugaat MNP@SiO₂@NH@Fa te bevestigen.

Resultaten

Een uitputtende structurele karakterisering wordt uitgevoerd om de morfologie en de eigenschappen van elke tussenliggende en de uiteindelijke conjugaat te bepalen. Hiervoor worden de technieken XRD, FT-IR, Raman spectroscopie, TGA, TEM, EDX mapping en XPS gebruikt om de vorming van de conjugaat aan te tonen. De oxidatietoestanden van de atomen aan het oppervlak van de nanodeeltjes die door röntgenfotoelectronspectroscopie (XPS) worden verworven, zijn de meest relevante gegevens om de vorming van covalente bindingen tusse...

Discussie

Dit protocol beschrijft de synthese van een conjugaat tussen magnetische nanodeeltjes en de siderophore feroxamine door covalente binding. De synthese van magnetiet werd uitgevoerd met behulp van het protocol gerapporteerd door Pinna et al.⁵ gevolgd door silica coating om de magnetische kern van corrosie in waterige systemen te beschermen, om de aggregatie te minimaliseren en om een geschikt oppervlak voor functionalisatie⁶te bieden. Het silica coating proces werd aangepast...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
1-Hydroxybenzotriazole hydraat HOBT	Acros	300561000
2,2′-Bipyridyl	Sigma Aldrich	D216305
3-Aminopropyltriethoxysilaan 99%	Acros	151081000
Ammoniumhydroxide-oplossing 28% NH3	Sigma Aldrich	338818
Benzotriazol-1-yloxytris(dimethylamino)-fosfonium hexafluorofosfaat BOP Reagens	Acros	209800050
Benzylalcohol	Sigma Aldrich	822259
Deferoxamine metylaat zout >92,5% (TLC)	Sigma Aldrich	D9533
Ethanol, anhydrisch, 96%	Panreac	131085
Ethylacetaat, Extra Puur, SLR, Fisher Chemical
IJzer(III) acetylacetonaat 97%	Sigma Aldrich	F300
LB Broth (Lennox)	Sigma Aldrich	L3022
N,N-Diisopropylethylamine, 99,5+%, AcroSeal	Acros	459591000
N,N-Dimethylformamide, 99,8%, Extra Droog, AcroSeal	Acros	326871000
Pyridine, 99,5%, Extra Droog, AcroSeal	Acros	339421000
Sephadex LH-20	Sigma Aldrich	LH20100
Bernsteenzuuranhydride >99%	Sigma Aldrich	239690
Tetraethylorthosilicaat >99,0%	Sigma Aldrich	86578