Hier presenteren we een protocol om eIF4E-eIF4G-interactie in levende cellen te meten waarmee de gebruiker door geneesmiddelen veroorzaakte verstoring van de complexe dynamiek van eIF4F in screeningsformaten kan evalueren.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Monitoring van eIF4F-assemblage door eIF4E-eIF4G-interactie in levende cellen te meten
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
De vorming van het eIF4F-complex is het belangrijkste stroomafwaartse knooppunt gebleken voor de convergentie van signaleringsroutes die vaak oncogene activering bij de mens ondergaan. eIF4F is een cap-binding complex dat betrokken is bij de mRNA-ribosoom wervingsfase van vertaalinitiatie. In veel cellulaire en preklinische modellen van kanker leidt de deregulering van eIF4F tot een verhoogde vertaling van specifieke mRNA-subsets die betrokken zijn bij de proliferatie en overleving van kanker. eIF4F is een hetero-trimerisch complex gebouwd van de cap-bindende subeenheid eIF4E, de helicase eIF4A en de steigersubeenheid eIF4G. Cruciaal voor de assemblage van actieve eIF4F-complexen is de eiwit-eiwitinteractie tussen eIF4E- en eIF4G-eiwitten. In dit artikel beschrijven we een protocol voor het meten van eIF4F-assemblage dat de status van eIF4E-eIF4G-interactie in levende cellen bewaakt. De eIF4e:4G-celgebaseerde eiwit-eiwitinteractietest maakt het ook mogelijk om door geneesmiddelen geïnduceerde veranderingen in de complexe integriteit van eIF4F nauwkeurig en betrouwbaar te beoordelen. We stellen ons voor dat deze methode kan worden toegepast voor het verifiëren van de activiteit van commercieel beschikbare verbindingen of voor verdere screening van nieuwe verbindingen of modaliteiten die de vorming van eIF4F-complex efficiënt verstoren.
Inleiding
Controle van genexpressie speelt een cruciale rol bij de juiste uitvoering van cellulaire programma's zoals groeiproliferatie en differentiatie. Een regelgevend controlemechanisme kan worden uitgeoefend op het niveau van gentranscriptie of op het niveau van mRNA-vertaling. In het laatste decennium is het steeds duidelijker geworden dat translationele controle door modulatie van het initiatieproces in plaats van de latere stappen van verlenging en beëindiging de synthese van specifieke subsets van eiwitten die een breed scala aan biologische functies spelen, fijn kan reguleren.
Verhoogde vertaling van mRNAs die betrokken zijn bij overleving, anti-autofaagische en anti-apoptotische reacties zijn betrokken bij verschillende kankers en zijn ook oorzakelijk gekoppeld aan afwijkende activering of overexpressie van vertaalinitiatiefactoren1.
Het eIF4F-complex is een hoofdregulator voor het initiëren van vertalingen. Door de cap-structuur aan het 5'-uiteinde van mRNAs te binden, drijft eIF4F de initiële mRNA-ribosoomwerving aan en verhoogt het op zijn beurt de mRNA-vertaalefficiëntie van zwak vertaalde eukaryotische mRNAs2. eIF4F-gemedieerde vertaling van kankergerelateerde mRNAs is gemeld voor veel kankermodellen die afwijkende activering van RAS/MAPK- of AKT/TOR-trajecten bevatten, wat suggereert dat kankercellen eIF4F upreguleren om hun eigen pro-neoplastische activiteit te stimuleren. Verstoring van deze feed-forward loop door het remmen van de complexe vorming van eIF4F is daardoor een veelbelovende therapeutische strategie3,4.
Het eIF4F-complex bestaat uit (i) eIF4E, de cap-bindende subeenheid van eIF4F die interageert met de capstructuur van de 5' UTR van mRNA, (ii) eIF4A, de RNA helicase en (iii) eIF4G, het steigereiwit dat interageert met zowel eIF4A als eIF4E en dat uiteindelijk de 40S ribosomale subeenheid5werft . eIF4G-associatie met eIF4E is de tariefbeperkende stap voor de assemblage van functionele eIF4F-complexen en wordt negatief gereguleerd door de eIF4E-bindende eiwitten (4EBPs, leden 1, 2 en 3))6. Door te concurreren met eIF4G binding aan eIF4E via een interface die bestaat uit canonieke en niet-canonieke eIF4E bindingssequenties7,8,9 (regio met aa 604-646 op menselijke eIF4E), vermindert 4EBP de pool van eIF4E die actief betrokken is bij vertaling en het voorkomen van eIF4F complexe vorming. Het samenspel van deze eiwit-eiwitinteracties wordt voornamelijk gereguleerd door het zoogdierdoel van rapamycine (mTOR)-gemedieerde fosforylering van 4EBP. Bij mitogene stimuli fosforyleert mTOR rechtstreeks de leden van de 4E-BP-eiwitfamilie, vermindert hun associatie met eIF4E en bevordert daardoor de interactie tussen eIF4E en eIF4G en de vorming van functionele eIF4F-complexen10.
Ondanks de grote inspanningen bij het ontwikkelen van verbindingen gericht op eIF4F-complexe integriteit, heeft het gebrek aan assays die directe verstoring van eIF4E-eIF4G-interactie in levende cellen meten, de zoektocht naar cellulaire actieve hitverbindingen beperkt. We hebben een luciferase-test toegepast op basis van een coelenterazine-analoog (bijv. op Nanoluc gebaseerde complementatietest) om de status van eIF4F-integriteit in realtime te controleren via de eIF4E-eIF4G-interactie. Het luciferase complementatie eiwitsysteem bestaat uit een 18 kDa eiwitfragment (SubA) en 11 aminozuur peptide fragment (SubB) geoptimaliseerd voor minimale zelfassociatie en stabiliteit11. Eenmaal uitgedrukt als een fusieproduct met de menselijke full length eIF4E en het eIF4E interactiedomein van menselijke eiF4G1 (aa 604-646), zullen de twee interagerende eiwitten het SubA- en SubB-fragment dicht bij elkaar brengen en de vorming van de actieve luciferase induceren die, in aanwezigheid van een celdoorlatend substraat, uiteindelijk een helder lichtgevend signaal zal genereren (Figuur 1). We hebben elders melding gemaakt van de constructie en validatie van het eIF4E:eIF4G604-646 complementatiesysteem16.
Hier beschrijven we hoe het eIF4E:eIF4G604-646 complementatiesysteem (beschikbaar op aanvraag) kan worden toegepast om 4EBP1-gemedieerde eIF4E-eIF4G-verstoring in levende cellen nauwkeurig te meten. Bovendien tonen we het nut ervan aan door de effecten te meten van verschillende mTOR-remmers die momenteel worden getest als potentiële kankertherapeutische geneesmiddelen12. Omdat off-target effecten vaak drugspecifieke activiteit maskeren, beschrijven we ook hoe de veelzijdigheid van de eIF4E:eIF4G604-646 systeemmeting kan worden uitgebreid met orthogonale metingen van cellulaire levensvatbaarheid om hiermee rekening te houden.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
HEK293 cellijn werd gebruikt voor het protocol en werd gekweekt in Dulbecco's Modified Eagle Medium aangevuld met 10% Foetale Runderserum, 2 mM L-glutamine en 100 U/ml penicilline/streptomycine. Cellen werden gekweekt bij 37 °C met 5% CO2 in een bevochtigde omgeving.
1. Kwantitatieve beoordeling van complexe verstoringen van eIF4F via eIF4E:eIF4G604-646 complementatietest
- Celkweek en transiënte transfectie van eIF4E:eIF4G604-646 complementatietest
- Gebruik vers ontdooide cellen met minder dan 20 passages voor alle experimenten. Bepaal op dag 1 het celnummer met behulp van een standaardcelteller en tel de totale levensvatbare cellen met behulp van de trypan blauwe uitsluitingsmethode13.
- Zaai 6-put platen met 0,9 - 1,2 x 106 HEK 293 cellen per put in 2 ml standaard groeimedium.
OPMERKING: Om de beste transfectie-efficiëntie binnen de hierboven aangegeven cellijnen te bereiken, moet u ervoor zorgen dat de geplateerde cellen de dag na het zaaien 70-90% samenvloeien. - Op de ochtend van dag 2, co-transfect cellen met SubA-eIF4E en eIF4G604-646-SubB plasmide met behulp van een lipide-gebaseerde transfectie reagens (zie Tabel van materialen) zoals hieronder beschreven.
- Verdun 9 μL oplossing op basis van liposoom in een buis met 125 μL gereduceerd serummedium zonder fenolrood (zie tabel met materialen)voor elke transfectie en incubeer bij kamertemperatuur gedurende 5 minuten.
- Bereid de mastermix van DNA voor door 3 μg van elke plasmide te verdunnen in 125 μL gereduceerd serummedium voor elke transfectiebuis.
- Voeg 12 μL versterkerreagentia toe aan de DNA-mastermixbuis, meng goed en voeg onmiddellijk het DNA: enhancer master mix toe aan elke tube verdunde liposomen in een verhouding van 1:1. Incubeer gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur.
- Voeg het DNA-lipidencomplex toe aan elke put en incubeer de cellen in een incubator van 37 °C met 5% CO2 gedurende 24 uur.
- Spoel op de ochtend van dag 3 elke put af met 1 ml PBS.
- Verwijder de PBS en incubeer cellen in elke put met 0,3 ml trypsine gedurende 5 minuten bij 37 °C.
- Neutraliseer trypsine door 2 ml van het gereduceerde serummedium toe te voegen zonder fenolrood met 0% FCS in elke put en breng getransfecteerde cellen over in een buis van 15 ml.
OPMERKING: Fenolrood kan interfereren met de luciferase-activiteit; daarom moeten cellen vanaf deze stap in medium worden behandeld zonder fenolrood. - Draai cellen gedurende 5 minuten op 290 x g en aspireer het medium. Resuspendeer de cellen in 2 ml van het gereduceerde serummedium zonder fenolrood dat 0% FCS bevat. Tel zoals beschreven in stap 1.1.
- Zaad transfecteerde HEK 293 cellen in 96 goed ondoorzichtige platen met een dichtheid van 30.000 cellen per put in 90 μL medium zonder fenolrood dat 0% FCS bevat. Om 3 technische replica's binnen hetzelfde experiment voor 3 verschillende verbindingen te verkrijgen, zaait u 60 putten van de platen met cellen exclusief de putten aan de randen.
- Voeg onmiddellijk na het zaaien van de getransfecteerde cellen 10 μL 10% DMSO-samengestelde oplossing toe (zie stap 1.2).
- Samengesteld preparaat
- Bereid 1 mM samengestelde aandelenoplossingen voor door de samengestelde stof van belang op te lossen in 100% DMSO (v/v). Gebruik 8 μL van de 1 mM samengestelde stamoplossing om 3 duplo's voor elke samengestelde titratie te hebben.
OPMERKING: Het volume van 1 mM gebruikte voorraadsamenstelling is meer dan wat nodig is. Dit wordt gedaan om rekening te houden met eventuele pipetteerfouten. - Voer een 2-voudige seriële verdunning van de stamverbindingsoplossing uit met 4 μL van de 1 mM-voorraad in 4 μL van 100% DMSO voor elk titratiepunt.
OPMERKING: Voer voor een volledige samengestelde titratie 9 seriële verdunningen uit uit het startbestand in 100% DMSO. Als meerdere verbindingen moeten worden getest, gebruik dan een 96-putplaat en een meerkanaalspipet om deze stap en daaropvolgende verdunningen te vergemakkelijken. - Voeg 36 μL steriel HPLC-klasse steriel water toe voor elk punt van de 2-voudige seriële verdunning om een 40 μL 10x werkende oplossingen in 10% DMSO (v/v) te bereiden (d.w.z. 100 μM tot 0,39 μM 10% DMSO-voorraadreeks zal leiden tot een uiteindelijke oplossing van 10 μM tot 0,039 μM,in 1% DMSO). Wat de behandelingscontrole betreft, moet u ook een 10% DMSO-standaardoplossing in steriel water van HPLC-kwaliteit bereiden.
- Voeg 10 μL 10x werkoplossingen toe aan de cellen in de 96 goed ondoorzichtige plaat om de beoogde eindconcentratie op te leveren met een residuele DMSO-concentratie van 1% (v/v) in een totaal volume van 100 μL en incubeer gedurende 3 uur bij 37 °C met 5% v/v atmosferisch CO2.
- Bereid 1 mM samengestelde aandelenoplossingen voor door de samengestelde stof van belang op te lossen in 100% DMSO (v/v). Gebruik 8 μL van de 1 mM samengestelde stamoplossing om 3 duplo's voor elke samengestelde titratie te hebben.
- Luciferase complementatie en levensvatbaarheidstest
- Begin na 3 uur met het bereiden van het luciferasesubstraatreagens door 1 volume substraat te combineren met 19 volumes van het verdunningsreagens (zie de instructies van de fabrikant).
OPMERKING: De luciferasetest wordt uitgevoerd met behulp van een in de handel verkrijgde kit (zie materiaaltabel). - Gebruik een meerkanaals pipet om onmiddellijk 25 μL substraatreagens toe te voegen.
- Schud de plaat bij 350 tpm gedurende 50 minuten op een orbitale shaker bij kamertemperatuur.
- Beoordeel luminescentie met behulp van een plaatlezer. Zet hiervoor de spiegellezer op luminescentie en het emissiefilter op 455. Gebruik een meethoogte van 6,5 mm met een meettijd van 1 s.
- Om de levensvatbaarheid van cellen te asses, voegt u 33 μL levensvatbaarheidstestreagens toe en meet u vervolgens na 15 minuten bij kamertemperatuur opnieuw luminescentie met behulp van de plaatlezer.
- Beoordeel luminescentie met de plaatlezer door de spiegellezer op luminescentie en het emissiefilter op 600 nm te zetten. Gebruik een meethoogte van 6,5 mm met een meettijd van 1 s.
OPMERKING: De levensvatbaarheid wordt beoordeeld door het intracellulaire atp-niveau te meten bij cellyse volgens de instructies van de fabrikant. Multiplexing is in dit geval mogelijk omdat de levensvatbaarheidstest een andere luciferase met een andere emissiegolflengte gebruikt. - Gebruik de gegevens om de IC50-waarden van elke verbinding te bepalen door de curve die de gegevens aan een 4 parameter fitting curvevergelijking past:
Y = ((A-D)/(1+((x/C)^B))) + D
De numerieke waarden D en A moeten worden beperkt in het proces voor het aanpassen van de curve:
D = lichtgevende waarde op de Y-as voor minimale curveasymptoat of minimaal theoretisch responsniveau verwacht van de eIF4E:4G complementatietest.
A = lichtgevende waarde op de Y-as voor maximale curveasymptoat of maximale theoretische niveaurespons verwacht van de eIF4E:4G complementatietest.
OPMERKING: De waarde voor de minimale respons is afgeleid van de 1% DMSO (v/v) controlebehandeling en de waarde voor de maximale respons is afgeleid van de maximale respons van een mTOR-remmer met hoge affiniteit die is geplateauteerd zonder effect op de levensvatbaarheid van de cel.
- Begin na 3 uur met het bereiden van het luciferasesubstraatreagens door 1 volume substraat te combineren met 19 volumes van het verdunningsreagens (zie de instructies van de fabrikant).
2. Correleren van eIF4E:eIF4G604-646 testremming met eIF4F complexe verstoring in cellen
- Om te bevestigen dat het signaal dat door de test wordt gemeten overeenkomt met de fysieke verstoring van de interactie tussen eIF4E en eIF4G door de verbinding, zaadcellen zoals beschreven in stap 1.1.
- Vervang de dag erna het medium door 1 ml gereduceerd serummedium dat geen fenolrood bevat en incubeer gedurende 4 uur door de interesseverbinding. Zorg voor een resterende DMSO-concentratie van 1% (v/v) in een totaal volume van 1 ml.
OPMERKING: Gebruik samengestelde concentraties aan het begin, het middelpunt en het eindpunt van de gemeten complementatietesttitratiecurve om gemakkelijk een correlatie met het resultaat mogelijk te maken. - Lyse cellen en uitgevoerd m7GTP pull down om eIF4F en eIF4E:4EBP1 complexen te isoleren. Gedetailleerde procedures voor het uitvoeren van het m7GTP pull down experiment zijn elders te vinden14.
- Detecteer m7GTP-gebonden eIF4G-, eIF4E- en 4EBP1-eiwitniveaus door westerse vlekanalyse en correleer vervolgens met eIF4F-complexe verstoring met complementatietestsignaalremming.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Om de gevoeligheid van het eIF4E:eIF4G604-646 complementatiesysteem te valideren, werd 4EBP1 gemedieerde remming van de eIF4F-complexe assemblage beoordeeld met behulp van mTOR-remmers. Door mTORC1 kinase afhankelijke fosforylering van de 4EBP eiwitfamilie te remmen, verbetert mTOR-remming de 4EBP1-associatie met eIF4E en dus eIF4F-demontage15. Er werden twee klassen mechanistisch verschillende remmers van mTOR-kinases getest: rapalogs (bijv. Rapamycine)...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
De in dit artikel beschreven methode maakt gebruik van een op luciferase gebaseerde complementatietest om de complexe assemblage van eIF4F kwantitatief te monitoren door middel van directe meting van eIF4G-eIF4E-interactie in levende cellen. We hebben details verstrekt voor het gebruik van het eIF4E-eIF4G-complementatiesysteem en we hebben ook laten zien dat het systeem uiterst nauwkeurig is bij het meten van door geneesmiddelen geïnduceerde 4EBP1-gemedieerde dissociatie van eIF4E-eIF4G-interactie16
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs hebben niets bekend te maken.
Dankbetuigingen
Dit werk werd ondersteund door het kernbudget van het p53lab (BMSI, A*STAR) en de JCO VIP-subsidie (A*STAR).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| 293FT cellen | Thermo Fisher Scientific | R70007 | |
| Celkweek microplaat 96 putjes, F-Bodem | greiner bio-one | 655083 | |
| Cell titer Glo 2.0 | PROMEGA | G9241 | |
| Envision Multilabel Reader | PerkinElmer | niet van toepassing | |
| Finnpipette F2 Multikanaals Pipetten 12-kanalen 30-300 ml | Thermo Fisher Scientific | 4662070 | |
| Finnpipette F2 Multikanaals Pipetten 12-kanalen 5-50 ml | Thermo Fisher Scientific | 4662050 | |
| FUGENE6 | PROMEGA | E2692 | |
| Lipofectamine 3000 | Thermo Fisher Scientific | L3000015 | |
| NanoBiT PPI Starter Systemen | PROMEGA | N2014 | |
| Optimem I Gereduceerd Serum Medium, geen fenol rood | Thermo Fisher Scientific | 11058021 | |
| Orbitale schudder | Eppendorf | niet van toepassing | |
| γ-Aminofenyl-m7GTP (C10-afstandhouder)-Agar | Jena Bioscience | AC-155S |
Referenties
- Silvera, D., Formenti, S. C., Schneider, R. J. Translational control in cancer. Nature Reviews Cancer. 10 (4), 254-266 (2010).
- Gebauer, F., Hentze, M. W. Molecular Mechanism of translational control. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 10, 827-835 (2004).
- Bhat, M., et al. Targeting the translation machinery in cancer. Nature Reviews Drug Discovery. 14 (4), 261-278 (2015).
- Pelletier, J., Graff, J., Ruggero, D., Sonenberg, N. Targeting the eIF4F translation initiation complex: a critical nexus for cancer development. Cancer Research. 75 (2), 250-263 (2015).
- Montanaro, L., Pandolfi, P. P. Initiation of mRNA translation in oncogenesis: the role of eIF4E. Cell Cycle. 11, 1387-1389 (2004).
- Merrick, W. C. eIF4E: A retrospective. Journal of Biological Chemistry. 290 (40), 24091-24099 (2015).
- Marcotrigiano, J., Gingras, A. C., Sonenberg, N., Burley, S. K. Cap-dependent translation initiation in eukaryotes is regulated by a molecular mimic of eIF4G. Molecular Cell. 3 (6), 707-716 (1999).
- Umenaga, Y., Paku, K. S., In, Y., Ishida, T., Tomoo, K. Identification and function of the second eIF4E-binding region in N-terminal domain of eIF4G: comparison with eIF4E-binding protein. Biochemical and Biophysical Research Communication. 414 (3), 462-467 (2011).
- Grüner, S., et al. The Structures of eIF4E-eIF4G Complexes Reveal an Extended Interface to Regulate Translation Initiation. Molecular Cell. 64 (3), 467-479 (2016).
- Gingras, A. C., et al. Hierarchical phosphorylation of the translation inhibitor 4E-BP1. Genes and Development. 15 (21), 2852-2864 (2001).
- Dixon, A. S., et al. NanoLuc Complementation Reporter Optimized for Accurate Measurement of Protein Interactions in Cells. ACS Chemical Biology. 11 (2), 400-408 (2016).
- Sun, S. Y. mTOR kinase inhibitors as potential cancer therapeutic drugs. Cancer Letters. 340 (1), 1-8 (2013).
- Strober, W. Trypan blue exclusion test of cell viability. Current Protocols in Immunology. , Appendix 3: Appendix 3B (2001).
- Sekiyama, N., et al. Molecular mechanism of the dual activity of 4EGI-1: Dissociating eIF4G from eIF4E but stabilizing the binding of unphosphorylated 4E-BP1. Proceedings of the National Academy of Science U. S. A. 112 (30), e4036-e4045 (2015).
- Muller, D., et al. 4E-BP restrains eIF4E phosphorylation. Translation. 1 (2), e25819(2013).
- Frosi, Y., Usher, R., Lian, D. T. G., Lane, D. P., Brown, C. J. Monitoring flux in signalling pathways through measurements of 4EBP1-mediated eIF4F complex assembly. BMC Biology. (1), 40(2019).
- Ran, X., Gestwicki, J. E. Inhibitors of protein-protein interactions (PPIs): An analysis of scaffold choices and buried surface area. Current Opinion in Chemical Biology. 44, 75-86 (2018).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
