Monitoring van eIF4F-assemblage door eIF4E-eIF4G-interactie in levende cellen te meten

Summary

Hier presenteren we een protocol om eIF4E-eIF4G-interactie in levende cellen te meten waarmee de gebruiker door geneesmiddelen veroorzaakte verstoring van de complexe dynamiek van eIF4F in screeningsformaten kan evalueren.

Abstract

De vorming van het eIF4F-complex is het belangrijkste stroomafwaartse knooppunt gebleken voor de convergentie van signaleringsroutes die vaak oncogene activering bij de mens ondergaan. eIF4F is een cap-binding complex dat betrokken is bij de mRNA-ribosoom wervingsfase van vertaalinitiatie. In veel cellulaire en preklinische modellen van kanker leidt de deregulering van eIF4F tot een verhoogde vertaling van specifieke mRNA-subsets die betrokken zijn bij de proliferatie en overleving van kanker. eIF4F is een hetero-trimerisch complex gebouwd van de cap-bindende subeenheid eIF4E, de helicase eIF4A en de steigersubeenheid eIF4G. Cruciaal voor de assemblage van actieve eIF4F-complexen is de eiwit-eiwitinteractie tussen eIF4E- en eIF4G-eiwitten. In dit artikel beschrijven we een protocol voor het meten van eIF4F-assemblage dat de status van eIF4E-eIF4G-interactie in levende cellen bewaakt. De eIF4e:4G-celgebaseerde eiwit-eiwitinteractietest maakt het ook mogelijk om door geneesmiddelen geïnduceerde veranderingen in de complexe integriteit van eIF4F nauwkeurig en betrouwbaar te beoordelen. We stellen ons voor dat deze methode kan worden toegepast voor het verifiëren van de activiteit van commercieel beschikbare verbindingen of voor verdere screening van nieuwe verbindingen of modaliteiten die de vorming van eIF4F-complex efficiënt verstoren.

Introduction

Controle van genexpressie speelt een cruciale rol bij de juiste uitvoering van cellulaire programma's zoals groeiproliferatie en differentiatie. Een regelgevend controlemechanisme kan worden uitgeoefend op het niveau van gentranscriptie of op het niveau van mRNA-vertaling. In het laatste decennium is het steeds duidelijker geworden dat translationele controle door modulatie van het initiatieproces in plaats van de latere stappen van verlenging en beëindiging de synthese van specifieke subsets van eiwitten die een breed scala aan biologische functies spelen, fijn kan reguleren.

Verhoogde vertaling van mRNAs die betrokken zijn bij overleving,....

Protocol

HEK293 cellijn werd gebruikt voor het protocol en werd gekweekt in Dulbecco's Modified Eagle Medium aangevuld met 10% Foetale Runderserum, 2 mM L-glutamine en 100 U/ml penicilline/streptomycine. Cellen werden gekweekt bij 37 °C met 5% CO₂ in een bevochtigde omgeving.

1. Kwantitatieve beoordeling van complexe verstoringen van eIF4F via eIF4E:eIF4G^604-646 complementatietest

1. Celkweek en transiënte transfectie van eIF4E:eIF4G^604-646 complementatietest
   1. Gebruik vers ontdooide cellen met minder dan 20 passages voor alle experimenten. Bepaal op dag 1 het celnummer met behulp van een standaardceltel....

Results

Om de gevoeligheid van het eIF4E:eIF4G^604-646 complementatiesysteem te valideren, werd 4EBP1 gemedieerde remming van de eIF4F-complexe assemblage beoordeeld met behulp van mTOR-remmers. Door mTORC1 kinase afhankelijke fosforylering van de 4EBP eiwitfamilie te remmen, verbetert mTOR-remming de 4EBP1-associatie met eIF4E en dus eIF4F-demontage¹⁵. Er werden twee klassen mechanistisch verschillende remmers van mTOR-kinases getest: rapalogs (bijv. Rapamycine).......

Discussion

De in dit artikel beschreven methode maakt gebruik van een op luciferase gebaseerde complementatietest om de complexe assemblage van eIF4F kwantitatief te monitoren door middel van directe meting van eIF4G-eIF4E-interactie in levende cellen. We hebben details verstrekt voor het gebruik van het eIF4E-eIF4G-complementatiesysteem en we hebben ook laten zien dat het systeem uiterst nauwkeurig is bij het meten van door geneesmiddelen geïnduceerde 4EBP1-gemedieerde dissociatie van eIF4E-eIF4G-interactie¹⁶

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
293FT cells	Thermo Fisher Scientific	R70007
Cell culture microplate 96 well, F-Bottom	greiner bio-one	655083
Cell titer Glo 2.0	PROMEGA	G9241
Envision Multilabel Reader	PerkinElmer	not applcable
Finnpipette F2 Multichannel Pipettes 12-channels 30-300 ml	Thermo Fisher Scientific	4662070
Finnpipette F2 Multichannel Pipettes 12-channels 5-50 ml	Thermo Fisher Scientific	4662050
FUGENE6	PROMEGA	E2692
Lipofectamine 3000	Thermo Fisher Scientific	L3000015
NanoBiT PPI Starter Systems	PROMEGA	N2014
Optimem I Reduced Serum Mediun, no phenol red	Thermo Fisher Scientific	11058021
Orbital shaker	Eppendorf	not appicable
γ-Aminophenyl-m7GTP (C10-spacer)-Agarose	Jena Bioscience	AC-155S