Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Engineering van intracellulaire eiwitsensoren in zoogdiercellen

2.9K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/60878

⸱

28 april 2020

 ,  ,  , 
1Istituto Italiano di Tecnologia, 2Synthetic Biology Center, Department of Biological Engineering, Massachusetts Institute of Technology

In dit artikel

Samenvatting

Hier presenteren we een protocol voor het engineeren van genetisch gecodeerde intracellulaire eiwitsensor-actuator(en). Het apparaat detecteert specifiek doeleiwitten via intracellulaire antilichamen (intrabodies) en reageert door gentranscriptionele output in te schakelen. Er is een algemeen raamwerk gebouwd om intrabodies snel te vervangen, waardoor een snelle detectie van elk gewenst eiwit mogelijk is, zonder de algemene architectuur te wijzigen.

Samenvatting

Eiwitten kunnen functioneren als biomarkers van pathologische aandoeningen, zoals neurodegeneratieve ziekten, infecties of metabole syndromen. Het manipuleren van cellen om deze biomarkers te detecteren en erop te reageren, kan helpen bij het begrijpen van moleculaire mechanismen die ten grondslag liggen aan pathologieën, en bij het ontwikkelen van nieuwe celgebaseerde therapieën. Hoewel er verschillende systemen zijn ontwikkeld die extracellulaire eiwitten detecteren, ontbrak er een modulair raamwerk dat gemakkelijk opnieuw kan worden ontworpen om verschillende intracellulaire eiwitten te detecteren.

Hier beschrijven we een protocol om een modulair genetisch platform te implementeren dat intracellulaire eiwitten detecteert en een specifieke cellulaire respons activeert. Het apparaat werkt op intracellulaire antilichamen of kleine peptiden om met hoge specificiteit het eiwit van interesse te detecteren, waardoor de transcriptionele activering van outputgenen wordt geactiveerd via een op TEV-protease (TEVp) gebaseerde activeringsmodule. TEVp is een viraal protease dat selectief korte verwante peptiden splitst en veel wordt gebruikt in de biotechnologie en synthetische biologie vanwege zijn hoge orthogonaliteit ten opzichte van de splitsingsplaats. In het bijzonder hebben we apparaten ontwikkeld die eiwitbiomarkers van virale infecties en genetische ziekten herkennen en erop reageren, waaronder gemuteerde huntingtine-, NS3-serine-protease-, Tat- en Nef-eiwitten om respectievelijk de ziekte van Huntington, het hepatitis C-virus (HCV) en het humaan immunodeficiëntievirus (HIV) infecties te detecteren. Belangrijk is dat het systeem met de hand kan worden aangepast voor het gewenste functionele resultaat van input-output, zoals fluorescerende uitlezingen voor biosensoren, stimulatie van antigeenpresentatie voor immuunrespons of initiatie van apoptose om ongezonde cellen te elimineren.

Inleiding

De studie en modulaties van cellulaire responsen via controleerbare gemanipuleerde gencircuits zijn belangrijke doelen in de synthetische biologie 1,2,3 voor de ontwikkeling van prospectieve instrumenten met relevante biologische of medische toepassingen bij kanker 4, infecties5, stofwisselingsziekten6 en immunologie7.

Het herprogrammeren van celfuncties als reactie op specifieke signalen vereist het ontwerp van slimme interfaces die de detectie van extracellulaire of intracellulaire dynamische veranderingen (input) koppelen aan downstreamverwerking, waardoor specifieke output wordt geactiveerd voor diagnostische doeleinden (d.w.z. reportergen) of om celrespons opnieuw te bedraden (therapieën). De inputs die door de detectiemodule worden gedetecteerd, kunnen kleine analyten8, eiwitten 9,10,11 of microRNA's 11,12,13 zijn, specifiek voor het ontstaan of de progressie van een ziekte. Bovendien kan complexe circuitregulatie worden bereikt door informatieverwerking met meerdere ingangen, waardoor de strakke controle over transgenexpressie wordt vergroot als reactie op de gedefinieerde voorwaarden 14,15,16. Op microRNA gebaseerde sensoren kunnen bijvoorbeeld specifieke celtypen, zoals kankercellen, identificeren, waardoor hun klaring wordt geïnduceerd met de expressie van een apoptotisch gen13. Aangezien microRNA's gemakkelijk op een modulaire manier kunnen worden geïmplementeerd in synthetische circuits, vertegenwoordigen ze een veelgebruikte input voor genetisch gecodeerde biosensoren 12,13,17. Eiwitten zijn ook een geldige biomarker voor genetische mutaties, kanker en infecties, en er zijn inderdaad een aantal extracellulaire eiwitdetectieapparaten gerapporteerd18,19.

Veel van de circuits die extracellulaire eiwitten detecteren, zijn afhankelijk van het gebruik van gemanipuleerde receptoren, die een transcriptiefactor (TF) aan het membraan koppelen, gefuseerd met een TEVp-responsieve splitsingsplaats (TCS). Een groot voordeel van de TEVp is de specificiteit van de splitsing en het ontbreken van interferentie met de endogene eiwitverwerking. In deze systemen wordt TEVp gefuseerd met een tweede peptide dat interageert met de gemanipuleerde receptor bij binding van de extracellulaire moleculen. De externe ingangen induceren dus TEVp-gemedieerde splitsing en TF-release. Systemen die met dit mechanisme werken zijn Tango/TEVp18, lichtgeïnduceerde20 en Modular Extracellular Sensor Architecture (MESA)19. Ondanks vooruitgang bij het detecteren van extracellulaire eiwitten, is de technologie voor het detecteren van intracellulaire eiwitten op een modulaire manier nog nooit eerder gerealiseerd, met de beperking van het doorlopen van veel build-and-test-iteraties voor afzonderlijke apparaten die reageren op een specifiek eiwit.

Ons systeem is het eerste platform voor intracellulaire eiwitdetectie21. De modulariteit wordt gegarandeerd door het gebruik van intrabodies die de specificiteit van het doelwit bepalen, terwijl de herprogrammering van de cellen TEVp-gemedieerd is. Concreet is één intrabody membraangebonden en gefuseerd met de C-terminal tot een fluorescerend eiwit mKate, een TCS en een TF (fusie-eiwit 1); het tweede intralichaam is gefuseerd met de TEVp en bevindt zich in het cytosol (fusie-eiwit 2) (Figuur 1).

De interactie tussen twee intralichamen en het doeleiwit vindt dus plaats in het cytoplasma en leidt tot TCS-splitsing door TEVp, wat resulteert in TF-translocatie naar de kern om functionele output te activeren. Het activerende apparaat werd met succes getest op vier intracellulaire ziektespecifieke eiwitten: NS3-serineprotease tot expressie gebracht door het HCV-virus22, Tat- en Nef-eiwitten van HIV-infectie23,24 en gemuteerd huntingtine (HTT) van de ziekte van Huntington25. Outputexpressie omvat fluorescerende reporters, apoptotisch gen (hBax)26 en immunomodulatoren (XCL-1)27. We tonen aan dat het systeem ook de pathologische functionaliteit van zijn doelen kan aantasten. Het Nef-responsieve apparaat verstoort bijvoorbeeld de verspreiding van virale infectie door het doeleiwit af te zonderen en de downmodulatie van de HLA-I-receptor op geïnfecteerde T-cellen24 terug te draaien. Het beschreven detectie-activerende platform is het eerste in zijn soort voor de detectie van intracellulaire eiwitten en kan mogelijk worden geïmplementeerd om abnormale eiwitexpressie, posttranslationele of epigenetische modificaties te detecteren, voor diagnostische en therapeutische doeleinden20.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

1. Ontwerpprincipes voor de constructie en het testen van het sensor-actuatorapparaat

  1. Selecteer een interessant eiwit.
    OPMERKING: We hebben een systeem ontworpen voor eiwitten die zich in het cytoplasma bevinden of pendelen tussen het cytoplasma en andere compartimenten.
  2. Selecteer twee intralichamen die verschillende epitopen van het doeleiwit binden. In onze studie hebben we eiwitten geselecteerd waarvoor de intrabodies al waren ontwikkeld en getest 28,29,30,31. Als er geen intrabodies beschikbaar zijn, moeten ze nieuw worden ontwikkeld.
    OPMERKING: Een alternatief voor intrabodies kunnen andere moleculen zijn die interageren met het eiwit van belang. Het Nef-detectieapparaat omvat bijvoorbeeld één intrabody (sdAb19) en het SH3-domein van een p59fyn-eiwit tyrosinekinase32.
  3. Ontwerp in silico de plasmiden met DNA-sequenties die coderen voor de fusie-eiwitten.
    OPMERKING: Software voor het ontwerpen van plasmide is gratis beschikbaar of kan worden gekocht.
    1. Genereer sequenties die de volgende modules bevatten: membraantag, fluorescerende marker (bijv. mKate), intrabody, TCS en TF voor fusie-eiwit 1, en intrabody en TEVp voor fusie-eiwit 2.
      OPMERKING: Het bouwen van een nieuwe architectuur op basis van de interactie van verschillende componenten vereist aandacht voor parameters die de signaalactivering kunnen maximaliseren wanneer het doeleiwit wordt gedetecteerd. Specifiek hebben we ons gericht op TEVp-activiteit en flexibiliteit van de chimere eiwitten om eiwit-eiwitinteractie te vergemakkelijken (Tabel 1). Al deze kenmerken worden in de volgende punten gespecificeerd.
    2. Breng een flexibel glycine-serine-linkerdomein (LD) in tussen het intrabody-TCS en/of TEVp-intrabody. De LD kan een variabele lengte hebben (0, 10 of 15 aminozuren-AA).
    3. Fusie-eiwit 1: Ontwerpvarianten die het TCS met hoge affiniteit (S) of het TCS (L) met lage affiniteit bevatten om de TEVp-splitsingsactiviteit te reguleren. De expressie van deze constructie wordt gedreven door een constitutieve promotor. Voeg de GAL4VP16 transcriptiefactor toe aan de C-terminal van TCS om translocatie naar de kern mogelijk te maken bij TEVp-splitsing.
      OPMERKING: We hebben de hEF1a-promotor gebruikt, maar er kunnen andere constitutieve promotors worden gekozen.
    4. Fusie-eiwit 2: Gebruik een constitutieve (hEF1a) of doxyclycine-induceerbare (pTET) promotor om de TEVp-transcriptie af te stemmen. Gebruik een afbraakdomein (DD) dat wordt gereguleerd door het kleine molecuulschild om de eiwitstabiliteit te moduleren.
      OPMERKING: Andere induceerbare systemen die de eiwitexpressie afstemmen, kunnen mogelijk worden gekozen.
    5. Uitvoer: Plaats een reportergen stroomafwaarts UAS-promotor die reageert op GAL4VP16 transcriptiefactor. Kies de output op basis van de toepassing van het apparaat (d.w.z. fluorescerend eiwit, cytokine, enz.).
  4. Voer klonen uit met elke gewenste strategie. Hier hebben we plasmiden gebouwd met golden gate- of gateway-technologieën.
  5. Test de diverse configuratie van het apparaat in de gewenste cellijnen door voorbijgaande transfectie. Co-transfecteren van de cellen met de verkregen plasmiden voor fusie-eiwitten 1 en 2 en fluorescerend reportergen, zoals UAS-EYFP. Fusie-eiwit 1 omvat een rood fluorescerend eiwit (mkate) dat als transfectiemarker wordt gebruikt.
    OPMERKING: Begin met eenvoudig te transfecteren cellijnen, zoals HEK293FT cellen om de apparaten te testen.
    1. Transfectie in HEK293FT cellen. Zaai 2 x 105 cellen in een plaat met 24 putjes met 500 μL DMEM. Transfect cellen met 300 ng totaal DNA met behulp van transfectiereagens, vortex de mix en incubeer bij RT gedurende 20 minuten.
      1. Plaats de cellen in een incubator van 37 °C/5% CO2 . Voeg 24 uur na transfectie vers kweekmedium toe.
    2. Transfectie in Jurkat-cellen. Gebruik 3 x 105 cellen in 500 μL RPMI-celkweekmedium voor een plaat met 24 putjes. Voer elektroporatie uit volgens de instructies van de fabrikant. Gebruik 2-4 μg totaal DNA voor elk monster. Voeg 24 uur na transfectie 500 μL verse celkweekmedia toe.
      1. Plaats tijdens elektroporatie cellen en DNA-mengsel op ijs. Plaats de cellen vervolgens in de 37 °C/5% CO2 -incubator.
        OPMERKING: De verschillende cellijnen en transfectiemethodes kunnen volgens de specifieke toepassing van het apparaat worden gekozen.
  6. Verkrijg microscoopbeelden om een kwalitatief inzicht te krijgen in de functionaliteit van het apparaat. Bevestig de membraanlokalisatie van het fusie-eiwit 1 door het fluorescerende signaal (mkate) in de buurt van het celmembraan te detecteren. Visualiseer de fluorescerende output (EYFP) in de aan- of afwezigheid (negatieve controle-NC) van het doeleiwit.
    1. Gebruik het celbeeldvormingssysteem dat is uitgerust met Tx Red- en GFP-lichtkubussen om mKate- en EYFP-fluorescerende eiwitten te detecteren. Gebruik het 10x of 20x objectief.
      OPMERKING: Gebruik niet-getransfecteerde cellen om ervoor te zorgen dat er geen autofluorescentie is.
  7. Analyseer de transfectie met flowcytometrie (FACS).
    NOTITIE: Zie Protocol 2 voor de voorbereiding van het monster.
    1. Evalueer de apparaten in aanwezigheid van het doeleiwit. Creëer een experimentele matrix die varianten van fusie-eiwit 1 en 2 combineert, waarbij TEVp wordt gemoduleerd met (i) constitutieve hEf1a-promotor, (ii) doxycycline-induceerbare TET-promotor en (iii) schild voor eiwitstabiliteit. Voeg doxycycline en schild toe in concentraties (0-1000 nM).
    2. Voer een FACS-analyse uit om de vouwinductie van EYFP tussen monsters met of zonder interessant eiwit te vergelijken.
      OPMERKING: De hoogste vouwinductie komt overeen met de grootste invoergevoeligheid in AAN (aanwezigheid van het doeleiwit) in vergelijking met de UIT-modus (afwezigheid van het doeleiwit).
  8. Test de functionaliteit van het apparaat met betrekking tot de gewenste toepassingen.
    1. Voer FACS-analyse uit om de niveaus van outputeiwitten of apoptose of andere relevante tests te meten.
    2. Voer RT PCR-analyse uit als het uitvoergedeelte van het apparaat de expressieniveaus van doelgenen regelt. Bereken 2-ddCT met betrekking tot het huishoudgen (GAPDH of gelijkwaardig) en vergelijk de vouwverandering van outputexpressie in AAN- en UIT-modi.

2. Monstervoorbereiding voor flowcytometrie-analyse

  1. Voer kwantitatieve analyse van eiwitapparaten uit met een flowcytometer (FACS) 48 uur na transfectie.
    1. Zuig de DMEM-media op en was HEK293FT cellen met 300 μL PBS. Voeg 100 μL trypsine toe en laat 2-4 minuten in de 37 °C/5% CO2 -incubator staan.
      OPMERKING: Jurkat-cellen hebben geen trypsine nodig.
    2. Voeg 400 μL DMEM-media zonder fenolrood toe en resustribueer de cellen om klontvorming te voorkomen. Overdracht in FACS-buisjes.
    3. Gebruik een flowcytometer die is uitgerust met lasers van 405, 488 en 561 nm.
    4. Verzamel 30.000 – 100.000 gebeurtenissen geselecteerd uit de levende celpopulatie met behulp van de volgende cytometerinstellingen: 488 nm laser en 530/30 nm banddoorlaatfilter voor EYFP/EGFP, 561 nm laser en 610/20 nm filter voor mKate, en 405 nm laser, 450/50 filter voor EBFP.
      OPMERKING: Om de flowcytometer op te zetten, omvat u niet-getransfecteerde cellen en cellen die zijn getransfecteerd met enkelvoudige fluorescerende eiwitten.
    5. Voer analyse uit van verzamelde monsters met behulp van voorkeurssoftware (bijv. DIVA-software, Flowjo of TASBE33-methode).

3. Karakterisering van de HCV-sensor-actuator

  1. Selecteer intrabodies om NS3-eiwit te detecteren. scFv35 en scFv162 binden aan twee verschillende epitopen en werden dus gekozen.
  2. Ontwerp en test varianten van het NS3-responsieve apparaat volgens de rationale beschreven in stap 1.3 (bijv. Fusie-eiwit 1: membraantag, mKate, enkelvoudig ketenfragment intrabody scFv35, LD0, TCS-L en TF GAL4VP16; Fusie-eiwit 2: enkelvoudig ketenfragment intrabody scFv162, LD0 en TEVp; Uitvoer: UAS-EYFP of UAS-hBax (apoptose); NS3 (zie tabel 2)).
  3. Test de constructen in HEK293FT cellen.
    OPMERKING: Stel voor elk experiment een negatieve controle in, namelijk de afgifte van het apparaat en de kwantificering van de output in afwezigheid van het eiwit van belang.
    1. Test de apparaten op TEVp onder een constitutieve promotor in aanwezigheid of afwezigheid van NS3. Voer transfectie uit van fusie-eiwit 1 (stap 1.3.3), fusie-eiwit 2 (stap 1.3.4) en EYFP-outputstap (1.3.5) in HEK293FT cellen zoals beschreven in stap 1.5.1. Analyseer de monsters 48 uur na transfectie door de fluorescerende reporter (EYFP) te meten door middel van flowcytometrie (Protocol 2).
    2. Beoordeel de interactie intrabody-NS3 door mKate en BFP-colokalisatie met behulp van het BFP-NS3-fusie-eiwit. Transfecte cellen met fusie-eiwit 1 dat mKate bevat, en met een BFP-NS3. 48 uur na transfectie worden cellen waargenomen met een confocale microscoop (63x objectief) om te testen op co-lokalisatie van fluorescerende eiwitten.
      OPMERKING: Gebruik een BFP (niet gefuseerd met NS3) als negatieve controle. In deze toestand zou BFP diffuse cellulaire lokalisatie moeten vertonen en zou het niet co-lokaliseren met de membraangebonden mKate.
    3. Test de apparaten op TEVp onder de pTET-promotor in aanwezigheid of afwezigheid van NS3. Vergelijk EYFP bij afwezigheid en aanwezigheid van NS3. Co-transfect cellen met fusie-eiwit 1 (stap 1.3.3), fusie-eiwit 2 (stap 1.3.4) en EYFP-output (stap 1.3.5) met behulp van het protocol beschreven in stap 1.5.1. Transfecties worden uitgevoerd in aanwezigheid of afwezigheid van NS3. Analyseer de monsters 48 uur na transfectie door de fluorescerende reporter (EYFP) te meten door middel van flowcytometrie (Protocol 2).
  4. Testceldoding aangedreven door NS3-apparaat.
    1. Vervang EYFP-output door het apoptotische gen hBax.
    2. Herhaal stap 3.3.3. Verzamel de cellen 48 uur na transfectie en was met PBS voordat u met de test begint.
    3. Voer een apoptosetest uit met Annexin V geconjugeerd aan Pacific Blue. Kleur cellen met apoptotische marker Annexin V (geconjugeerd met 2,5 μL Pacific Blue) verdund in bindingsbuffer (1:20 volumeverhouding) gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur.
    4. Analyseer de cellen door middel van flowcytometrie. Bereken het apoptoseniveau binnen de populatie als aantal Pacific-Blue (Annexin V) positieve cellen.

4. Karakterisering van Nef-responsieve HIV-sensor-actuator

  1. Selecteer intrabodies die binden aan Nef. Er werd gekozen voor intrabody sdAb19 en SH3 met één domein omdat ze binden aan verschillende epitopen.
    OPMERKING: SH3 is geen intrabody, maar een domein van p59fyn proteïne tyrosinekinase dat fysiologisch interageert met Nef.
  2. Ontwerp en test varianten van Nef-responsief apparaat volgens de rationale beschreven in stap 1.3 (bijv. Fusie-eiwit 1: membraantag, mKate, sdAb19, LD0, TCS-L en GAL4-VP16; Fusie-eiwit 2: SH3, LD0 en TEVp; Uitvoer: UAS-EYFP; Nef (zie tabel 3)).
  3. Test de apparaten in HEK293FT en Jurkat T-cellen.
    OPMERKING: Voor elk experiment stellen we een negatieve controle in, namelijk de afgifte van het apparaat en de kwantificering van de output in afwezigheid van het eiwit van belang
    1. Transfectie van HEK293FT: Volg de procedure beschreven in stap 1.5.1 in aanwezigheid of afwezigheid van Nef.
    2. Transfectie van Jurkat T-cellen: Volg de procedure beschreven in stap 1.5.2 in aanwezigheid of afwezigheid van Nef.
    3. 48 uur na transfectie, analyseer de monsters met een flowcytometer zoals beschreven in Protocol 2.
  4. Infecteer Jurkat-cellen met HIV LAI-stammen voor HIV-detectie.
    1. Bereid virale voorraden ten minste 48 uur voor het experiment. Gebruik virus verkregen uit transfectie van HEK-293T-cellen met de infectieuze moleculaire klonen (NIH AIDS-reagentiaprogramma) en commerciële reagentia met behulp van de instructies van de fabrikant. Concentraat het virus na 40 uur door ultracentrifugatie gedurende 1 uur, 64.074 x g, 4°C op 20% sucrose om virale deeltjesvrije eiwitten te vermijden. Titer virale voorraden met HIV-1 p24 ELISA.
    2. Infecteer cellen met HIV-1-stammen met 500 ng p24-inoculum. Kwantificeer 40 uur na infectie het percentage geïnfecteerde cellen door het virale eiwit p24 te detecteren met KC57-FITC geconjugeerd antilichaam en door flowcytometrie-analyse uit te voeren.
    3. Kleur de cellen met AlexaFluor 647 geconjugeerde antilichamen kloon W6/32 tegen HLA-A, B, C. Fixeer de cellen en analyseer ze op een flowcytometer. Nef gemedieerde downmodulatie van HLA-I in Jurkat T-cellen in aanwezigheid of afwezigheid van het eiwitsensorapparaat.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Een architectuur voor modulaire intracellulaire eiwitdetectie
Zoals weergegeven in figuur 1, bestaat het apparaat uit: 1) intrabody 1 verbonden met de membraangebonden fluorescerende marker (mKate) en TEVp-splitsingsplaats (TCS), gevolgd door een transcriptie-activator GAL4VP16 (TF); 2) intralichaam 2 gefuseerd met TEV-protease (TEVp), vrij in het cytosol; 3) een synthetische promotor die reageert op GAL4VP16 en de expressie van een repor...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Tot voor kort werd het ondervragen van cellen op basis van de intracellulaire omgeving uitgevoerd met systemen die de novo waren ontwikkeld voor specifieke doelen. Het huidige protocol beschrijft een voorbeeld van de meest recente celengineeringbenadering voor eiwitdetectie en -bediening in één apparaat, dat snel kan worden aangepast aan nieuwe gewenste biomarkers.

Dit baanbrekende systeem detecteert intracellulaire eiwitten en levert een specifieke output om ...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs verklaren geen concurrerende financiële belangen.

Dankbetuigingen

Dit werk werd gesteund door het Istituto Italiano di Tecnologia.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
AlexaFluor 647 mouse anti-human HLA-A, B, C antibody clone W6/32Biolegend311414Antilichamen
Annexin VLifeTechnologiesA35122Apoptose marker
AttracteneQiagen301005Transfectiereagens
BD Falcon Round-Bottom TubesBD Biosciences352053FACS tubes
DoxycyclineClonetech-Celcultuur: Geneesmiddelen
Dulbecco's gemodificeerd Eagle-mediumCellgro10-013-CMCelcultuur: Medium
Evos Cell Imaging SystemLife TechnologyEVOS M5000Beeldvormingssystemen; Infectieuze moleculaire klonen
FACSDiva8 softwareBD Biosciences659523FACS software
Fast SYBR Green Master MixThermoFisher Scientific4385612qPCR reactie
FBS (Fetal Bovin Serum)Atlanta BIOS11050Celcultuur: Medium
Gateway SystemLife Technologies-Plasmidecodering
Golden Gate Systemin-house-Plasmidecodering
HEK 293FTInvitrogenR70007Celcultuur: Cellen
Infusion Cloning SystemClonetech638920Plasmidecodering
JetPRIME reagensPolyplus transfectie114-15Transfectiereagens
Jurkat-cellenATCCTIB-152Celcultuur: Cellen
L-GlutamineSigma-AldrichG7513-100MLCelcultuur: Medium
Lipofectamine LTX met Plus ReagensThermo Fisher Scientific15338030Transfectiereagens
LSR Fortessa flow cytometer (405, 488 en 561 nm lasers)BD Biosciences649225Flow cytometer
MicroAmp Fast Optical 96-Well Reaction Plate (0.1 mL)ThermoFisher Scientific4346907qPCR reactie
Neon Transfectie SystemLife TechnologiesMPK10025Transfectiereagens
Niet-essentiële aminozurenHyCloneSH3023801Celcultuur: Medium
Opti-MEM I gereduceerd serum mediumLife Technologies31985070Transfectiemedium
Penicilline/StreptomycineSigma-AldrichP4458-100MLCelcultuur: Medium
QuantiTect Reverse Transcriptase KitQiagen205313Rev Transcriptase kit
RNeasy Mini KitQiagen74106RNA extractie kit
RPMI-1640ATCCATCC 30­2001Celcultuur: Medium
ShieldClonetech632189Celcultuur: Geneesmiddelen
SpheroTech RCP-30-5-A kralenSpherotechRCP-30- 5A-2Compensatie set up
StepOnePlus 7500 Fast machineApplied Biosystems4351106qPCR reactie

Referenties

  1. Bernardo, D., Marucci, L., Menolascina, F., Siciliano, V. Predicting Synthetic Gene Networks. Synthetic Gene Networks: Methods and Protocols. 813, 57-81 (2012).
  2. Krams, R., et al. Mammalian synthetic biology: emerging medical applications. J. R. Soc. Interface. 12, (2015).
  3. MacDonald, J. T., Siciliano, V. Computational Sequence Design with R2oDNA Designer. Methods in molecular biology. 1651, Clifton, N.J. 249-262 (2017).
  4. Zah, E., Lin, M. -Y., Silva-Benedict, A., Jensen, M. C., Chen, Y. Y. T cells expressing CD19/CD20 bi-specific chimeric antigen receptors prevent antigen escape by malignant B cells. Cancer Immunology Research. 4, 498-508 (2016).
  5. Wu, F., Bethke, J. H., Wang, M., You, L. Quantitative and synthetic biology approaches to combat bacterial pathogens. Current Opinion in Biomedical Engineering. 4, 116-126 (2017).
  6. Ye, H., et al. Pharmaceutically controlled designer circuit for the treatment of the metabolic syndrome. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110, 141-146 (2013).
  7. Caliendo, F., Dukhinova, M., Siciliano, V. Engineered Cell-Based Therapeutics: Synthetic Biology Meets Immunology. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 7, (2019).
  8. Thaker, M. N., Wright, G. D. Opportunities for synthetic biology in antibiotics: Expanding glycopeptide chemical diversity. ACS Synthetic Biology. 4, 195-206 (2015).
  9. Culler, S. J., Hoff, K. G., Smolke, C. D. Reprogramming cellular behavior with RNA controllers responsive to endogenous proteins. Science. 330, New York, N.Y. 1251-1255 (2010).
  10. Ausländer, S., et al. A general design strategy for protein-responsive riboswitches in mammalian cells. Nature Methods. 11, 1154-1160 (2014).
  11. Cella, F., Siciliano, V. Protein-based parts and devices that respond to intracellular and extracellular signals in mammalian cells. Current Opinion in Chemical Biology. 52, 47-53 (2019).
  12. Miki, K., et al. Efficient Detection and Purification of Cell Populations Using Synthetic MicroRNA Switches. Cell Stem Cell. 16, 699-711 (2015).
  13. Xie, Z., Wroblewska, L., Prochazka, L., Weiss, R., Benenson, Y. Multi-input RNAi-based logic circuit for identification of specific cancer cells. Science. , New York, N.Y. 1307-1311 (2011).
  14. Sun, J., et al. Engineered proteins with sensing and activating modules for automated reprogramming of cellular functions. Nature Communications. 8, 477(2017).
  15. Shigeto, H., et al. Insulin sensor cells for the analysis of insulin secretion responses in single living pancreatic β cells. Analyst. 144, 3765-3772 (2019).
  16. Cella, F., Wroblewska, L., Weiss, R., Siciliano, V. Engineering protein-protein devices for multilayered regulation of mRNA translation using orthogonal proteases in mammalian cells. Nature Communications. 9, (2018).
  17. Siciliano, V., et al. MiRNAs confer phenotypic robustness to gene networks by suppressing biological noise. Nature communications. 4, 2364(2013).
  18. Barnea, G., et al. The genetic design of signaling cascades to record receptor activation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105, 64-69 (2008).
  19. Schwarz, K. A., Daringer, N. M., Dolberg, T. B., Leonard, J. N. Rewiring human cellular input–output using modular extracellular sensors. Nature Chemical Biology. 13, 202-209 (2016).
  20. Wieland, M., Fussenegger, M. Engineering molecular circuits using synthetic biology in mammalian cells. Annual review of chemical and biomolecular engineering. 3, 209-234 (2012).
  21. Siciliano, V., et al. Engineering modular intracellular protein sensor-actuator devices. Nature Communications. 9, 1881(2018).
  22. Lin, C. HCV NS3-4A Serine Protease. , (2006).
  23. Romani, B., Engelbrecht, S., Glashoff, R. H. Functions of Tat: the versatile protein of human immunodeficiency virus type 1. Journal of General Virology. 91, 1-12 (2010).
  24. Basmaciogullari, S., Pizzato, M. The activity of Nef on HIV-1 infectivity. Frontiers in microbiology. 5, 232(2014).
  25. Ross, C. A., Tabrizi, S. J. Huntington's disease: from molecular pathogenesis to clinical treatment. Lancet neurology. 10, 83-98 (2011).
  26. Pfeffer, C. M., Singh, A. T. K. Apoptosis: A Target for Anticancer Therapy. International journal of molecular sciences. 19, 448(2018).
  27. Guzzo, C., et al. The CD8-derived chemokine XCL1/lymphotactin is a conformation-dependent, broad-spectrum inhibitor of HIV-1. PLoS pathogens. 9, 1003852(2013).
  28. Marasco, W. A., LaVecchio, J., Winkler, A. Human anti-HIV-1 tat sFv intrabodies for gene therapy of advanced HIV-1-infection and AIDS. Journal of Immunological Methods. 231, 223-238 (1999).
  29. Gal-Tanamy, M., et al. HCV NS3 serine protease-neutralizing single-chain antibodies isolated by a novel genetic screen. Journal of molecular biology. 347, 991-1003 (2005).
  30. Southwell, A. L., et al. Intrabodies binding the proline-rich domains of mutant huntingtin increase its turnover and reduce neurotoxicity. The Journal of neuroscience the official journal of the Society for Neuroscience. 28, 9013-9020 (2008).
  31. Bouchet, J., et al. Inhibition of the Nef regulatory protein of HIV-1 by a single-domain antibody. Blood. 117, 3559-3568 (2011).
  32. Arold, S., et al. The crystal structure of HIV-1 Nef protein bound to the Fyn kinase SH3 domain suggests a role for this complex in altered T cell receptor signaling. Structure. 5, 1361-1372 (1997).
  33. Beal, J. Signal-to-Noise Ratio Measures Efficacy of Biological Computing Devices and Circuits. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 3, 93(2015).
  34. Arold, S., et al. The crystal structure of HIV-1 Nef protein bound to the Fyn kinase SH3 domain suggests a role for this complex in altered T cell receptor signaling. Structure. 5, London, England : 1993. 1361-1372 (1997).
  35. Tyshchuk, O., et al. Detection of a phosphorylated glycine-serine linker in an IgG-based fusion protein. mAbs. 9, 94-103 (2017).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Tags

TEV-proteasegenetisch platformantilichaamgebaseerde detectiepeptideherkenningtranscriptionele activatieziekte van Huntingtonhepatitis C-virusHIV-detectie

Dit artikel is gepubliceerd

Video binnenkort beschikbaar

Neem contact met ons op
Aanbevelen aan de bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleidsoverzicht

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.