Een muismodel van onvolledig gereseceerde weke delen Sarcoom voor het testen van (Neo)adjuvante therapieën

Summary

In dit protocol beschrijven we een muismodel van onvolledige chirurgische resectie van weke delen sarcoom voor het testen van (neo)adjuvante therapieën.

Abstract

Chirurgie is vaak de eerste behandeling voor veel vaste tumoren. Echter, lokale recidieven optreden vaak na primaire tumor resectie, ondanks adjuvante of neo-adjuvante therapieën. Dit gebeurt wanneer chirurgische marges onvoldoende tumorvrij zijn, wat resulteert in resterende kankercellen. Vanuit biologisch en immunologisch perspectief is chirurgie geen nulgebeurtenis; de wondhelende omgeving is bekend dat zowel pro- als anti-tumorigenische paden induceren. Als gevolg hiervan moeten preklinische modellen voor medicijnontwikkeling die gericht zijn op het voorkomen van lokale terugval chirurgische resectie bevatten bij het testen van nieuwe (neo)adjuvante therapieën, om de klinische instellingen te modelleren bij patiënten die met een operatie worden behandeld.

Hier beschrijven we een muismodel van onvolledige chirurgische resectie van WEHI 164 weke delen sarcoom waarmee (neo)adjuvante therapieën kunnen worden getest in de setting van een wondgenezingsrespons. In dit model wordt 50% of 75% van de tumor verwijderd, waardoor er in situ wat kankerweefsel achterblijft om een bruto restziekte te modelleren na een operatie in de klinische setting. Dit model maakt het mogelijk om therapieën te testen in de context van een operatie, terwijl ook rekening wordt gehouden met de wondgenezingsrespons, die de werkzaamheid van (neo)adjuvante behandelingen kan beïnvloeden. De onvolledige chirurgische resectie resulteert in reproduceerbare hergroei van de tumor bij alle muizen bij afwezigheid van adjuvante therapie. Adjuvante behandeling met checkpoint blokkade resulteert in verminderde tumor hergroei. Dit model is dus geschikt voor het testen van therapieën in het kader van debulking chirurgie en de bijbehorende wondgenezing reactie en kan worden uitgebreid tot andere vormen van vaste kanker.

Introduction

Chirurgie blijft de belangrijkste behandelingsoptie voor veel vaste tumoren¹, waaronder weke delen sarcoom^2,3. Ondanks verbeteringen in kankerchirurgietechnieken en combinaties met (neo)adjuvante therapieën, is er nog steeds een hoog risico op kankerreval en metastase na primaire tumorresectie^4,5. In weke delen sarcoom, recidieven optreden bijzonder locoregionaal, op de plaats van de operatie, wat resulteert in een verhoogde morbiditeit en mortaliteit. In de klinische setting kan het moeilijk zijn om ruim genoeg marges te verkrijgen (bijvoorbeeld vanwege anatomische beperkingen), wat resulteert in onvolledige resectie en daaropvolgende tumorrecidief⁶. Chirurgische stress en het daaropvolgende proces van wondgenezing zijn bekend om een immunosuppressieve tumor micro-omgeving gunstig voor tumor recidief^7,8te creëren. Daarom moet de ontdekking en ontwikkeling van nieuwe therapieën voor weke delen sarcoom, met name immunotherapieën, idealiter rekening houden met de chirurgische wondgenezingsrespons.

De meeste preklinische studies voor adjuvante therapieën worden in eerste instantie uitgevoerd met behulp van onderhuidse syngenetische of xenotransplantatie muismodellen, zonder integratie van de chirurgische stress en wondgenezing respons^9,10. Daarom ontwikkelden we een syngeneic onderhuids muiskecotweefsel sarcoom model waarin onvolledige chirurgische resectie. WEHI 164 fibrosarcoomcellen worden onderhuids ingeënt, en zodra tumoren zijn vastgesteld, verwijderen we 50-75% van de tumorbulk(figuur 1A-E). Tumoren consequent opnieuw groeien van de resterende tumor. Dit model maakt het mogelijk voor het testen van adjuvante therapieën, terwijl rekening houdend met het effect van chirurgische stress en wondgenezing. Soortgelijke chirurgische modellen van onvolledige resectie zijn in een aantal studies door verschillende groepen gebruikt en reproduceerbaar en effectief^{bevonden 11,12,13}. Hier geven we een gedetailleerde beschrijving van dit protocol.

Protocol

Dieren die bij deze experimenten werden gebruikt, werden verkregen van het Animal Resource Centre (Perth, West-Australië). Dieren werden onderhouden onder standaard pathogene-vrije omstandigheden aan het Harry Perkins Institute of Medical Research Bioresources North Facility (Perth, West-Australië). Alle experimenten werden uitgevoerd volgens het protocol zoals goedgekeurd door het Harry Perkins Institute of Medical Research Animal Ethics Committee. BALB/c muizen van 8-12 weken oud werden gebruikt in deze experimenten. De WEHI 164 fibrosarcoma cellijn werd verkregen van CellBank Australia (Westmead, NSW).

1. Inenting van cellen

1. Bereiding van cellen en dieren
   1. Zorg ervoor dat de cellijn in de aanbevolen media wordt gehandhaafd. Houd bijvoorbeeld de WEHI 164-cellijn in het Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 medium aangevuld met 2 mM L-glutamine, 10% foetale runderserum, 20 mM HEPES, 0,05 mM 2-mercaptoethanol, 100 U/mL penicilline en 100 μg/mL streptomcine.
      OPMERKING: Passagecellen ten minste 3 en tot 5 keer nadat ze uit cryogene opslag zijn verwijderd. Om een optimale cel levensvatbaarheid te garanderen, cellen moeten worden gesplitst wanneer ze tussen 70-80% confluent. Tumorcellijnen moeten worden getest op mycoplasma, omdat infectie de celgroei kan veranderen en de immuunrespons in vivo kan beïnvloeden.
   2. Een dag voor inenting scheer je muizen op de rechterflank met behulp van tondeuse.
      OPMERKING: Vrouwelijke BALB/c muizen, tussen 8-12 weken, van normaal gewicht (16 -22 gram) werden gebruikt in dit experiment.
   3. Op de dag van inenting, oogst WEHI 164 cellen wanneer 70-80% confluent door trypsinization.
      1. Het kweekmedium uit de weefselkweekkolven aanzuigen en vervolgens steriele fosfaatbuffers (1x PBS) toevoegen om de resterende sporen van foetaal runderserum (FBS) te verwijderen.
      2. Aspirate de PBS uit de weefselkweekkolven. Voeg 3 mL van 0,05% trypsine (voor een T75 kolf) toe en draai de kolf zodat het hele oppervlak van de kolf met cellen bedekt is met trypsine.
      3. Incubeer de kolf bij 37 °C, 5% CO₂ incubator gedurende 3 min. Controleer de cellen periodiek, door op de zijkanten van de kolf te tikken om te zien of de cellen zijn losgemaakt.
      4. Verwijder kolven uit de celkweek incubator en voeg 5 mL media aangevuld met FBS om de trypsine te neutraliseren.
         OPMERKING: Laat cellen niet langer in trypsine achter dan nodig is, omdat dit cellen kan beschadigen en kan leiden tot een lage cel levensvatbaarheid.
      5. Pipet vering meerdere keren om een enkele cel schorsing te verkrijgen. Breng celsuspensie over naar een kegelvormige centrifugebuis.
      6. Pelletcellen door te draaien op 350 x g gedurende 3 min.
   4. Was de cellen drie keer in 1x PBS.
      1. Resuspend cellen in 50 mL steriele 1x PBS en was cellen door pipetten cel suspensie op en neer. Pelletcellen door te draaien op 350 x g gedurende 3 min.
      2. Aspirate de supernatant en resuspend cellen in 15 mL steriele 1x PBS. Was cellen door pipetten cel suspensie op en neer. Pelletcellen door te draaien op 350 x g gedurende 3 min.
      3. Aspirate de supernatant en resuspend cellen in precies 10 mL steriele 1x PBS. Was cellen zoals in stap 1.1.4.2 en breng een kleine hoeveelheid (ongeveer 100 μL) celsuspensie over naar een centrifugebuis om te tellen. Pelletcellen door te draaien op 350 x g gedurende 3 min.
   5. Bepaal het celnummer met behulp van de trypan blauwe uitsluitingsmethode met behulp van een hemocytometer of een geautomatiseerde celteller. Resuspend cellen in steriele 1x PBS bij een concentratie van 5 x 10⁶ cellen/mL. Houd celopsusopening op ijs.
      OPMERKING: De levensvatbaarheid van tumorcellen moet gelijk of meer dan 80 % zijn om reproduceerbare tumorgroei te garanderen.
2. Onderhuidse inenting
   1. Meng de celsuspensie grondig en vul een spuit met een 26 G naald met 100 μL celsuspensie (5 x 10⁵ cellen) in steriele 1x PBS. Herhaal het mengen van cellen voordat u de volgende spuit laadt.
      OPMERKING: Houd cellen in de hele procedure op ijs om de levensvatbaarheid te behouden.
   2. Beperk de muis op de juiste manier, zodat de toegang tot de rechterflank onder te gaan. Inenting van de muis onderhuids op de geschoren rechterflank.
      OPMERKING: Zorg ervoor dat de inenting zich niet in het buikvlies bevindt door de naald iets op te tillen, wat zichtbaar moet zijn onder de huid. Een bellen-achtige knobbel moet vormen onder de huid na inenting.
   3. Controleer muizen zoals vereist door de toepasselijke ethische goedkeuring en voer chirurgische resectie uit wanneer de tumoren zijn gegroeid tot een grootte van ongeveer 50 mm².

2. Gedeeltelijke chirurgische resectie van de tumor

OPMERKING: Dit protocol vereist TWEE onderzoekers; een voor chirurgische ingrepen (CHIRURG), en een andere voor muismonitoring (ASSISTANT).

1. Chirurgie setup
   1. Op dag 12 na de inenting, wanneer tumoren een grootte van ongeveer 50 mm²hebben bereikt, dosismuizen met 100 μL (0,1 mg/kg) buprenorfine s.c. in de scruff van de nek, 30 minuten voor de operatie.
   2. Zet het chirurgische gebied met een warmtekussen bedekt met bankjas en zet een neuskegel voor anesthesie. Steriliseren chirurgische instrumenten voorafgaand aan het gebruik, en tussen elk dier met behulp van een warmte kraal sterilisator, waardoor gereedschappen om af te koelen voor gebruik. Laat de volgende chirurgische apparatuur schoon en binnen handbereik: chloorhexidine, wattenstaafje, gaas, ooggel, twee gebogen tangen, schaar, clip applicator, clip remover, clip vullingen (Figuur 2A, 2B).
   3. Verwarm de verwarmingskamer tot 37 °C en zet een ander warmtekussen voor terugwinning op (figuur 2C). Plaats gesteriliseerde gereedschappen op een steriel oppervlak, zoals autoclaved pads.
2. Anesthesie
   1. Plaats de muis in de inductiekamer en verdoven de muis met 4% isoflurane (4% in 100% zuurstof bij een stroomsnelheid van 1 L/min) totdat de ademhaling vertraagt tot ongeveer 60 ademhalingen per minuut (1 per seconde) (dit duurt meestal <1 min).
      LET OP: Laat de muis niet te lang in de kamer, omdat dat kan leiden tot verstikking en de dood. Slechts één muis tegelijk onder narcose.
   2. Breng de muis op het warmtekussen op de operatietafel, plaats de muis met zijn neus in de neuskegel en behoud de verdovingstoestand met 3-4% isoflurane in 100% zuurstof bij een stroomsnelheid van 0,5 L/min. Controleer de ademhalingssnelheid om ervoor te zorgen dat de diepte van anesthesie wordt gehandhaafd.
      OPMERKING: De ASSISTENT moet de ademhaling van de muis tijdens de operatie controleren om ervoor te zorgen dat het juiste niveau van anesthesie wordt gehandhaafd. Verlaag de verdovingsconcentratie als de ademhaling te langzaam wordt of verhoog de concentratie als de diepte van anesthesie te ondiep is. Als de muis begint te hijgen, verwijder de muis uit de neuskegel, verklein de verdovingsconcentratie en wacht tot de ademhaling normaliseert voordat u de neuskegel opnieuw plaatst.
   3. Voer een "pinch test" en "hoornvlies reflex test"¹⁴ om ervoor te zorgen dat de muis volledig verdoofd voordat de operatie begint.
      OPMERKING: Beweging van een deel van de muis is een indicatie dat de muis niet volledig verdoofd is. Het dier moet onmiddellijk extra verdoving krijgen door de verdovingsconcentratie te verhogen.
   4. Bedek de ogen van de muis met een kleine hoeveelheid oogheelkundige gel om oogdroogte te voorkomen.
3. Chirurgische ingreep (CHIRURG)
   1. Swab het chirurgische gebied 3 keer met alcoholische chloorhexidine. Met behulp van tangen en een schaar, maak een 1 cm rechte incisie langs de rugzijde, 3 mm afstand van de tumor (Figuur 3A, 3B).
      OPMERKING: Het standaardiseren van de incisie tot 1 cm in elke muis (met behulp van een liniaal) maakt een gelijkmatige beoordeling van wondgenezing tussen muizen mogelijk. Het lokaliseren van de incisie op 3 mm afstand van de tumor zorgt voor latere intratumorale adjuvante therapie zonder lekkage van de wond.
   2. Met behulp van pincet, weg te trekken de facia en onderhuids vetweefsel tussen de tumor en buikvlies. De onderhuidse tumor is normaal aan de huidzijde bevestigd.
   3. Open de wond door de huid voorzichtig op de tumorlagerzijde te houden met behulp van een pincet en "omkeren" de tumor, zodat deze buiten zichtbaar is(figuur 3C, 3D).
      OPMERKING: Het gedeelte van de tumor dat moet worden gedebulkt moet het dichtst bij de opening zijn, om voldoende huid te hebben om de wond te sluiten. Wees voorzichtig niet om de huid te snijden bij het verwijderen van de tumor.
   4. Met behulp van een schaar, snijd de tumor capsule uit de helft te verwijderen, te beginnen vanaf de basis van de tumor het dichtst bij de opening.
   5. Voor 50% debulk operatie, dwars door het midden van de tumor. Schep met gebogen tangen het gedeelte van de te verwijderen tumor op (50%); schep eventuele restanten uit het gedebulkte gebied op.
   6. Voor 75% debulk, het uitvoeren van een 50% tumor debulk als in deel 2.3.5 hierboven. Snijd vervolgens de helft van de resterende 50% van de tumor en schep 25% van de tumor, met behulp van gebogen tang zoals hierboven beschreven.
4. Het sluiten van de chirurgische site
   1. Plaats de resterende tumor terug onder de huid, en met behulp van tangen, trek de huid flappen samen en line-up van de huid langs de wond.
   2. Houd de huid bij elkaar op 5 mm van de rand van de wond en gebruik chirurgische clips om de wond te sluiten, beginnend aan de kant die het dichtst bij de tangen ligt. Breng zoveel clips aan als nodig is om ervoor te zorgen dat er geen onderliggend weefsel wordt blootgesteld. Over het algemeen worden drie tot vier clips toegepast met 2 mm tussenruimtes tussen clips.
      OPMERKING: Als er geen clips goed worden toegepast, verwijdert u deze met een clipverwijderaar en vervangt u nieuwe clips.
5. Herstel van muizen (ASSISTENT)
   1. Laat de muizen herstellen door ze in de warme (37 °C) verwarmingskamer te plaatsen.
   2. Plaats de kooi van de muis op het warmtekussen. Controleer de muizen in de verwarmingskamer totdat ze hersteld zijn van de verdoving (wakker en lopend) en zet de muizen vervolgens terug in de kooi. Laat de kooi nog 10 minuten op het warmtekussen staan, totdat de muizen actiever zijn geworden.
   3. Geef de muizen nat en zacht voedsel. Controleer de muizen 1 uur na de operatie voor herstel en zorg ervoor dat clips op hun plaats blijven. Zorg ervoor dat de kooi half aan/half van het warmtekussen staat, zodat dieren de temperatuur zelf kunnen regelen terwijl ze zonder toezicht zijn.
   4. Dosis muizen met 0,1 mg/kg buprenorfine (100 μL onderhuids in de scruff van de nek), 6-8 uur na de operatie (aan het eind van de dag). Monitor muizen vroeg de volgende ochtend en doseer muizen opnieuw met 0,1 mg/kg buprenorfine (100 μL onderhuids in de scruff van de nek). Geef meer nat voedsel als dat nodig is.
   5. Monitor muizen dagelijks voor de komende zeven dagen. Clips kunnen na zeven dagen worden verwijderd met behulp van de clipverwijderaar.
6. Adjuvante of neoadjuvante behandeling
   1. Behandel muizen peri-operatief met (neo)adjuvante therapie op een bepaald moment, afhankelijk van de behandeling van belang.
   2. Behandel bijvoorbeeld muizen met één dosis van 100 μg anti-CTLA-4 intraperitoneally (i.p.) op dag 15 na inenting, of met drie doses van 200 μg anti-PD-1 i.p. op dag 15, 17 en 19 na inenting.
7. Experimentele controles
   1. Bij het gebruik van dit model om de effecten van ontsteking/wondgenezing te beoordelen, overweeg dan het gebruik van de volgende controlegroepen: 1) No-surgery control (behandelingen kunnen nog steeds intratumorally worden toegediend); 2) Sham chirurgie controle: Een chirurgische incisie wordt gemaakt in de huid; de tumor wordt gemanipuleerd en blootgesteld, maar er wordt geen tumorweefsel verwijderd; de wond wordt afgesloten met clips.

Results

Tumorgroei tot een grootte van 50 mm² is een ideale grootte voor gedeeltelijke debulk. De onvolledige chirurgische resectie van 50 mm² tumoren resulteert in 100% (n=5) reproduceerbare hergroei van de tumoren bij afwezigheid van adjuvante immunotherapie (figuur 4A). Vervolgens gebruikten we het model om adjuvante immunotherapieën te testen met behulp van antilichamen tegen checkpointmoleculen Cytotoxisch T Lymphocyte Asso...

Discussion

Wij bieden een protocol voor een muismodel van onvolledige chirurgische resectie van weke delen sarcoom om peri-operatieve therapieën te testen. We hebben ook gestandaardiseerd de chirurgische incisie om beoordeling van wondgenezing tussen muizen na de behandeling mogelijk te maken.

Tumor plaatsing is een belangrijk onderdeel van dit protocol. We hebben gekozen voor een onderhuids tumormodel om gemakkelijke chirurgische toegang tot de tumorsite en toediening van lokale therapieën mogelijk te m...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
26 gauge 0.5 mL insulin syringe	Becton Dickinson, Australia	326769	None
2-Mercaptoethanol	Life Technologies Australia Pty Ltd	21985023	None
Anaestetic gas machine	Darvall Vet, Australia	SKU: 2848	None
Anti-CTLA-4	BioXcell, USA	BE0164	None
Anti-PD-1	BioXcell, USA	BP0273	None
Buprenorphine Hydrochloride Injection, 0.3mg/mL	RB healthcare UK Limited, UK	55175	Prescription order
Chlorhexidine Surgical Scrub 4%	Perigo Australia, Australia	CHL01449F(scrub	None
Fetal Bovine serum	CellSera, Australia	AU-FBS-PG	None
Forceps Fine 10.5 cm	Surgical house, Western Australia	CC74110	None
Forceps Fine 12 cm Serrated	Surgical house, Western Australia	CC74212	None
Forceps Halsted 14 cm	Surgical house, Western Australia	CD01114	None
Heating chamber	Datesand Ltd, UK	Mini-Thermacage	None
HEPES (1M)	Life Technologies Australia Pty Ltd	15630080	None
Isoflurane	Henry Schein Animal Health, Australia	SKU: 29405	Prescription order
Lubricating Eye Ointment	Alcon	n/a	None
Penicillin/streptomycin 1000X	Life Technologies Australia Pty Ltd	15140122	None
Phosphate Buffered Solution 10x	Life Technologies Australia Pty Ltd	70013-032	None
Reflex 7mm Clips	Able scientific, Australia	AS59038	None
Reflex 7mm Wound Clip Applicator	Able scientific, Australia	AS59036	None
Reflex Wound Clip Remover	Able scientific, Australia	AS59037	None
Rodent Qube Anesthesia Breathing Circuit	Darvall Vet, Australia	#7885	None
Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 Medium + L-glutamine	Life Technologies Australia Pty Ltd	21870092	None
Scissors Iris STR 11 cm	Surgical house, Western Australia	KF3211	None
Scissors Iris STR 9 cm	Surgical house, Western Australia	JH4209	None
Small Induction Chamber	Darvall Vet, Australia	SKU: 9630	None
TrypLE express 1x	Life Technologies Australia Pty Ltd	12604-021	None
Germinator 500 Glass Bead Sterilizer	Cellpoint Scientific Inc., USA	5-1460-DK