Multi-Component Lipid Nanotube Networks fabriceren met behulp van de Gliding Kinesin Motility Assay

Samenvatting

Dit protocol beschrijft een proces voor het fabriceren van lipide nanobuisnetwerken met behulp van glijdende kinesinemotiliteit in combinatie met gigantische unilamellaire lipideblaasjes.

Samenvatting

Lipide nanobuisjes (LNT) netwerken vertegenwoordigen een in vitro modelsysteem voor het bestuderen van moleculair transport en lipide biofysica met relevantie voor de alomtegenwoordige lipide tubuli in eukaryote cellen. In vivo LNT's zijn echter zeer niet-evenwichtsstructuren die chemische energie en moleculaire motoren vereisen om te worden geassembleerd, onderhouden en gereorganiseerd. Bovendien is de samenstelling van in vivo LNT's complex, bestaande uit meerdere verschillende lipidesoorten. Typische methoden om LNT's te extruderen zijn zowel tijd- als arbeidsintensief, en ze vereisen optische pincetten, microbeads en micropipettes om nanobuisjes met geweld uit gigantische lipideblaasjes te trekken. Hier wordt een protocol gepresenteerd voor de gliding motility assay (GMA), waarbij grootschalige LNT-netwerken snel worden gegenereerd uit gigantische unilamellaire blaasjes (GUVs) met behulp van kinesine-aangedreven microtubule motiliteit. Met behulp van deze methode worden LNT-netwerken gevormd uit een breed scala aan lipideformuleringen die de complexiteit van biologische LNT's nabootsen, waardoor ze steeds nuttiger worden voor in vitro studies van lipidebiofysica en membraangeassocieerd transport. Bovendien is deze methode in staat om in korte tijd (<30 min) op betrouwbare wijze LNT-netwerken te produceren met behulp van veelgebruikte laboratoriumapparatuur. LNT-netwerkkenmerken zoals lengte, breedte en lipidenverdeling zijn ook instelbaar door de lipidesamenstelling van de GUVs die worden gebruikt voor het fabriceren van de netwerken te veranderen.

Inleiding

De fabricage van lipide nanobuis (LNT) netwerken is van toenemend belang voor in vitro onderzoek van niet-evenwicht lipidestructuren ^1,2,3. Cellen gebruiken lipide tubuli voor het diffusieve transport van eiwitten⁴ en nucleïnezuren⁵ en cel-naar-cel communicatie ^6,7. Het endoplasmatisch reticulum en het Golgi-apparaat zijn bijzonder interessant, omdat deze membraangebonden organellen de primaire locaties zijn voor lipide- en eiwitsynthese en transport van deze integrale biomoleculen in het cytoplasma van een cel ^8,9. De membranen van deze organellen bestaan uit meerdere lipidesoorten, waaronder sfingolipiden, cholesterol en fosfolipiden¹⁰ die uiteindelijk helpen bij het definiëren van hun functionaliteit. Dus, om deze organellen nauwkeuriger te repliceren en te bestuderen, moeten in vitro LNT's worden vervaardigd uit blaasjes met steeds complexere lipideformuleringen¹¹.

Gigantische unilamellaire blaasjes (GUVs) worden alomtegenwoordig gebruikt voor het bestuderen van lipidemembraangedrag omdat ze betrouwbaar kunnen worden gesynthetiseerd met complexe formuleringen die cholesterol, fosfatidylcholine (PC), fosfatidylethanolamine (PE), fosfatidylserine (PS) en fosfatidylinositol (PI) ^{bevatten 12,13}. Hier wordt een methode beschreven om LNT's te fabriceren uit GUVs met verschillende lipideformuleringen met behulp van de gliding motility assay (GMA), waarbij LNT's worden geëxtrudeerd op basis van het werk dat wordt uitgevoerd door kinesinemotoren en microtubule-filamenten die op GUVs werken. In dit systeem stuwen kinesinemotoreiwitten geadsorbeerd aan een oppervlak gebiotinyleerde microtubuli aan, waardoor chemische energie van de hydrolyse van ATP wordt omgezet in nuttig werk (met name de extrusie van LNT's uit gebiotinyleerde blaasjes)¹¹. Het resulterende LNT-netwerk biedt een modelplatform om effecten van de verschillen in lipidefasen op veranderingen in LNT-morfologie te bestuderen.

In het kort worden kinesinemotoreiwitten in een stroomkamer ingebracht in een oplossing die caseïne bevat, waardoor de motoren op het glazen oppervlak van de kamer kunnen worden geplaatst. Vervolgens stromen gebiotinyleerde microtubuli in een oplossing die ATP bevat door de kamer en mogen ze binden aan de kinesinemotoren en beginnen met motiliteit. Een streptavidin-oplossing wordt vervolgens in de kamer ingebracht en mag niet-covalent aan de microtubuli binden. Ten slotte worden GUVs met een gebiotinyleerd lipide in de kamer gebracht en binden ze aan de gestreepte microtubuli en extruderen ze vervolgens LNT's om grootschalige netwerken te vormen in de loop van 15-30 minuten. Deze methode produceert grote, vertakte LNT-netwerken met behulp van standaard laboratoriumapparatuur en reagentia tegen lage kosten¹¹.

Protocol

1. Bereiding van voorraad microtubule oplossingen

LET OP: Veiligheidsbril, handschoenen en een laboratoriumjas moeten altijd worden gedragen tijdens het protocol.

1. Bereid 5x BRB80-buffer: voeg 24,19 g PIPES (piperazine-N,N′-bis[2-ethaansulfonzuur]) en 0,38 g EGTA (ethyleenglycol-bis[β-aminoethylether]-N,N,N′,N′-tetra-azijnzuur) toe aan een glazen fles van 1 L. Voeg 1 ml 1 M MgCl₂ toe en stel de pH in op 6,9 met KOH. Voeg gedeïoniseerd water toe om de oplossing op een eindvolume van 500 ml te brengen.
2. Bereid 100 mM voorraad GTP-oplossing: weeg 52 mg GTP af en suspensie in 1 ml gedestilleerd water. Verdeel 100 mM oplossing in 20 μL aliquots en bewaar bij -20 °C.
3. Gpem-oplossing bereiden: meng 200 μL 5x BRB80, 10 μL 100 mM GTP-oplossing, 100 μL 100% glycerol en 600 μL gedeïoniseerd water. Verdeel de GPEM-oplossing in 100 μL aliquots en bewaar in -20 °C.
4. Bereid microtubulioplossing door injectieflacons met in de handel verkrijgbare, gelyofiliseerde tubuline (één injectieflacon elk van gebiotinyleerd, fluorescerend geëtiketteerd en niet-geëtiketteerd) in koude (4 °C) GPEM-oplossing te reconstrueren tot een voorraadconcentratie van 5 mg/ml.
5. Voer microtubulepolymerisatie uit door 4 μL biotinylated tubulin, 4 μL fluorescerend gelabeld tubuline en 24 μL ongelabeld tubuline (allemaal bij concentraties van 5 mg / ml) te mengen om een verhouding van 1: 1: 6 te creëren bij een eindvolume van 32 ml. Houd het op ijs. Verdeel het tubulinemengsel in 2 μL aliquots en bewaar het bij -80 °C totdat het nodig is.
   OPMERKING: Efficiënte polymerisatie vereist dat de concentratie tubuline gelijk is aan of hoger is dan de kritische concentratie (5 mg / ml)¹⁴. Hier wordt de selectie van de tubulineverhouding geoptimaliseerd voor een voldoende concentratie gebiotinyleerd tubuline om streptavidin en GUVs efficiënt te binden, evenals een voldoende concentratie fluorescerende tubuline voor microscopische karakterisering.

2. Bereiding van gigantische unilamellaire blaasjes (GUVs)

1. Agarose filmvoorbereiding
   OPMERKING: Dit protocol is aangepast van Greene et ^al.15.
   1. Bereid een oplossing van 1% w/v door 1 g agarose in 100 ml gedeïoniseerd water in een Erlenmeyer van 250 ml te mengen. Gebruik een standaard magnetron om de agarose-oplossing gedurende 1-2 minuten te verwarmen.
      OPMERKING: De oplossing wordt doorschijnend zodra de agarose volledig is opgelost. Laat de oplossing voor gebruik afkoelen tot 65-75 °C.
   2. Gebruik een gesneden pipetpunt van 1.000 μL om 300-400 μL agarose-oplossing op een glazen afdeklip van 25 mm x 25 mm te pipeten. Terwijl u de rand van de coverslip met gehandschoende vingers vasthoudt, gebruikt u nog een pipetpunt van 1.000 μL om de gesmolten agarose gelijkmatig over de coverslip te verspreiden.
      OPMERKING: Door de agarose op 65-75 °C te houden, kunt u efficiënt op het oppervlak van de afdekplaat worden verspreid.
   3. Droog de met agarose gecoate dekplaten in een incubator van 37 °C gedurende ten minste 2 uur, waarna de agarose transparant wordt. Bewaar de coverslips door het agarose gecoate oppervlak naar boven gericht op een schoon oppervlak te plaatsen, zoals pluisvrij papier of op was gebaseerde film bij kamertemperatuur (RT).
2. Lipide formulering
   1. Haal in chloroform opgeloste lipiden uit een vriezer van -20 °C en plaats ze in een chemische zuurkast totdat ze RT bereiken.
   2. Bereken het volume lipidevoorraad van elke component lipide die nodig is voor de formulering met behulp van de volgende formule:
      
      Waarbij: _V-lipide het te gebruiken lipidevolume is, mol % het molaire percentage van de lipidecomponent, n het totale aantal mol lipide dat in de formulering wordt gebruikt en M de concentratie van lipide in molaire eenheden.
      OPMERKING: Als u bijvoorbeeld een formulering gebruikt die 45 mol% 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-fosfocholine (DOPC) bevat met een stockoplossingsconcentratie van 12,72 mM en 1 micromol totaal lipiden in de formulering, is het volume DOPC-voorraad dat in de formulering wordt gebruikt:
      
   3. Meng de lipiden samen in de berekende verhouding in een glazen injectieflacon in de chemische zuurkast.
   4. Pipetteer 30 μL lipideoplossing op de met agarose gecoate coverslips op een voorverwarmde hete plaat die boven het smeltpunt van de verzadigde lipidecomponent van de formulering is geplaatst (bv. hete plaat van 50 °C voor een lipide met T_m van 40 °C).
   5. Verdeel de oplossing in een cirkelvormige beweging over de agarosefilm met behulp van de lange rand van een naald van 18 G totdat de chloroform is verdampt en een uniforme laag lipide is gevormd. Houd de rand van de coverslip vast met gehandschoende vingers tijdens het uitvoeren van deze stap.
      OPMERKING: Zorg ervoor dat de agaroselaag niet met de naald wordt beschadigd.
   6. Plaats de coverslip met agaroselaag en lipidefilm in een met aluminiumfolie bedekte petrischaal, filmzijde naar boven gericht, en plaats de petrischaal gedurende ten minste 2 uur in een vacuümdesiccator om het resterende oplosmiddel te verwijderen.
3. Bereid ondertussen 560 mM sucrose-oplossing door 1,92 g sucrose te mengen met 10 ml gedeïoniseerd water.
   OPMERKING: De concentratie van de sucrose-oplossing is afhankelijk van de osmolariteit van de buffer-GUVs waarin wordt verdund. Doorgaans mag de osmolariteit van de sucroseoplossing niet meer dan 10% groter zijn dan de buffer waarin de GUVs worden verdund, met name de motiliteitsbuffer (zie stap 3.11).
4. GUV-formatie
   1. Bevestig een kleefkamer aan de coverslip bedekt met de lipidefilm door de kleefkamer voorzichtig op de met lipiden gecoate coverslip te drukken met de lipidefilm naar boven gericht, zodat een strakke afdichting wordt gevormd.
   2. Voeg 400 μL 560 mM sucrose-oplossing (bereid in stap 2.3) toe aan de kamer.
   3. Plaats de dekselslip in de vochtigheidskamer en sluit het deksel.
   4. Plaats de vochtigheidskamer op een voorverwarmde kookplaat boven het smeltpunt van de verzadigde lipidecomponent van de formulering.
   5. Laat blaasjes zich ≥1 uur vormen voordat u herstelt.
      OPMERKING: De vorming van blaasjes kan worden gecontroleerd met fluorescentiemicroscopie met een 40x luchtobjectieflens.

3. Bereiding van motiliteitstestvoorraden en reagentia

1. Bereiding van caseïnevoorraden
   1. Voeg 3 g droge caseïne toe aan een conische centrifugebuis van 50 ml, voeg vervolgens 30 ml 1x BRB80 toe en draai tot de oplossing stroperig wordt. Centrifugeer de buis bij 15.000 x g gedurende 30 minuten.
   2. Breng het supernatant over in een andere conische centrifugebuis van 50 ml en gooi de pellet weg. Filtreer de oplossing door een spuitfilter van 1 μm en verzamel de oplossing in een conische injectieflacon van 50 ml. Filtreer de oplossing door een filter van 0,2 μm en verzamel de oplossing in een conische injectieflacon van 50 ml.
   3. Bepaal de eiwitconcentratie door de absorptie bij 280 nm te meten met behulp van een UV-Vis spectrofotometer en kwarts cuvette.
   4. Bereken de caseïneconcentratie in mg/ml met behulp van de volgende formule:
      
   5. Verdun de oplossing tot 20 mg/ml in 1x BRB80, verdeel in aliquots van 100 μL en bewaar bij -20 °C.
2. Bereid glucoseoxidase (2 mg/ml) stamoplossing door 2 mg glucoseoxidase te mengen met 1 ml 1x BRB80. Verdeel in 100 μL aliquots en bewaar bij -20 °C.
3. Bereid catalase (0,8 mg/ml) stockoplossing door 0,8 mg catalase te mengen met 1 ml 1x BRB80. Verdeel in 100 μL aliquots en bewaar bij -20 °C.
4. Bereid 2 M glucose-oplossing door 0,3 g D-glucose in 1 ml gedeïoniseerd water te suspenseren. Verdeel in 100 μL aliquots en bewaar bij -20 °C.
5. Bereid 100 mM DTT-voorraad door 0,015 g DTT in 1 ml gedeïoniseerd water te suspenseren. Verdeel in 100 μL aliquots en bewaar bij -20 °C.
6. Bereid 100 mM Mg-ATP voorraad door 0,055 g dinatrium ATP te suspenseren in 1 ml oplossing van 100 mM MgCl₂. Verdeel in 100 μL aliquots en bewaar bij -20 °C.
7. Bereid 100 mM Mg-AMP-PNP-oplossing door 0,055 g AMP-PNP op te schorten in een 1 ml-oplossing van 100 mM MgCl₂, verdeel vervolgens in 100 μL aliquots en bewaar bij -20 °C.
8. Bereid 100 mM Trolox-oplossing door 25,03 mg Trolox toe te voegen aan 1 ml methanol en bewaar bij -20 °C.
9. Bereid 10 mg/ml streptavidinoplossing door 1 mg streptavidin toe te voegen aan 100 μL BRB80, verdeel vervolgens in 2 μL aliquots en bewaar bij -80ۛ °C.
10. Bereid BRB90CAT door 200 μL 5x BRB80, 20 μL caseïneoplossing, 10 μL MgATP-oplossing, 10 μL Trolox, 5 μL paclitaxeloplossing en 765 μL DI-water te mengen. Bewaren bij 4 °C.
11. Bereid de motiliteitsoplossing door 192 μL BRB80CAT, 2 μL D-glucoseoplossing, 2 μL glucoseoxidaseoplossing, 2 μL DTT-oplossing en 2 μL catalaseoplossing te mengen. Bewaren bij 4 °C.
12. Bereid een kinesineoplossing van 1 μM door de stockkineïneoplossing in BRB80CAT te verdunnen (bijv. 2 μL 50 mM kinesineoplossing in 98 μL BRB80CAT) en bewaar bij 4 °C.
13. Bereid een microtubuleoplossing van 10 μg/ml door 10 μL gestabiliseerde microtubuli te verdunnen in 90 μL BRB80CAT bij kamertemperatuur. Winkel bij RT.
14. Bereid een streptavidinoplossing van 10 μg/ml door 0,1 μL 10 mg/ml streptavidinoplossing toe te voegen aan 99,9 μL motiliteitsoplossing. Bewaren bij 4 °C.
15. Bereid een 12x GUV-oplossing door 5 μL GUV-bouillon te verdunnen tot 55 μL motiliteitsoplossing. Bewaren bij 4 °C.
16. Polymerisatie van tubuline tot microtubuli
    1. Haal een vooraf bereide aliquot tubuline van 2 μL uit de vriezer van -80 °C (bereid in stap 1.5) en plaats gedurende 30 minuten in een waterbad van 37 °C.
    2. Bereid een paclitaxeloplossing van 2 mM door toevoeging van 1,71 mg paclitaxel in 1 ml watervrije DMSO, verdeel in 10 μL aliquots en bewaar bij -20 °C.
    3. Bereid BRB80T vers door 99,5 μL 1x BRB80 te mengen met 0,5 μL 2 mM paclitaxel.  Verwarm 100 μL BRB80T tot 37 °C in het waterbad.
    4. Voeg na 30 minuten de 100 μL BRB80T toe aan het tubuline aliquot om de microtubuli te stabiliseren. Winkel bij RT.

4. Glijdende motiliteitstest (GMA)

1. Bereid een stroomkamer voor door twee stroken dubbelzijdige tape, gescheiden door 5 mm, op een glazen schuif te bevestigen. Herhaal dit proces totdat elke strip drie lagen tape bevat.
2. Plaats een coverslip op de tape en druk vervolgens zachtjes op de coverslip / tape-interface met een pincet of pen om voldoende hechting te garanderen.
   OPMERKING: Het kanaal moet 5 mm breed en 25 mm lang en 300 mm hoog zijn.
3. Pipetteer 30 μL 1 mm kinesineoplossing (bereid in stap 3.12) in de stroomcel en laat deze gedurende 5 minuten incuberen.
   OPMERKING: De caseïne vormt een dubbellaag op het oppervlak van de coverslip / glasschuif en vergemakkelijkt de bevestiging van de kinesinestaart aan het oppervlak.
4. Pipetteer 30 μL van 10 μg/ml microtubulioplossing (bereid in stap 3.13) in de stroomcel, met behulp van een laboratoriumdoekje dat zachtjes tegen het andere uiteinde van het stroomkanaal wordt gedrukt om de uitwisseling van oplossingen te vergemakkelijken. Incubeer gedurende 5 min.
5. Was de flowcel 1x–3x met 1x motiliteitsoplossing op RT (bereid in stap 3.11).
   OPMERKING: Fluorescentiemicroscopie met behulp van een 40x luchtobjectief kan op dit punt worden gebruikt om de aanhechting en beweeglijkheid van microtubuli te bevestigen. Microtubuli verschijnen als fluorescerende filamenten (tientallen micron lang) die met ~0,5 μm/s over het oppervlak bewegen (glijden).
6. Pipetteer 30 μL van 10 μg/ml streptavidinoplossing (bereid in stap 3.14) in de stroomcel met behulp van een laboratoriumveeg dat zachtjes tegen het andere uiteinde van het stroomkanaal wordt gedrukt om de uitwisseling van oplossingen te vergemakkelijken. Incubeer gedurende 10 min.
7. Laat 30 μL 12x GUV-oplossing (bereid in stap 3.15) in de stroom stromen met behulp van een laboratoriumdoekje dat zachtjes tegen het andere uiteinde van het stroomkanaal wordt gedrukt om de uitwisseling van oplossingen te vergemakkelijken. Incubeer gedurende 30 min.
8. Voeg 2 μL 100 mM AMP-PNP-oplossing (bereid in stap 3.7) toe om de beweeglijkheid te stoppen en sluit de kamer vervolgens af met kit.

5. LNT-netwerkkarakterisering

1. Breng de stroomkamer over naar een omgekeerde microscoop voor beeldvorming.
2. Kies de juiste filterset op basis van de golflengten van de gebruikte fluorescerende lipiden of tubuline. Gebruik bijvoorbeeld bij het gebruik van Texas Red-gelabelde lipiden een 560 nm / 25 nm excitatiefilter en een 607 nm / 36 nm emissiefilter.
3. Gebruik een 100x olieobjectief om te focussen op het oppervlak van de coverslip.
4. Breng de LNT-netwerken in beeld met behulp van fluorescentiemicroscopie.
   OPMERKING: LNT's zijn lineaire structuren die extruderen uit de grotere blaasjes. LNT's zijn veel kleiner dan GUVs en hebben zwakkere fluorescentiesignalen. De belichting en het contrast moeten dus worden aangepast aan de LNT's van afbeeldingen. Deze aanpassingen leiden ook tot overbelichting van de GUVs, en daarom wordt aanbevolen om de lamellriteit en fasescheiding in GUVs onafhankelijk te karakteriseren.
5. Richt de microscoop op een interessant netwerk en maak een standaard of betegelde afbeelding.
6. Pas de belichtingstijd en neutrale dichtheidsfilters aan om de LNT's in beeld te brengen en de verzadigde belichting van de GUVs te minimaliseren. Verkrijg afbeeldingen in zowel rode als groene kanalen.
   OPMERKING: Hier maakt het rode kanaal visualisatie van de Texas-Red lipiden mogelijk, terwijl het groene kanaal visualisatie van de microtubuli mogelijk maakt (bijv. Oregon Green lipiden en HiLyte488 kleurstoffen).
7. Maak een samengestelde afbeelding door de rode en groene kanalen te bedekken (afbeelding 1).
8. Karakterisering van LNT-netwerken door LNT-lengte te meten
   1. Open de verkregen afbeeldingen met behulp van een beeldanalysesoftware zoals ImageJ.
   2. Kalibreer de schaal voor de microscoop met behulp van de functie Ingestelde schaal, vul de pixels in op de mm-conversiefactor en klik op OK.
      OPMERKING: De conversiefactor is afhankelijk van de microscoop, objectieflens en camera en kan worden verkregen met behulp van een microscoopkalibratiedia. Het wordt over het algemeen uitgedrukt in pixels/mm.
   3. Gebruik het gereedschap Meerpuntslijn om de lengte van de nanobuisjes te meten vanaf de bovenliggende GUV. Houd Ctrl +M ingedrukt om de lengte te meten.
   4. Ga door met het meten van de lengtes van afzonderlijke buizen volgens de bovenstaande stappen. De beeldverwerkingstool slaat elke nieuwe meting op in het resultatenvenster.
   5. Houd Ctrl + D ingedrukt na het tekenen van elke lijn om bij te houden welke buizen zijn gemeten.
9. LNT-dikte meten (figuur 2)
   1. Open de afbeelding in ImageJ en selecteer de functie Drempel onder het tabblad Afbeelding .
   2. Klik op Toepassen om de drempel toe te passen.
   3. Teken een rechthoek van bekende lengte over de gewenste buis (zwarte pixels hebben een waarde van 0 en rode pixels hebben een waarde van 255).
   4. Meet de geïntegreerde dichtheid van het gebied.
   5. Deel de dichtheid door de lengte (in pixels) van de LNT om de dikte (in pixels) te verkrijgen.
      OPMERKING: De diktemetingen mogen alleen worden vergeleken tussen afbeeldingen wanneer de beeldinstellingen en drempelwaarde identiek zijn ingesteld.
10. Bepaling van de lipidepartitionering in knooppunten van LNT's (figuur 3)
    1. Open de afbeelding in ImageJ.
    2. Gebruik het gereedschap Lijn om een lijn over het gewenste knooppunt te tekenen.
    3. Meet de knooppuntintensiteit in zowel de Oregon Green- als de Texas Red-kanalen.
    4. Verplaats de lijn naar de LNT en meet de LNT-intensiteit in zowel de Oregon Green- als de Texas Red-kanalen.

Resultaten

LNT-netwerken (figuur 4) werden vervaardigd met behulp van het beschreven protocol, dat het werk gebruikt dat wordt uitgevoerd door kinesinetransport van microtubuli om LNT's uit GUVs te extruderen. In het kort werden GUVs bereid met behulp van agarose gel rehydratie met behulp van sucrose-oplossing, en microtubuli werden gepolymeriseerd in GPEM-oplossing en gestabiliseerd in BRB80T. Vervolgens werden kinesinemotoren in een stroomcel geïntroduceerd die een actieve laag motoren op het oppervl...

Discussie

LNT-netwerken zijn een nuttig hulpmiddel voor in vitro studies naar membraaneigenschappen en het transport van biomoleculen zoals transmembraaneiwitten. Bovendien maakt het gebruik van complexe lipideformuleringen om LNT-netwerken te fabriceren meer biologisch relevante studies mogelijk. Andere fabricagestudies hebben 1) eenvoudige lipideformuleringen en multilamellaire blaasjes of 2) meer omslachtige motiliteitstechnieken gebruikt om netwerken te fabriceren van GUVs die bestaan uit complexe lipideformuleringen. De hier ...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
100x/1.4 Numerical Aperture Oil Immersion Objective	Olympus	1-U2B836	Olympus UPlanSApo 100x/1.40 Oil Objective Infinity Corrected, RMS Thread Werkafstand 0,12 mm
3.0 ND Filter	Olympus		Neutrale dichtheidsfilter
AMP-PNP	Sigma-Aldrich	A2647	(β,γ-imidoadenosine 5′-trifosfaat)
ATP	Sigma-Aldrich	A7699	Adenosine 5'-trifosfaat dinatriumzout hydraat BioXtra
Brightline Pinkel DA/FI/TR/Cy5/Cy7-5X-A000 filter set	Semrock	LED-DA/FI/TR/Cy5/Cy7-5X-A-000	BrightLine Pinkel filterset, geoptimaliseerd voor DAPI, FITC, TRITC, Cy5 & Cy7 en andere soortgelijke fluoroforen, verlicht met op LED gebaseerde lichtbronnen
Caseïne	Sigma-Aldrich	22090	Caseïne hydrolysaat voor microbiologie
Catalase	Sigma-Aldrich	C9322	Catalase uit runderlever
Chloroform	Sigma-Aldrich	288306	Chloroform watervrij bevat 0,5-1,0% ethanol als stabilisator
Cholesterol	Avanti	700000P	cholesterol (schapenwol, >98%) (poeder)
D-Glucose	Sigma-Aldrich	G7021	D-(+)-Glucose poeder, BioReagent, geschikt voor celcultuur, geschikt voor insectencelcultuur, geschikt voor plantencelcultuur, ≥99,5%
DOPC	Avanti	850375C	1,2-Dioleoyl-sn-glycero-3-fosfocholine (in chloroform)
DOPE-Biotin	Avanti	870282C	1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-fosfoethanolamine-N-(biotinyl) (natriumzout)
DPPC	Avanti	850355P	1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-fosfocholine (poeder)
DPPE-Biotin	Avanti	870285P	1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-fosfoethanolamine-N-(biotinyl) (natriumzout)
DTT	Sigma-Aldrich	43816	DL-Ditiotreitol oplossing 1 M
EGTA	Sigma-Aldrich	E4378	EGTA, Egtazic zuur, Ethylene-bis(oxyethyleenitrilo)tetraazijnzuur, Glycol ether diamine tetraazijnzuur
Glucose Oxidase	Sigma-Aldrich	G6125	Glucose Oxidase uit Aspergillus niger Type II, ≥10.000 eenheden/g vaste stof (zonder toegevoegd zuurstof)
Glycerol	Fisher	G33	Glycerol (Gecertificeerd ACS), Fisher Chemical
GTP	Sigma-Aldrich	G8877	Guanosine 5′-trifosfaat natriumzout hydraat
IX-81 Olympus Microscope	Olympus	N/A	IX81 Inverted Microscope van Olympus
KOH	Sigma-Aldrich	1050121000	Kaliumhydroxide
Magnesium Chloride	Sigma-Aldrich	M1028	1,00 M magnesiumchlorideoplossing
Orca Flash 4.0 Digital Camera	Hamamatsu	C13440-20CU	ORCA-Flash 4.0 V3 Digital CMOS camera
Oregon Green-DHPE	Invitrogen	O12650	Oregon Green 488 1,2-Dihexadecanoyl-sn-Glycero-3-Fosfoethanolamine
Paclitaxel	ThermoFisher	P3456	Paclitaxel (Taxol Equivalent) - alleen voor gebruik in onderzoek
PIPES	Sigma-Aldrich	P6757	1,4-Piperazinediethanesulfonzuur, Piperazine-1,4-bis(2-ethaansulfonzuur), Piperazine-N,N′-bis(2-ethaansulfonzuur)
Texas Red-DHPE	Invitrogen	T1395MP	Texas Red 1,2-Dihexadecanoyl-sn-Glycero-3-Fosfoethanolamine, Triethylammoniumzout
Trolox	Sigma-Aldrich	238813	(±)-6-Hydroxy-2,5,7,8-tetramethylchromaan-2-carbonzuur
Tubulin, Biotin	Cytoskeleton	T333P	Tubuline-eiwit (biotine) varkensbrein
Tubulin, Hy-Lite 488	Cytoskeleton	TL488M	Tubuline-eiwit (fluorescent HiLyte 488) varkensbrein
Tubulin, Unlabeled	Cytoskeleton	T240	Tubuline-eiwit varkensbrein