Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Isolatie en karakterisering van volwassen cardiale fibroblasten en myofibroblasten

15.9K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/60909

⸱

12 maart 2020

 ,  ,  , 
1Department of Pathology, Microbiology, and Immunology, Vanderbilt University Medical Center, 2American Red Cross, National Headquarters

In dit artikel

Samenvatting

Het verkrijgen van een zuivere populatie van fibroblasten is cruciaal voor het bestuderen van hun rol in wondherstel en fibrose. Hier beschreven is een gedetailleerde methode om fibroblasten en myofibroblasten te isoleren van niet gewonde en gewonde muisharten, gevolgd door karakterisering van hun zuiverheid en functionaliteit door immunofluorescentie, RTPCR, fluorescentie-ondersteunde cel sorteren, en collageen gel contractie.

Samenvatting

Hartfibrose in reactie op letsel is een fysiologische reactie op wondgenezing. Er zijn inspanningen geleverd om fibroblastsubtypes te bestuderen en te targeten die fibrose beperken. Echter, fibroblast onderzoek is belemmerd als gevolg van het ontbreken van universeel aanvaardbare fibroblast markers om rustige en geactiveerde fibroblasten te identificeren. Fibroblasten zijn een heterogene celpopulatie, waardoor ze moeilijk te isoleren en te karakteriseren. Het gepresenteerde protocol beschrijft drie verschillende methoden om fibroblasten en myofibroblasten te verrijken van niet-gewonde en gewonde muisharten. Met behulp van een standaard en betrouwbaar protocol om fibroblasten te isoleren zal de studie van hun rol in homeostase en fibrose modulatie mogelijk te maken.

Inleiding

Cardiale fibroblasten, cellen van mesenchymale oorsprong, spelen een belangrijke rol bij het behoud van de elektrische geleiding en mechanische krachten in het hart in aanvulling op het onderhoud van cardiale architectuur tijdens homeostase1. Na letsel worden deze cellen geactiveerd, uittevouwen en produceren extracellulaire matrix (ECM) eiwitten2. Veel preklinische studies hebben aangetoond fibroblasten als kritische cellulaire regulatoren die de structurele integriteit van een gewond hart3 te handhaven, evenals de belangrijkste effector cellen die verantwoordelijk zijn voor ongecontroleerde productie en afzetting van ECM eiwitten, wat resulteert in stijve littekenvorming en hartfalen4. Fibroblasten zijn een heterogene groep cellen, waardoor het een uitdaging is om hun herstellende functie te ontleden van pro-fibrotische onaangepaste eigenschappen. Onlangs is de functionele heterogeniteit van twee verschillende fibroblast subtypes na myocardiale letsel gedefinieerd, wat wijst op de mogelijkheid van het isoleren van verschillende fibroblast subtypes en het bestuderen van hun rol in wondgenezing5.

Het verkrijgen van een pure fibroblast bevolking is cruciaal in het aflijnen van hun functionele rol in reparatie en fibrose. Echter, de aanwezigheid van meerdere fibroblast markers die andere celtypes herkennen maken het een uitdaging om een wezenlijk zuivere fibroblast bevolking te isoleren6. Verschillende elegante studies hebben slimme manieren bedacht om cardiale fibroblasten te isoleren van niet-gewonde en gewonde myocard. De meest populaire en gevestigde methode voor het verrijken van fibroblasten is door selectieve hechting na enzymatische weefselvertering7.

Bovendien is met de fluorescentie geactiveerde celsortering (FACS) van fibroblasten op basis van celoppervlakteantigenen met succes beschreven8. In de studie, na enzymatische spijsvertering, werden de mesenchymale cellen gesorteerd als lineage-negatief (Lin: Ter119−CD45−CD31−) en gp38-positief (gp38+) van muisharten. Gp38+ve cellen werden bevestigd te zijn fibroblasten op basis van hun co-expressie van col1α1 en andere mesenchymale markers. Hoewel de meeste weefselvertering is voltooid na het ontleden van de ventrikel in een petrischaaltje, heeft een recente studie het gebruik van een direct naaldenzym perfusie van de linker ventrikel onderzocht om myocyten en niet-myocyten te isoleren, waaronder fibroblasten9. Fibroblasten werden vervolgens geïsoleerd door selectieve hechting in dit geval.

Dit protocol beschrijft de isolatie en verrijking van fibroblasten met behulp van drie methoden. De eerste is een reeds vastgestelde methode waarbij selectieve hechting van fibroblasten na enzymatische spijsvertering. De tweede methode wordt gebruikt om voornamelijk te isoleren letsel-geïnduceerde alpha gladde spier uitdrukken myofibroblasten. De derde methode omvat sequentiële, magnetische uitputting van een enzym-verteerd hartcel suspensie van hematopoietische en endotheelcellen. Na uitputting worden fibroblasten/myofibroblasten geïsoleerd op basis van de aanwezigheid van het antigeen MEFSK4 met behulp van magnetische kralen. Onlangs is MEFSK4 beschreven als een antigeen aanwezig op zowel rustige als geactiveerde fibroblasten, waardoor het een geschikte marker is voor fibroblastidentificatie en isolatie. Natuurlijk, alle methoden hier beschreven hebben unieke beperkingen. Het wordt daarom ten zeerste aanbevolen om de zuiverheid van de geïsoleerde celpopulatie te controleren door stroomanalyse, immunostaining en semi-kwantitatieve real-time PCR. Echter, deze methoden kunnen worden uitgebreid op, en extra markers kunnen worden toegevoegd om andere vervuilende populaties uit te sluiten voorafgaand aan het gebruik van de fibroblast en myofibroblast populaties voor cruciale experimenten uit te sluiten.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

Deze studie houdt zich strikt aan de aanbevelingen in de Gids voor de Zorg en Het Gebruik van Proefdieren van de Nationale Instituten voor Gezondheid. Het Comité Institutionele Dierenverzorging en -gebruik van de Universiteit Vanderbilt keurde het protocol goed (protocolnummer: M1600076-01).

1. Hartdissectie

  1. Voorbereiding van de oplossing
    1. KHB-buffer
      1. Los met behulp van een roerstaaf langzaam 9,4 g Krebs-Henseleit buffer (KHB) poeder op in 900 mL DDI-water.
        LET OP: Buffer zal neerslaan als te snel of te lang geroerd. KHB buffer moet koud zijn tijdens fibroblast isolatie.
      2. Voeg 2,9 mM CaCl2 en 24 mM NaHCO3toe. Pas de pH aan op 7,2–7,3 en verdun tot een volume van 1 L met dH2O.
      3. Met behulp van een steriel filter (0,22 μm) bewaar je maximaal 4 weken bij 4 °C. Houd op ijs of op 4 °C voor de duur van isolatie.
    2. Collagenase digestie cocktail
      1. Bereid de spijsvertering cocktail de dag van fibroblast isolatie. Bepaal het juiste volume van de spijsvertering cocktail op basis van het aantal harten; 5 mL cocktail per 1 hart.
      2. Bereid collageenase mix (zie Tabel met materialen) en DNase I volgens de instructies van de fabrikant.
      3. Voor 20 mL totale vergistingscocktail voegt u 17,5 μL DNase I, 180 μL van 1 M HEPES en 500 μL collagenase toe aan een lege conische buis van 50 mL.
      4. Voeg een voldoende volume van Hank's Balanced Salt oplossing (HBSS) toe met Ca2+ en Mg2+ om een totaal volume van 20 mL te verkrijgen.
    3. Rode bloedcel (RBC) lysis buffer
      1. Bepaal het totale benodigde volume op basis van het aantal harten (5 mL/hart). Verdun de 10x RBC lysis voorraadbuffer tot 1x met dH2O.
    4. Fibroblast media: 10% FBS in DMEM F-12
      1. Voeg 10% FBS toe aan DMEM-F12 met L-glutamine en HEPES. Voeg 10 U/mL penicilline/streptomycine, 2,5 μg/mL antischimmel en 2,5 μg/mL mycoplasma profylactisch toe (zie Materiaaltabel). Bewaar bij 4 °C.
  2. Hartdissectie
    1. Bereid een 6 put plaat op ijs met 2 mL koude KHB per put om harten op te slaan in tijdens dissectie. Gebruik autoclaved chirurgische schaar en tangen.
    2. Euthanaseren muizen op 12 weken of ouder door isoflurane overdosis, en volg met cervicale dislocatie.
    3. Als alternatief, voor geactiveerdfibroblast isolatie, induceren hartinfarct bij 12 weken oude muizen door kransslagader ligatie10. Euthanaseren de muizen 8-10 dagen na letsel.
    4. Spray lichaam met 70% ethanol en oriënteren, zodat de ventrale kant wordt geconfronteerd met de experimentator. Maak aanhangsels vast of beperk ze om interferentie te voorkomen.
    5. Snijd de buikhuid en spieren open, maar vermijd piercing de lever. Snijd verticaal naar het borstbeen, en zorgvuldig open de thorax terwijl het vermijden van piercing van het hart. Blijf door de ribbenkast snijden om het hart bloot te leggen.
    6. Met behulp van tangen, voorzichtig til het hart uit de borst, het wegsnijden van een long of overtollig weefsel aan de buitenkant van het hart. Verwijder de ventrikel en plaats in een put van 6 goed plaat met koude KHB. Blijf harten ontleden op deze manier totdat alle monsters zijn geïsoleerd.
  3. Enzymatische dissociatie van hart
    1. Met behulp van tangen, herhaaldelijk knijpen en ageerte het hart in KHB om overtollig bloed te verwijderen. Breng het hart naar een schone steriele plaat van 10 cm2. Met behulp van een enkel randblad, snel gehakt van het hart in kleine stukjes.
    2. Voeg 1 mL collageenals spijsvertering cocktail en blijven snijden totdat stukken zijn klein genoeg om over te dragen met een 1 mL micropipette. Breng stukken over naar een conische buis van 50 mL met een micropipette van 1 mL. Was plaat 2x met 2 mL collagenase digestie cocktail.
      OPMERKING: Het afsnijden van een deel van de pipet tip kan helpen bij het verzamelen van grotere stukken hart die anders kunnen vast komen te zitten in de pipet tip.
    3. Incubeer conische buis bij 37 °C gedurende 30 min met schommelen of agitatie. Veilige buis als dat nodig is. Resuspend 10x met een 5 mL pipet totdat de inhoud homogeen is, en uitbroed de conische buis bij 37 °C gedurende 15 minuten met rotatie of agitatie.
    4. Resuspend 10x met een 10 mL pipet tot homogeen. Prime een 40 μm cel zeef door het bevochtigen van het filter met 1-2 mL KHB buffer op de top van een nieuwe 50 mL conische buis. Voeg 25 mL KHB-buffer toe aan de vertering, bretel en filter door een geprimede 40 μm celzeef. Verander het filter indien nodig.
      OPMERKING: Als filtratie vertraagt, licht tikken buis of het gebruik van een 1 mL micropipet te trekken schorsing van de onderkant van het filter kan helpen de cel vering passeren door een gedeeltelijk geblokkeerde 40 μm cel zeef.
    5. Centrifugebij 400 x g en 4 °C gedurende 10 min. Verwijder de supernatant en bredig de pellet opnieuw op in 1x RBC lysebuffer (5 mL/hart). Incubeer gedurende 2 min bij kamertemperatuur (RT).
    6. Centrifugeer bij 400 x g en RT gedurende 10 min. Verwijder supernatant en was vervolgens door pellet in 1 mL KHB-buffer opnieuw op te schorten.
    7. Voeg 9 mL KHB buffer toe en filter door geprimed 40 μm celzeef in nieuwe 50 mL conische buis. Centrifugeer bij 400 x g en RT gedurende 10 min.
    8. Verwijder de supernatant, resuspend in 1 mL van fibroblast media of PBS, en bepalen het celnummer. Fibroblasten kunnen worden geïsoleerd door de drie verschillende methoden hieronder beschreven.

2. Isolatie van fibroblasten van eencellige suspensie

  1. Fibroblastisolatie: differentiële beplating (figuur 1)
    1. Bereid een 6-goed plaat door het toevoegen van 2 mL van fibroblast media per goed en wervelende de plaat om de put bodem te dekken.
    2. Cellen opnieuw opschorten in 1 mL media per hart. Plaat 1 mL celvering per put zodanig dat één hart (theoretisch) per put wordt verguld. Bijvoorbeeld, zes harten zou worden opnieuw opgehangen in 6 mL van de media, vervolgens verguld in zes putten met 1 mL cel vering per put.
    3. Swirl plaat gelijkmatig te verdelen cellen. Voeg een extra 1-2 mL media per put voor een totaal volume van maximaal 5 mL per put, en incubeer op 37 °C voor 4 uur.
    4. Fibroblasten zullen worden gescheiden door selectieve hechting na 4 uur. Verwijder ongebonden en dode cellen door het verwijderen van media. Was de aangesloten cellen met 2 mL PBS en voeg 2-4 mL steriele fibroblast media per put. Incubeer bij 37 °C tot confluent. Verander media elke 2-4 dagen.
  2. Fibroblast Isolatie: FACS met behulp van een GFP reporter muis model(Figuur 1)
    1. FACS-buffer
      1. Bereid 15 mL van 5% foetaal runderserum (FBS) in dPBS zonder Ca2+ en Mg2+. Bewaar op ijs of bij 4°C.
    2. FC blokkeroplossing
      1. Bereid 0,5 μL FC-blokker (gezuiverde antimuis-CD16/CD32) voor in 25 μL FACS (1:50 verdunning). Per monster is 25 μL FC-blokkeroplossing vereist. Bewaar op ijs of bij 4 °C.
    3. Monstervoorbereiding en vlekken van antilichamen
      OPMERKING: Antilichaamverdunningen kunnen van tevoren worden voorbereid, maar dit kan licht of temperatuurblootstelling riskeren.
      1. Bereid 7AAD of Ghost kleurstof violet 510 dat is 2x de vereiste verdunning in FACS buffer. Zie tabel 1 voor antilichamen en verdunningen.
      2. Schors500.000 vers geïsoleerde cellen in 25 μL FC-blokkeroplossing om niet-specifieke binding van het FC-antilichaamgebied aan een FC-receptor te voorkomen. Incubeer voor 5 min bij RT.
      3. Voeg 7AAD of Ghost dye violet 510 antilichaam toe aan het uiteindelijke volume van 25 μL celvering. Incubeer 30-60 min op ijs in het donker.
      4. Wassen door opnieuw op te schorten in 1 mL FACS buffer. Centrifugeer bij 500 x g gedurende 5 min bij 4°C.
      5. Pellet opnieuw opschorten in het aanbevolen stroomcytometriemonstervolume van de FACS-buffer (300 μL) en overzetten naar stroomcytometriebuis.
    4. Fluorescentie-geactiveerde celsortering (FACS)
      OPMERKING: GFP-αSMA reporter muizen waren een bijdrage van Dr. Ivo Kalajzic11. Deze muis drukt GFP uit onder de promotor alpha smooth muscle cell (αSMA). αSMA is gebruikt als marker van geactiveerde fibroblasten (myofibroblasten)12.
      1. Voor geactiveerd fibroblast (αSMA uitdrukken myofibroblast) isolatie, induceren myocardiale infarct in 12 week oude GFP-αSMA muizen door coronaire slagader ligaatie. Offer de muizen 8-10 dagen na letsel op.
      2. Na eencellige vering van de gewonde muizenharten sorteer t αSMA+ve fibroblasten voor groen fluorescerend eiwit (GFP). Gebruik niet-gekleurde niet-gewonde fibroblasten om het achtergrondsignaal in het GFP-kanaal na compensatie in te stellen.
      3. Gate voor live GFP+ve cellen door gating voor7AAD-ve/GFP+ve cellen of Ghost dye violet 510-ve/GFP+ve cellen en sorteren GFP uitdrukken αSMA+ ve myofibroblasten. Verzamel de cellen in fibroblast media.
  3. Fibroblast isolatie: magnetische kraal gebaseerde isolatie van fibroblasten (Figuur 1)
    1. Equilibratiebuffer
      LET OP: Bereid altijd een nieuwe buffer voor isolaties.
      1. Bereid 0,5% BSA en 2 mM EDTA voor in PBS. Ontgas de buffer door de oplossing te roeren terwijl u een vacuüm aan het deksel van de container bevestigt.
        OPMERKING: Roeren verwijdert overtollig gas uit de oplossing die vervolgens wordt verwijderd door het vacuüm zodanig dat bellen niet verstoppen de scheiding kolom bij gebruik.
    2. Magnetische etikettering: CD45+ hematopoietische cellen
      1. Centrifugeer geïsoleerde cellen uit muizenharten met 500 x g gedurende 5 min en verwijder vervolgens de supernatant.
      2. Resuspend de cel pellet in 1 mL van evenwicht buffer. Tel de cellen met behulp van een hemocytometer.
      3. Centrifugeer de celsuspensie zoals hierboven en breg de celpellet opnieuw op in een equilibratiebuffer van 90 μL per 1 x 107 totale cellen. Voeg 10 μL CD45+ magnetische kralen per 1 x 107 totale cellen toe. Meng goed en incubeer gedurende ten minste 15 min bij 4°C.
      4. Was cellen door 2 mL equilibratiebuffer per 1 x 107 totale cellen toe te voegen en centrifugeer vervolgens bij 500 x g gedurende 10 min bij 4°C.
      5. Verwijder supernatant, tel de cellen met behulp van een hemocytometer en brep tot 1 x 107 totale cellen in 2 mL van evenwichtbuffer. Als er meer dan 107 cellen aanwezig zijn, schaalt u de buffer lineair. Geef cellen door een 40 μm-filter om te voorkomen dat celaggregaties de scheidingskolommatrix verstoppingen.
    3. Magnetische scheiding: CD45+ hematopoietische cellen
      1. Plaats scheidingskolom in het magnetisch veld van een geschikte scheidings- en equilibratekolom met ten minste 3 mL PBS.
      2. Verzamel niet-gelabelde cellen in de flowthrough (FT) en was kolom 3x met 3 mL equilibratiebuffer. Verzamel wasbeurten met FT. Verwijder de kolom van de separator. Plaats de kolom op een conische buis van 15 mL.
      3. Spoel magnetisch gelabelde CD45+ cellen door 5 mL equilibratiebuffer op de kolom te besuialeren en de cellen stevig te storten met een zuiger die bij de kolom wordt geleverd.
      4. Centrifuge eluent evenals FT / wash fracties op 500 x g. Tel de cellen met behulp van een hemocytometer.
    4. Magnetische etikettering en scheiding: CD31+ endotheelcellen
      1. Herhaal protocol voor CD45+ magnetische etikettering en scheiding (secties 2.3.2–2.3.3), behalve cd31+ magnetische kralen gebruiken om uit te broeden met de FT en delen van de CD45+ isolatie te wassen.
    5. Magnetische etikettering en scheiding: MEFSK4+ fibroblasten
      1. Herhaal protocol voor CD45+ magnetische etikettering met behulp van de MEFSK4 anti-feeder-APC antilichaam in plaats van magnetische kralen. Centrifugeer de FT en Was porties uit de CD31+ isolatie op 500 × g voor 5 min en verwijder vervolgens supernatant. Resuspend de cel pellet in 1 mL van evenwicht buffer, en tel de cellen met behulp van een hemocytometer.
      2. Voeg 10 μL MEFSK4 anti-feeder-APC antilichaam per 1 x 107 cellen toe. Incubeer gedurende ten minste 15 min bij 4 °C.
      3. Was MEFSK4 antilichaamgebonden cellen door 5 mL equilibratiebuffer per 1 x 107 totale cellen toe te voegen en centrifugeer vervolgens bij 500 x g gedurende 5 min.
      4. Verwijder supernatant en resuspend in anti-APC kralen, met behulp van hetzelfde volume van MEFSK4 anti-feeder-APC antilichaam gebruikt. Incubeer op ijs gedurende 15 min bij 4 °C.
      5. Centrifugeer bij 500 x g gedurende 10 min. Verwijder supernatant, bredig in 2 mL evenwichtsbuffer per 1 x 107 totale cellen en ga verder met magnetische scheiding zoals eerder beschreven (punt 2.3.3). Magnetisch gescheiden MEFSK4+ve/ CD45-ve /CD31-ve fibroblasten kunnen worden gebruikt voor zuiverheidsanalyses en andere downstreamtoepassingen.-ve

3. Zuiverheid en functionaliteit analyse van geïsoleerde Fibroblast Bevolking

  1. FACS-populatiezuiverheidsanalyse: αSMA-GFP-celanalyse (figuur 2)
    1. Resuspendvers geïsoleerde cellen in 25 μL van Fc blocker oplossing om de niet-specifieke binding van antilichamen te voorkomen. Incubeer voor 5 min bij RT.
    2. Optioneel: voeg 25 μL 7AAD of Ghost dye violet 510 toe aan celvering. Incubeer 30-60 min op ijs in het donker.
    3. Wassen door opnieuw op te schorten in 1 mL FACS buffer. Centrifuge bij 500 x g gedurende 5 min.
    4. Pellet opnieuw opschorten in 50 μL FACS-buffer. Voeg CD31-PE-, CD45-APC- en AN2/NG2-antilichamen rechtstreeks toe aan celvering. Incubeer gedurende 15 min op ijs (tabel 1).
    5. Wassen door opnieuw op te schorten in 1 mL FACS buffer. Centrifugebij 400 x g gedurende 5 min.
    6. Voeg ezel anti-rat AlexaFluor 405 secundair antilichaam toe aan de cellen die zijn gelabeld met ongeconjugeerd primair antilichaam. Incubeer 30 min op ijs.
    7. Wassen door opnieuw op te schorten in 1 mL FACS buffer. Centrifugebij 400 x g gedurende 5 min.
    8. Pellet opnieuw opschorten in het aanbevolen stroomcytometriemonstervolume van DE FACS-buffer (300 μL) en overzetten naar een gelabelde stroomcytometriebuis voor stroomanalyse.
      OPMERKING: FACS-analyse om de expressie van MEFSK4-antigeen op geïsoleerde fibroblasten te karakteriseren, wordt beschreven in punt 3.3.
  2. Fibroblastzuiverheidsanalyse: immunofluorescentie (figuur 3A)
    1. Zaad 30.000 primaire fibroblasten (P0-P1) per put op coverslips geplaatst in een 24 goed plaat en cultuur tot 80% confluent. Of concentraat gesorteerd cd45+ en CD31+ cellen (30.000 cellen per put) op een coverslip door cytospin op 400 x × g (een methode die wordt gebruikt om cellen direct en gelijkmatig op een coverslip in een 24 put plaat).
    2. Fix cellen met koude aceton voor 15 min. Was 3x keer met PBS.
    3. Blokdia's in 10% geitenserum. Incubeer dia's met primaire antilichamen 's nachts(tabel 2).
    4. Was dia's 3x in PBS. Incubeer secundaire antilichamen gedurende 2 uur (tabel 2).
    5. Counterstain glijdt, en monteren met een druppel DAPI in langzaam vervagen montage media.
  3. FACS-populatiezuiverheidsanalyse: MEFSK4 indringende (figuur 3B)
    1. Resuspendvers geïsoleerde cellen in 25 μL FC-blokkeroplossing om de niet-specifieke binding van antilichamen te voorkomen. Incubeer voor 5 min bij RT.
    2. Optioneel: voeg 25 μL 7AAD of Ghost dye violet 510 toe aan celvering. Incubeer 30-60 min op ijs in het donker.
    3. Wassen door opnieuw op te schorten in 1 mL FACS buffer. Centrifuge bij 500 x g gedurende 5 min.
    4. Pellet opnieuw opschorten in 50 μL FACS-buffer. Voeg MEFSK4-antilichaam direct toe aan celvering. Incubeer gedurende 15 min op ijs (tabel 1).
    5. Wassen door opnieuw op te schorten in 1 mL FACS buffer. Centrifugebij 400 x g gedurende 5 min.
    6. Voeg rat IgG-APC toe aan de cellen(tabel 1). Incubeer 30 min op ijs.
    7. Wassen door opnieuw op te schorten in 1 mL FACS buffer. Centrifugebij 400 x g gedurende 5 min.
    8. Pellet opnieuw opschorten in het aanbevolen stroomcytometriemonstervolume van de FACS-buffer (300 μL) en overzetten naar flow cytometriebuis voor stroomanalyse.
  4. Fibroblast zuiverheid analyse: semi-kwantitatieve real-time rtPCR (Figuur 3C)
    1. RNA isolatie en semikwantitatieve real-time PCR
    2. Na de verrijking van fibroblasten isoleert u RNA met behulp van een RNA-isolatiekit (zie Tabel met materialen). Volg de instructies van de fabrikant.
    3. Volledige eerste streng DNA synthese met behulp van een cDNA synthese kit (zie Tabel met materialen),volgens de instructies van de fabrikant.
    4. Semikwantitatieve real-time PCR5uitvoeren.
  5. Fibroblast functionaliteit analyse: collageen gel contractiliteit test (Figuur 4)
    1. Collageenoplossing
      1. Bereid 20 mM HEPES en 44 mM NaHCO3 in DMEM voor. Voeg 1,67 mg van type 1 rattencollageen per 1 mL DMEM toe met HEPES en NaHCO3.
    2. TGFβ-aangevulde DMEM
      1. Bereid 10% FBS in DMEM aangevuld met antibiotica en schimmelwerende middelen. Voeg TGFβ toe aan een eindconcentratie van 1 ng/mL.
    3. Cel/collageenmengsel en beplating
      1. Bereid celvering (P3-P5) voor en bepaal het vereiste volume om 3,3 x 105 cellen te verkrijgen.
      2. Voeg het ophangvolume met 3,3 x 105 cellen toe aan voldoende collageenoplossing om 1 mL totaal volume te verkrijgen.
        OPMERKING: Rat collageen type 1 concentratie moet nu 1,5 mg/mL.
      3. In een 48 putplaat, zaad 300 μL cel-collageen mix per put (~ 1 x 105 cellen / goed). Incubeer bij 37 °C gedurende 15-20 min tot gelled.
      4. Gebruik een naald van 30 G om gel van de putwanden te scheiden. Voeg 600 μL TGFβ en FBS aangevuld DMEM aan elke put. Afbeeldingsplaten op een reflecterende scanner op 24 uur en 48 uur.
        OPMERKING: Alle immunofluorescentie-experimenten werden uitgevoerd op een flow cytometriemachine uitgerust met drie lasers (405 nm, 488 nm en 640 nm). Gegevens werden verkregen met behulp van een flow data verwerven van software (Table of Materials). Verdere data-analyse werd uitgevoerd met behulp van flow data analyse software. AlexaFluor 405 en Ghost Dye Violet 510 waren enthousiast met de 405 nm laser en verzameld met behulp van een 450/50 BP en 525/50 BP filter, respectievelijk. GFP en PE waren enthousiast over de 488 nm laser en verzameld met behulp van de 530/30 BP en 575/26 BP filters, respectievelijk. Ofwel APC of AlexaFluor 647 werd opgewonden door de 640 nm laser en verzameld met behulp van een 670/14 BP filter. Alle celsorteerexperimenten werden uitgevoerd op een flow cytometriemachine ( Table ofMaterials) uitgerust met vier lasers (405 nm, 488 nm, 561 nm en 640 nm). 7-AAD was enthousiast met behulp van de 561 nm laser en verzameld met een 670/14 BP filter. GFP en Ghost Dye Violet 510 werden verzameld met behulp van dezelfde laser / filter combinaties zoals hierboven beschreven. Alle sorteerexperimenten maakten gebruik van een 100 um nozzle met een 17 psi druk configuratie voor een verhoogde downstream levensvatbaarheid van de doelcellen.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Flow gating regeling demonstreren myofibroblast isolatie met behulp van αSMA-GFP reporter muizen
Niet-gewonde harten vertoonden geen detecteerbare GFP+ cellen in αSMA-GFP reporter muismodel; daarom werden zij gebruikt om een poort voor het achtergrondsignaal van het GFP-kanaal na compensatie (figuur 2) vast te stellen. αSMA+ cellen werden gesorteerd op basis van de aanwezigheid van GFP-expressie van de gewonde linkerventrikel 10 dagen na MI. Een klei...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Fibroblasten zijn een heterogene groep cellen, geïdentificeerd door diverse set markers. De eiwitmarkers die zijn gebruikt om fibroblasten te identificeren zijn discoidin domeinreceptor 2 (DDR2), fibronectine, vimentin, collageen I en III, en Thy115,16,17,18,19,20. Overwegende dat vimentin is gebruikt om niet-gewonde rustige ...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

De auteurs willen Dr. Ivo Kalajzic bedanken voor de αSMA-GFP muizen. Onderzoek gemeld in deze publicatie werd ondersteund door het National Institute of General Medical Sciences van de National Institutes of Health (NIH) onder Award Number R01GM118300 (S.S.), National Institute of Biomedical Imaging and Bioengineering van de NIH onder Award Number R21EB019509 (P.P.Y.), en Scientist Development Grant van de American Heart Association onder Award Number 17SDG33630187 (S.S.). Flow cytometrie analyses werden uitgevoerd in het VUMC Flow Cytometry Shared Resource die wordt ondersteund door het Vanderbilt Ingram Cancer Center (P30 CA68485) en het Vanderbilt Digestive Disease Research Center (DK058404).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Reagents
Aceton
Anti-schimmel (Amphotericin B-geoplost; Fungizone)Sigma AldrichA9528
Bovine Serium Albumin (BSA)Sigma9048-46-8
Calcium chloride
Citrate Buffer
Collageenase blend (Liberase Blendzyme 3 TH)Roche Applied Science
DAPI
DDI water
DI water
DMEM-F12 met L-Glutamine en HEPESLife technologies11330057
Dnase I(20U/mL)BioRad7326828
Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline (dPBS) zonder Ca2+ en Mg2+Gibco13190-144
70% Ethanol
FC Blocker (Gepuurd anti-muis CD16/CD32)Tonbo Biosciences70-0161
Fetaal bovien serum (FBS)Life technologies16000044
10% geitenserum
Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) met Ca2+ en Mg2+Corning21-023-CV
1M HEPESCorning25-060-Ci
Krebs-Henseleit Buffer poederSigmaK3753
Mycoplasma profylactisch (Plasmocin)Invivogenant-mpp
Penicilline/StreptomycineThermo Fisher Scientific15140122
1x Phosphate-Buffered Saline (PBS)
10x Red Blood Cell Lysis BufferMiltenyi130-094-183
Slow-fade Montage Media
Natrium azide
Natriumbicarbonaat
TGFβ
Trypan Blue Stain (0,4%)Gibco15250-061
Type 1 Rat Collageen
Antilichamen
7AAD (voorraad: 1 mg/mL oplossing in DMSO)Molecular ProbesA1310verdunning = 1:1000; RRID =
CD45-APCBD Bioscience559864verdunning = 1:200; RRID = AB_398672
CD31-PEBD Bioscience553373verdunning = 1:200; RRID = AB_394819
CD31BD Biosciences553370verdunning = 1:250; RRID = AB_394816
CD45BD Biosciences553076verdunning = 1:250; RRID = AB_394606
COL 1α1MD Bioproducts203002verdunning = 1:1000; RRID =
Ghost dye violet 510 (Formulering: 1 uL/test in DMSO)Tonbo Biosciences13-0870verdunning = 1:1000; RRID =
Gepaald anti-muis Alexa Fluor 488Molecular ProbesA11029verdunning = 1:200; RRID = AB_138404
Gepaald anti-konijn-Cy3Southern Biotech4050-02verdunning = 1:200; RRID = AB_2795952
Gepaald anti-konijn-FITCJackson Immunoresearch Laboratories711-165-152verdunning = 1:200; RRID = AB_2307443
Gepaald anti-rat Alexa Fluor 488Molecular ProbesA11006verdunning = 1:200; RRID = AB_2534074
Gepaald anti-rat Alexa Fluor 647Thermo-FisherA21247verdunning = 1:200; RRID = AB_141778
PeriostinSanta CruzSC67233verdunning = 1:100; RRID = AB_2166650
VimentinSigma AldrichV2258verdunning = 1:200; RRID = AB_261856
α-smoothe spier actine (αSMA)Sigma AldrichA2547verdunning = 1:1000; RRID = AB_476701
Fibroblast specifiek proteïne 1 (FSP1)Millipore 07-227407-2274verdunning = 1:100; RRID = AB_10807552
CD45 Magnetic BeadsMiltenyi Biotec130-052-301
CD31 Magnetic BeadsMiltenyi Biotec130-087-418
Anti-feeder cellen-APC (MEFSK4)Miltenyi Biotec130-102-900verdunning = 1:100; RRID = AB_2660619
anti-APC BeadsMiltenyi Biotec130-090-855
Rat IgG-APCMiltenyi Biotec130-103-034verdunning = 1:100; RRID = AB_2661598
Donkey anti-rat Alexa Fluor405Abcamab175670verdunning = 1:100
anti-AN2/NG2Miltenyi Biotec130-097-455verdunning = 1:11; RRID = AB_2651235
Andere materialen
0,22 µm FilterThermo Scientific723-2520
10 cm2 Cel Cultuur SchaalCorning430167
10 mL PipetFisherbrand13-678-11E
40 µm Cel StrainerFisherbrand22363547
5 mL PipetFisherbrand13-678

Referenties

  1. Ivey, M. J., Tallquist, M. D. Defining the Cardiac Fibroblast. Circulation Journal. 80 (11), 2269-2276 (2016).
  2. Prabhu, S. D., Frangogiannis, N. G. The Biological Basis for Cardiac Repair After Myocardial Infarction: From Inflammation to Fibrosis. Circulatory Research. 119 (1), 91-112 (2016).
  3. Duan, J., et al. Wnt1/betacatenin injury response activates the epicardium and cardiac fibroblasts to promote cardiac repair. EMBO Journal. 31 (2), 429-442 (2012).
  4. Shinde, A. V., Frangogiannis, N. G. Fibroblasts in myocardial infarction: a role in inflammation and repair. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 70, 74-82 (2014).
  5. Saraswati, S., Marrow, S. M. W., Watch, L. A., Young, P. P. Identification of a pro-angiogenic functional role for FSP1-positive fibroblast subtype in wound healing. Nature Communications. 10 (1), 3027(2019).
  6. Kong, P., Christia, P., Saxena, A., Su, Y., Frangogiannis, N. G. Lack of specificity of fibroblast-specific protein 1 in cardiac remodeling and fibrosis. American Journal of Physiology -Heart and Circulatory Physiology. 305 (9), 1363-1372 (2013).
  7. Furtado, M. B., Nim, H. T., Boyd, S. E., Rosenthal, N. A. View from the heart: cardiac fibroblasts in development, scarring and regeneration. Development. 143 (3), 387-397 (2016).
  8. Stellato, M., Czepiel, M., Distler, O., Blyszczuk, P., Kania, G. Identification and Isolation of Cardiac Fibroblasts From the Adult Mouse Heart Using Two-Color Flow Cytometry. Frontiers in Cardiovascular Medicine. 6, 105(2019).
  9. Ackers-Johnson, M., et al. A Simplified, Langendorff-Free Method for Concomitant Isolation of Viable Cardiac Myocytes and Nonmyocytes From the Adult Mouse Heart. Circulatory Research. 119 (8), 909-920 (2016).
  10. Saraswati, S., Marrow, S. M. W., Watch, L. A., Young, P. P. Identification of a pro-angiogenic functional role for FSP1-positive fibroblast subtype in wound healing. Nature Communications. 10 (1), 3027(2019).
  11. Kalajzic, Z., et al. Use of an alpha-smooth muscle actin GFP reporter to identify an osteoprogenitor population. Bone. 43 (3), 501-510 (2008).
  12. Travers, J. G., Kamal, F. A., Robbins, J., Yutzey, K. E., Blaxall, B. C. Cardiac Fibrosis: The Fibroblast Awakens. Circulatory Research. 118 (6), 1021-1040 (2016).
  13. Bell, E., Ivarsson, B., Merrill, C. Production of a tissue-like structure by contraction of collagen lattices by human fibroblasts of different proliferative potential in vitro. Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 76 (3), 1274-1278 (1979).
  14. Montesano, R., Orci, L. Transforming growth factor beta stimulates collagen-matrix contraction by fibroblasts: implications for wound healing. Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 85 (13), 4894-4897 (1988).
  15. Goldsmith, E. C., et al. Organization of fibroblasts in the heart. Developmental Dynamics. 230 (4), 787-794 (2004).
  16. Bagchi, R. A., Lin, J., Wang, R., Czubryt, M. P. Regulation of fibronectin gene expression in cardiac fibroblasts by scleraxis. Cell Tissue Research. 366 (2), 381-391 (2016).
  17. Goodpaster, T., et al. An immunohistochemical method for identifying fibroblasts in formalin-fixed, paraffin-embedded tissue. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 56 (4), 347-358 (2008).
  18. Chapman, D., Weber, K. T., Eghbali, M. Regulation of fibrillar collagen types I and III and basement membrane type IV collagen gene expression in pressure overloaded rat myocardium. Circulatory Research. 67 (4), 787-794 (1990).
  19. Vasquez, C., Benamer, N., Morley, G. E. The cardiac fibroblast: functional and electrophysiological considerations in healthy and diseased hearts. Journal of Cardiovascular Pharmacology. 57 (4), 380-388 (2011).
  20. Hudon-David, F., Bouzeghrane, F., Couture, P., Thibault, G. Thy-1 expression by cardiac fibroblasts: lack of association with myofibroblast contractile markers. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 42 (5), 991-1000 (2007).
  21. Kanisicak, O., et al. Genetic lineage tracing defines myofibroblast origin and function in the injured heart. Nature Communications. 7, 12260(2016).
  22. Pinto, A. R., et al. Revisiting Cardiac Cellular Composition. Circulatory Research. 118 (3), 400-409 (2016).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Tags

Isolatie van myofibroblastencelisolatieflowcytometriemagnetische scheidingdifferentiële uitplatingfluorescentie-geactiveerde cel sorteringAlpha-SMA-GFP-muizenMEFSK4-antigeencollageencontractie
Isolatie en karakterisering van volwassen cardiale fibroblasten en myofibroblasten
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan de bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleidsoverzicht

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.