Kenmerkend voor cellulaire eiwitten met in-cell snelle fotochemische oxidatie van eiwitten

Samenvatting

Hier karakteriseren we eiwitstructuur en interactiesites in levende cellen met behulp van een eiwitvoetafdruktechniek genaamd in-cell fast fotochemische oxidatie van eiwitten (IC-FPOP).

Samenvatting

Snelle fotochemische oxidatie van eiwitten (FPOP) is een hydroxyl radicale eiwit voetafdruk methode gebruikt om eiwitstructuur en interacties te karakteriseren. FPOP maakt gebruik van een 248 nm excimer laser om waterstofperoxide die hydroxylradicalen produceert fotolyze. Deze radicalen oxidatively wijzigen oplosmiddel blootgestelde zijketens van 19 van de 20 aminozuren. Onlangs is deze methode gebruikt in levende cellen (IC-FPOP) om eiwitinteracties in hun eigen omgeving te bestuderen. De studie van eiwitten in cellen is goed voor intermoleculaire verdringing en verschillende eiwitinteracties die worden verstoord voor in vitro studies. Een aangepast stroomsysteem voor één cel is ontworpen om celaggregatie en verstopping tijdens IC-FPOP te verminderen. Dit stroomsysteem richt de cellen langs de excimerlaser individueel, waardoor consistente bestraling wordt gegarandeerd. Door de omvang van de oxidatie die uit FPOP wordt geproduceerd, te vergelijken met de oplosmiddeltoegankelijkheid van het eiwit, berekend op basis van een kristalstructuur, kan IC-FPOP nauwkeurig de oplosmiddeltoegankelijke zijketens van eiwitten onderzoeken.

Inleiding

Hydroxyl radical protein footprinting (HRPF) is een methode die de oplosmiddeltoegankelijkheid van een eiwit onderzoekt door covalente modificaties geproduceerd door hydroxylradicalen. Wanneer eiwitstructuur of eiwitinteracties veranderen, zal het de blootstelling van aminozuren aan oplosmiddelen veranderen, waardoor de mate van modificatie van residuen verandert. Met HRPF zijn eiwitinteracties^1,2,3 en eiwitconformatieveranderingen^4,5,6 met succes in vitro ondervraagd. Er zijn verschillende methoden die hydroxyl radicalen genereren voor HRPF experimenten, een daarvan is snelle fotochemische oxidatie van eiwitten (FPOP). FPOP is ontwikkeld door Hambly en Gross in 2005 en maakt gebruik van een 248 nm excimer laser om hydroxyl radicalen te produceren door middel van de fotolyse van waterstofperoxide (H₂O₂)⁷.

Onlangs hebben Espino et al. het gebruik van FPOP uitgebreid om de eiwitstructuur in levende cellen te onderzoeken, een methode die in cell FPOP (IC-FPOP)⁸wordt genoemd . In tegenstelling tot in vitro studies, het bestuderen van eiwitten in cellen is goed voor moleculaire verdringing samen met verschillende eiwitinteracties die mogelijk invloed kunnen hebben op de structuur. Bovendien, het presenteert het voordeel van het verstrekken van een momentopname van de volledige proteome mogelijk het verstrekken van structurele informatie van tal van systemen tegelijk proteome brede structurele biologie uit te voeren. Bovendien is deze techniek ideaal voor eiwitten die moeilijk in vitro te bestuderen zijn, zoals membraaneiwitten.

Eerste studies van IC-FPOP onderzochten met succes 105 eiwitten, variërend in eiwitovervloed en cellulaire lokalisatie. Om de IC-FPOP-methode te verbeteren, ontwikkelden Rinas et al. een microflowsysteem voor eencellige stroom⁹. De verbetering van het oorspronkelijke stroomsysteem beperkt celaggregatie en verhoogt de beschikbare H₂O₂ die beschikbaar is voor bestraling. In het oorspronkelijke stroomsysteem resulteerden cellen die samenklonteren in de silicabuizen in klompen en ongelijke bestraling. De integratie van twee stromen van een schedebuffer hydrodynamisch richt de cellen, waardoor ze individueel langs de laser stromen. De opname van een aparte spuit voor de H₂O₂ maakt meer gecontroleerde en geoptimaliseerde belichtingstijd mogelijk waardoor hogere H₂O_{2-concentraties} zonder nadelige effecten mogelijk zijn. Ook beperkt het beperken van de incubatietijd de afbraak van H₂O₂ door endogene catalase. Door de integratie van dit nieuwe stroomsysteem, het gedetecteerde aantal eiwitten met een FPOP wijziging verhoogd 13-voudige, waardoor de mogelijkheden van deze methode om een veelheid van eiwitten in levende cellen sonde. In dit protocol wordt een algemeen IC-FPOP-experiment beschreven gericht op de assemblage van het IC-FPOP-stroomsysteem.

Protocol

1. Ic-FPOP-stroomsysteem opzetten

1. Om te beginnen met de montage van het stroomsysteem, snijd de gesmolten silica met behulp van een decolleté steen op maat. Het IC-FPOP-stroomsysteem vereist vier 12 cm en één 17 cm gesmolten silica met een binnendiameter (ID) van 450 μm en buitendiameter (OD) van 670 μm, twee 24 cm en één 40 cm met een ID van 75 μm en een OD van 360 μm , en tenslotte twee 57 cm met een ID van 150 μm en een OD van 360 μm.
   OPMERKING: Bij het snijden van de silica buizen, voorzichtig wegschrapen van de polyimide coating, en buigen om de schoonste snede te krijgen. Controleer of het een rechte snede is (dit is nodig om ervoor te zorgen dat er geen blokkades of lekken ontstaan).
2. Stel 15 aansluitingen in met nanostrakke mouwen (0,0155" ID X 1/16" OD voor 360 μm OD silicabuizen en 0,027" ID X 1/16" OD voor de 670 μm OD silica buizen) met superflangeless moer PEEK 1/4-28 flat-bottom voor 1/16" OD en super flangeless ferrule w/SST ring, Tefzel (ETFE), 1/4-28 flat-bottom, voor 1/16" OD. Constructies volgens het protocol van de fabrikant (figuur 1).
3. Plaats 6 kleine cilindrische magneten in één 500 μL spuit. Vul deze spuit samen met nog eens 500 μL spuit en twee 5 mL spuiten met buffer en verwijder lucht. Positie op spuitpomp zoals aangegeven op figuur 2A.
   OPMERKING: De 5 mL spuiten zijn groter dan de 500 μL spuiten, dus een spacer is nodig om alle spuiten tegelijkertijd op zijn plaats aan te spannen (figuur 2B).
4. Draai de pompstop aan zodat de celspuit ongeveer 50 μL over heeft wanneer de motor vastloopt. Hierdoor blijft er ruimte voor de magnetische roerstaafjes. (Figuur 2C-D).
   LET OP: Als de spuitpomp druk uitoefent op de magneten, zullen ze de spuit vastlopen en kan de spuit breken.
5. Sluit met behulp van een Luer-adapter een handmatige klep aan op elke spuit. Monteer de silicabuizen zoals afgebeeld in figuur 3.
   OPMERKING: Rijg de lijn met de cellen + H₂O₂ helemaal door het kruis naar de andere kant. Plaats het vervolgens in de 450 μm ID silica slang. De omhulselbuffers in de 5 mL spuit zullen sneller stromen dan de cellen en H₂O₂. Met de omhulselbuffers aan beide zijden worden de cellen hydrodynamisch geconcentreerd in één lijn voor bestraling.
6. Positiestroomsysteem naast laser. Met behulp van een aansteker, burn away de silica coating op de 450 μm ID slang om een venster te maken voor laser bestraling.
7. Plaats een magnetische roeraar boven de celspuit met de zes magneten.
8. Stel de spuitpomp in op 492,4 μL/min voor een eindstroomsnelheid van 1.083,3 μL/min. Stroombuffer drie keer door het systeem om het systeem door te spoelen en te testen op eventuele lekken.
9. Focus de excimer laser op de silica buizen met behulp van een bolle lens. Eenmaal geconcentreerd, test de bestraling venster door het plaatsen van een klein stukje papier achter de silica buizen en zet de laser op. Meet het gebied verbrand door de bestraling. Bereken de benodigde laserfrequentie met behulp van het bestralingsvenster en de stroomsnelheid om een uitsluitingsfractie van nul te verkrijgen.
   OPMERKING: De aanbevolen laserenergie voor een IC-FPOP-experiment is ≥120 mJ. Om een uitsluitingsfractie van 0 te krijgen met een bestralingsvenster van 2,58 mm en een stroomsnelheid van 1083,3 μL/min, moet de frequentie 44 zijn. Hieronder staan de vergelijkingen die nodig zijn om de laserfrequentie te berekenen als de bestralingsvenster, de biet en de uitsluitingsfractie bekend is.
   
   waar w is het volume in nL, x is de laser spot breedte in mm, y is de silica buizen-ID in μm, v is het totale volume in μL, b is de uitsluiting sfractie, een is de stroomsnelheid in μL/min, en f is de frequentie in Hz.

2. Maak blussen en H₂O₂

1. Maak blussen met 100 mM N-tert-Butyl-alfa-fenylnitrone (PBN) en 100 mM N,N'-dimethylthiourea (DMTU). Aliquot 11 mL blussen voor elk monster in een 50 mL conische buis.
2. Verdun H₂O₂ tot 200 mM. Voor elk monster is 500 μL H₂O₂vereist.
   LET OP: De quench kan de dag ervoor worden gemaakt en 's nachts bij 4 °C worden opgeslagen, beschermd tegen licht. H₂O₂ moet vers worden gemaakt de dag van experimenteren.

3. Cellen verzamelen

1. Kweek cellen in een T175 kolf tot ongeveer 70-90% samenvloeiing.
2. Verwijder media en spoel af met buffer.
   OPMERKING: Typische buffers om te gebruiken zijn celkweekkwaliteit Dulbecco's fosfaatgebufferde zoutoplossing (DPBS) of Hank's balanced salt solution (HBSS).
3. Maak cellen los met trypsin-EDTA of met een schraper.
4. Eenmaal losgemaakt opnieuw opschorten in 10 mL buffer en tel de cellen.
5. Draai naar beneden, verwijder de buffer en trypsin-EDTA en bretel opnieuw om 2 x 10⁶ cellen/mL te maken.
6. Aliquot 500 μL van de cellen per monster.
   LET OP: Maak voor elke voorwaarde minimaal 3 lasermonsters en 3 geen laserbesturing.

4. Ic-FPOP uitvoeren

1. Vul de twee 5 mL spuiten met buffer, de 500 μL spuit met de magneten met de cellen, en de laatste 500 μL spuit met H₂O₂. Zet de magneetroeraar aan.
2. Piek in 220 μL dimethylsulfoxide (DMSO) tot één aliquot van blussen, meng zachtjes en plaats achter het stroomsysteem om bestraalde monsters te verzamelen. De toevoeging van DMSO remt endogene methioninesulfoxide reductase.
3. Zet laser aan, wacht 7 s en schakel vervolgens het stroomsysteem in.
4. Zodra het monster klaar is met stromen, schakelt u de laser uit en meng tuhet voorzichtig met het verzamelde monster. Plaats dit aan de zijkant tijdens de stappen 4.5 en 4.6.
5. Vul alle vier de spuiten met de buffer waarin de cellen worden opgehangen en door het stroomsysteem stromen.
6. Nadat het systeem is voltooid doorspoelen, herhaalt u de stappen 4.1 en 4.2. Start de stroom zonder bestraling. Dit is de geen lasercontrole om rekening te houden met achtergrondoxidatie in de cellen.
7. Terwijl het volgende monster wordt uitgevoerd, draai het vorige monster op 450-800 x g voor 5 min, verwijder het oplosmiddel en bredig het opnieuw op in 100 μL van een cellysebuffer zoals radioimmunoprecipitation test (RIPA) buffer.
8. Breng het monster over op een microcentrifugebuis en flashvries in vloeibare stikstof.
9. Wanneer alle monsters klaar zijn met draaien, demonteert u het stroomsysteem voor reiniging. Gooi de gebruikte silicabuizen weg en maak alle andere aansluitingen schoon door 1 uur in 50% water te soniceren: 50% methanol. Reinig de spuiten volgens de instructies van de fabrikant.

5. Digest

1. Verteer het hele cellysaat. Begin met ontdooien van de monsters en warmte op 95 °C gedurende 10 min.
2. Na het verwarmen, koel het lysate op ijs voor 15 min.
3. Voeg 25 eenheden nuclease toe om DNA en RNA te verteren en in cubeer in kamer gematigd voor 15 min.
4. Spin monsters met behulp van een tafelblad centrifuge op 16.000 x g voor 10 min bij 4 °C.
5. Verzamel de supernatant en breng het over naar een schone microcentrifugebuis.
6. Controleer de eiwitconcentratie met behulp van een eiwittestkit.
7. Breng 20-100 μg monster over naar een schone microcentrifugebuis en breng naar 100 μL.
8. Verminder monsters met 20 mM dithiothreiotol (DTT) bij 50 °C gedurende 45 min.
9. Koel de monsters op kamertemperatuur gedurende 15 min.
10. Alkylaat met 20 mM iodoacetamide (IAA) bij kamertemperatuur gedurende 20 min beschermd tegen licht.
11. Voeg voorgekoelde aceton toe bij een eiwit van 1:4 verhouding: aceton. Meng monsters en plaats in -20 °C 's nachts.
12. De volgende ochtend draaien monsters op 16.000 x g voor 10 min bij 4 °C.
13. Verwijder de supernatant en voeg 50 μL van 90% voorgekoelde aceton toe. Meng monsters en spin naar beneden op 16.000 x g gedurende 5 min bij 4 °C.
14. Verwijder aceton en laat monsters drogen door de doppen van de microcentrifuge open te laten met een pluisvrij doekje dat de bovenkant bedekt. Nadat de monsters zijn gedroogd, resuspend eiwit pellet met 10 mM Tris buffer pH 8.
15. Resuspend 20 μg trypsine in 40 μL van 10 mM Tris buffer pH 8. Voeg 2 μg trypsine toe (massa: massaverhouding van 1 trypsine: 50 monster). Bebroed monsters bij 37 °C 's nachts.
16. De volgende ochtend controleer de peptide concentratie met behulp van een peptide test. Nadat het monster is verwijderd voor de peptide test, doven de trypsine spijsvertering door toevoeging van mierenzuur aan de monsters (uiteindelijke concentratie is 5% mierenzuur).
17. Zodra de uiteindelijke peptideconcentratie is bepaald, breng je 10 μg van elk monster over naar een schone microcentrifugebuis. Dit zorgt ervoor dat dezelfde hoeveelheid van elk monster wordt geanalyseerd. Droog het monster met behulp van een vacuümcentrifuge. Eenmaal gedroogd opnieuw opschorten met 20 μL massaspectrometriegraad van 0,1% formisch zuur. Breng monsters over naar autosamplerflesjes.

6. Vloeibare chromatografie-tandemmassaspectrometrie

1. Om FPOP-wijzigingen te lokaliseren, analyseren we het verteerde cellysaat met behulp van LC-MS/MS-analyse.
2. Gebruik mobiele fasen van 0,1% mierenzuur in water (A) en 0,1% mierenzuur in acetonitril (B).
3. Laad 0,5 μg monster op een overvulkolom van 180 μm x 20 mm C18 (5 μm en 100 Å) en wasmonster met 99% (A) en 1% (B) gedurende 15 min.
4. Voer met behulp van een analytische scheidingskolom van 75 μm x 30 cm C18 (5 μm en 125 Å) de analytische scheidingsmethode uit met een stroomsnelheid van 0,300 μL/min vanaf 3% (B) gedurende één min en vervolgens naar 10% (B) van 1-2 min. Volgende oprit naar 45% (B) van 2-100 min dan 100% (B) van 100-110 min. Maak de kolom schoon door 100% (B) vast te houden van 110-115 min. Recondition de kolom door naar beneden te gaan tot 3% (B) van 115-116 min en houd op 3% (B) van 116-130 min.
5. Stel de MS-acquisitiemethode in op een resolutie van 60.000 met een m/z-scanbereik van 375-1500. Stel de doelstelling automatische gain control (AGC) in op 5,0 x 10⁵ met een maximale inspuittijd van 50 ms.
6. Selecteer tijdens de MS-overname de voorloperionen met een charge 2-6 voor isolatie via dataafhankelijke acquisitie (DDA) met een isolatievenster van 1,2 m/z en een cyclustijd van 4 s. Selecteer de peptiden met een intensiteitsdrempel van 5,0 x 10⁴ voor HCD-activering met een genormaliseerde energie ingesteld op 32%. Sluit de peptiden uit na 1 MS/MS-overname voor 60 s. Stel de MS/MS-resolutie in op 15.000 met een AGC-doelstelling van 5,0 x 10⁴ en een maximale injectietijd van 35 ms.

7. Gegevensverwerking

1. Doorzoek de RAW-bestanden op een beschikbare eiwitanalysesoftware tegen een relevante eiwitdatabase en het relevante digestenzym. Hier, gebruik maken van de Zwitsers-Prot Homo Sapiens database en trypsine.
2. Stel de voorlopermassa in om tussen 350 en 5.000 Da en een massatolerantie van 10 ppm te zoeken. Er kan hoogstens 1 gemiste decolletéplaats zijn met een peptidelengte tussen 6 tot 144 residuen. Deze beperkingen vergemakkelijken het zoeken in de database.
3. Stel de fragmentionen maximale massatolerantie in op 0,02 Da met de carbamidomethyl (+57.021) als statische modificatie en alle FPOP-modificaties van 17 aminozuren als dynamische wijziging(figuur 4 is een voorbeeld van de eiwitanalyseworkflow die wordt gebruikt om FPOP-wijzigingen te detecteren).
   OPMERKING: FPOP-wijzigingen op serine en threonine zijn niet opgenomen in het zoeken vanwege hun lagere reactiviteit met hydroxylradicalen.
4. Zoek met een lokdatabase met een vals ontdekkingspercentage van 1% en 5%.
5. Zodra bestanden klaar zijn met zoeken bereken de omvang van FPOP wijziging. Open Proteome Discoverer 2.2, export sequentie, modificatie locaties, eiwit toetreding, spectrum bestand, voorloper overvloed, en retentie tijd informatie. Bereken de omvang van de wijziging uit vergelijking 4:
   
   Het eic-gebied dat wordt gewijzigd is het chromatografisch gebied van een specifiek peptide met een hydroxylradicale modificatie. Het EIC-gebied is het totale chromatografische gebied van zowel gemodificeerde als ongewijzigde gebieden van dat specifieke peptide. De mate van oxidatie wordt berekend in de monsters met en zonder bestraling. Het monster dat bestraling (controle) weglaat, is verantwoordelijk voor eventuele achtergrondoxidatie die vóór en na blootstelling van H₂O₂ in de cellen aanwezig had kunnen zijn geweest. De besturingselementen worden afgetrokken van de bestralingsmonsters om FPOP-specifieke wijzigingen te isoleren.

Resultaten

IC-FPOP is een footprinting methode om eiwitinteracties in levende cellen te ondervragen. In het IC-FPOP-stroomsysteem is de H₂O 2-blootstellingstijd beperkt tot ongeveer 3 s, wat hogere H₂O_{2-concentraties} garandeert zonder nadelige gevolgen voor de cellen.₂ Het stroomsysteem bevat ook twee stromen van schedebuffer, die de cellen hydrodynamisch richt op het midden van de slang die een enkele stroom cellen produceert die uniform moeten worden bestraald (figuur 5)⁹. Fluorescentie beeldvorming van orthogonale YZ gestapelde beelden(figuur 5A) tonen een duidelijke scheiding van de schedebuffer (met een FITC fluorophore) van de celoplossing (met een TMRM fluorophore). Om deze scheiding te benadrukken, tonen figuur 5B en figuur 5C driedimensionale gemiddelde warmtekaarten van ofwel de omhulselbufferoplossing of celoplossing, die een minimale vermenging van de twee oplossingen illustreert.

Het gebruik van het eencellige stroomsysteem verhoogt het aantal oxidatief gemodificeerde eiwitten met 13-voudige (figuur 6A)⁹. In deze methode worden eiwitten in veel van de cellulaire compartimenten gelabeld met membraaneiwitten, cytoplasmatische eiwitten en eiwitten in de kern die de meest voorkomende^8,9zijn. Om ervoor te zorgen dat eiwitten in intacte cellen werden gewijzigd, werden fluorescerende beelden van cellrox behandelde cellen uitgevoerd na behandeling en bestraling van H₂O₂ (figuur 6B)⁸. De stabiliteit van de cellen gedurende het labelproces bevestigt verder de werkzaamheid van IC-FPOP om eiwitten in hun eigen cellulaire omgeving te sonde. Door gebruik te maken van tandem-massa spectrometrie, kunnen deze wijzigingen worden gelokaliseerd op specifieke aminozuren op een eiwit. Figuur 7 vertegenwoordigt een wijziging die plaatsvindt tijdens IC-FPOP, samen met zijn geëxtraheerd ionchromatogram. De verschuiving waargenomen in het geëxtraheerde ionchromatogram vertaalt zich in de verandering in hydrofobeit veroorzaakt door de geoxideerde methionine in het gemodificeerde peptide.

Om te testen of de FPOP-wijzigingen de toegankelijkheid van oplosmiddelen in de cellen onderzoeken, werd in-cell label actine vergeleken met zowel een in vitro footprinting studie als verschillende kristalstructuren van actine (figuur 8)⁸. De in-cell gelabelde actine is vertegenwoordigd in figuur 8A toont vergelijkbare mate van oxidatie uit de in vitro studie van Guan et al.¹⁰ (Figuur 8B), concluderen actinheeft vergelijkbare oplosmiddel toegankelijkheid voor zowel in-cel en in vitro studies. Om verder te bevestigen dat IC-FPOP de toegankelijkheid van actine in de oplosmiddelen indeed, werd de omvang van de FPOP-wijzigingen vergeleken met de oplosmiddeltoegankelijkheid van de gelabelde residuen, berekend op basis van twee actinekristalstructuren (figuur 8C). Deze correlatie toont aan dat IC-FPOP de oplosmiddeltoegankelijkheid van het monomerice eiwit goed onderzoekt.

Figuur 1: Hoe goed te construeren ferules. (A) Plaats ferrules, silica buizen, en mouw samen voor aanscherping. (B) Alle onderdelen aan elkaar spannen. (C) Eindproduct zal een ferule produceren die is aangescherpt op de mouw. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figuur 2: Opzetten van ic-FPOP-stroomsysteem. (A) Afbeelding van een volledig geassembleerd IC-FPOP stroomsysteem gepositioneerd naast de laser. (B) Voorbeeld van een spacer die nodig is om de buitenste diameter van de 500 μL spuiten te verhogen om alle spuiten met succes aan elkaar te spannen. (C) Representatieve foto's met de ruimte die nodig is voor de magnetische roerstaafjes. (D) Stoppers zijn nodig om de spuitpomp te stallen zonder de spuiten te breken. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figuur 3: Schema van het stroomsysteem ontwikkeld voor IC-FPOP. Blauwe lijnen vertegenwoordigen silicabuizen met een 450 μm-ID en 670 μm OD, rode lijnen hebben een 150 μm-ID en 360 μm OD, en oranje lijnen hebben een 75 μm-ID en 360 μm OD. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figuur 4: Eiwitanalysesoftware die wordt gebruikt om FPOP-wijzigingen op te sporen. Een typische werkstroom met de bijbehorende wijzigingen gezocht in elk knooppunt. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figuur 5: Het stroomsysteem met één cel richt de cellen hydrodynamisch in één stroom. (A) Orthogonal YZ stapel ter illustratie van 3D-scherpstelling van de cellulaire analyt (rood, TMRM fluorophore) omgeven door de schede buffer (groen, FITC fluorophore). Driedimensionale gemiddelde intensiteit warmtekaart van de schede buffer (B) en cellulaire analyt (C). Lagere intensiteiten zijn blauw en het hoogste zijn rood(B-C). Dit cijfer is gewijzigd van Rinas et al.⁹Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figuur 6: Het gebruik van het IC-FPOP-stroomsysteem verhoogt de FPOP gemodificeerde eiwitten in innamecellen drastisch. (A) Vergelijking van geoxideerde eiwitten geïdentificeerd met en zonder het stroomsysteem. Het stroomsysteem identificeerde 1391 FPOP gemodificeerde eiwitten, terwijl slechts 105 eiwitten werden geïdentificeerd zonder stroomsysteem met een overlapping van 58 gemodificeerde eiwitten. Dit cijfer is gewijzigd van Rinas et al.⁹ (B) Fluorescentie beeldvorming van CellROX behandelde cellen na IC-FPOP tonen de cellen zijn nog intact na oxidatieve etikettering. Cellen werden afgebeeld met behulp van een Olympus Fluoview FV1000 MPE multifoton microscoop op 665 nm. Afbeelding weergegeven is een enkel segment. Dit cijfer is gewijzigd van Espino et al.⁸Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figuur 7: Voorbeelden van tandem MS/MS spectra die plaatsvinden tijdens IC-FPOP. Product-ion (MS / MS) spectra van een (A) ongewijzigd peptide, en een (B) oxidatie gedetecteerd op residu M8 gevonden op dat peptide. Een representatief EIC van het (C) ongewijzigdpeptide en (D) gewijzigd peptide. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figuur 8: IC-FPOP is effectief in het onderzoeken van de oplosmiddeltoegankelijkheid van eiwitten. (A) Omvang van de wijziging voor de 9 oxidatief gemodificeerde peptiden van actine. Waarden worden weergegeven als gemiddelden plus en min standaarddeviatie (n = 3). (B) Wijziging van actin peptiden geoxideerd in vitro door synchrotron radiolyse uit Guan et al.¹⁰ (C) Correlatie van residu FPOP wijzigingen met SASA in de strakke (driehoeken, stippellijn) en open (cirkels, solide trendlijn) staten van actine. Dit cijfer is gewijzigd van Espino et al.⁸Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Discussie

Verschillende technieken op basis van massaspectrometrie zijn ontwikkeld om eiwitstructuur en eiwitligandcomplexen op een proteomebrede manier te bestuderen in hele cellen of cellysaten. Deze technieken omvatten, maar zijn niet beperkt tot stabiliteit van eiwitten uit de mate van oxidatie (SPROX), thermische proteome profiling (TPP), chemische kruiskoppeling (XL-MS) en hydroxyl radical protein footprinting (HRPF). Elke techniek heeft unieke beperkingen en voordelen ten opzichte van elkaar, die uitgebreid zijn herzien¹². Elk van deze methoden zijn gebruikt voor proteome brede structurele biologie om eiwitstructuur op te helderen en uiteindelijk te functioneren binnen de complexe cellulaire omgeving. IC-FPOP is een HRPF-techniek die hydroxylradicalen gebruikt om oplosmiddelblootgestelde zijketens van aminozuren, indringende eiwitstructuur en eiwitligandinteracties in levensvatbare cellen te oxideren¹³. IC-FPOP is een verbetering van de eerste HRPF in levende cellen die fenton chemie gebruikt om radicalen te genereren op de minuten schaal¹⁴. In deze studie werden structurele veranderingen in een integraal membraaneiwit in reactie op het verlagen van de pH of ionische sterkte van de buffer met succes gekenmerkt met een goede oxidatiedekking over het eiwit. In vergelijking met de Fenton chemie, IC-FPOP is veel sneller, het wijzigen van eiwitten op de microseconde tijdschaal, waardoor de inheemse eiwitconformatie te bestuderen.

Een belangrijke test voor IC-FPOP is het bevestigen van de levensvatbaarheid van de cellen na blootstelling aan H₂O₂. Met behulp van een menglijn van 40 cm worden de cellen voor ongeveer 3 s vóór bestraling geïncubeerd in H₂O_2. Deze tijd kan worden aangepast door het veranderen van de lengte van deze silica buizen. Het is opmerkelijk dat, hoewel het gebruik van trypan blauw om cel levensvatbaarheid te testen toont de integriteit van de cellen worden volgehouden na H₂O₂ incubatie, de cellen kunnen potentieel worden onder stress effecting signalering trajecten die interageren met H₂O₂. Gelukkig is de korte incubatietijd sneller dan eiwitsynthese die vertrouwen geeft dat de aanwezige eiwitten niet worden geïnduceerd door H₂O₂.

De volgende belangrijke stap is het bevestigen van een goede montage van het stroomsysteem. Eenmaal gemonteerd, zorg ervoor dat er geen lekken aanwezig zijn na het spoelen van het systeem met de gewenste buffer. Als er lekken aanwezig zijn, zorg ervoor dat de silica buizen goed is gesneden en is flush tegen de ferrule om een goede afdichting eenmaal aangescherpt. Alle onderdelen zijn met de hand aangedraaid, dus er zijn geen gereedschappen nodig. Zorg er tijdens elk IC-FPOP-experiment voor dat de magnetische roerstaafjes in de celspuit in beweging blijven. Deze kleine agitatie beperkt het aantal cellen dat zich aan de onderkant van de spuit nestelt, maar is niet hard genoeg om de cellen te scheren. Na één run zit er nog ongeveer 50 μL cellen in de spuit. Zorg er altijd voor om dit te verdunnen met een spoelstap om het aantal cellen dat overte dragen aan het volgende experiment te beperken. Het wordt aanbevolen om een verse celspuit te gebruiken als meerdere celbehandelingen worden vergeleken. Het is ook belangrijk om een geschikte buffer te selecteren voor de cellen die worden getest. Sommige buffers blussen de hydroxyl radicaal leidt tot minder wijzigingen op eiwitten. Xu et al. hebben aangetoond dat sommige veelgebruikte buffers de hydroxyl radicale levensduur¹¹verminderen . DPBS en HBSS zijn veelvoorkomende buffers die worden gebruikt voor IC-FPOP-experimenten.

Optimaliseer het spijsverteringsprotocol na IC-FPOP op basis van de benodigde parameters. Aangezien FPOP onomkeerbare covalente wijzigingen produceert, is er voldoende tijd beschikbaar voor een grondige spijsvertering en sanering zonder de etiketteringsdekking te verliezen. Test en normaliseer de eiwitconcentratie altijd, zodat uniforme peptideconcentraties worden geladen voor tandemmassaspectrometrie. Houd er ten slotte rekening mee dat een immunoneerslag niet kan worden uitgevoerd in combinatie met IC-FPOP. Als een FPOP-wijziging zich richt op het gebied van interactie, wordt de affiniteit van het antilichaam verlaagd. Om de identificatie van FPOP-wijzigingen te helpen vergroten, hebben 2D-chromatografische scheidingsstappen aangetoond dat het aantal gedetecteerde geoxideerde peptiden meer dan verdrievoudigen¹⁵.

Een uitdaging van elk FPOP-experiment is het ingewikkelde niveau van data-analyse vanwege de mogelijke oxidatieproducten die zich kunnen voordoen. Dit geldt zowel voor in-cell als in vitro, maar wordt drastisch verhoogd met de toegevoegde complexiteit van het analyseren van cellysaten. Met verdere optimalisering van IC-FPOP doen zich meer proteïnen met hogere wijzigingsdekking voor, waardoor het snel maken van analyse moeilijker. De afschuifhoeveelheid gegevens die wordt gegenereerd uit één IC-FPOP-experiment beperkt het gebruik van handmatige validatie waardoor onderzoekers meer afhankelijk zijn van software. Daarom ontwikkelden Rinas et al. een kwantificeringsstrategie voor HRPF met Proteome Discoverer (PD)¹⁶. Deze methode maakt gebruik van een multi-search node workflow op PD in combinatie met een kwantitatief platform in een spreadsheet. Verdere verbeteringen op het IC-FPOP-platform zijn aan de gang om het aantal geïdentificeerde peptiden te verhogen met FPOP-wijzigingen, samen met een verhoogde reproduceerbaarheid en kwantificeringsnauwkeurigheid.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
15 mL Conische centrifugeerbuizen	Fisher Scientific	14-959-53A	elke merk is voldoende
5 mL Gasdichte spuit, afneembare Luer Lock	SGE Analytical Science	008760
50 mL Conische centrifugeerbuizen	Fisher Scientific	14-432-22	elke merk is voldoende
500 µL SGE Gastight spuiten: Vaste Luer-Lok modellen	Fisher Scientific	SG-00723
Aceton, HPLC kwaliteit	Fisher Scientific	A929-4	4 L hoeveelheid is niet noodzakelijk
Acetonitril met 0,1% mierenzuur (v/v), LC/MS kwaliteit	Fisher Scientific	LS120-500
ACQUITY UPLC M-Class Symmetry C18 Trap Column, 100 Å, 5 µm, 180 µm x 20 mm, 2G, V/M, 1/pkg	Waters	186007496
ACQUITY UPLC M-Class Systeem	Waters	ACQUITY UPLC M-Class Systeem
Aluminiumfolie	Fisher Scientific	01-213-100	elke merk is voldoende
Aqua 5 µm C18 125 Å vulmateriaal	Phenomenex	04A-4299
Centrifuge	Eppendorf	022625501
Delicate Task Wipers	Fisher Scientific	06-666A
Dithiothreitol (DTT)	AmericanBio	AB00490-00005
DMSO, Anhydrous	Invitrogen	D12345
EX350 excimer laser	GAM Laser	EX350 excimer laser
FEP Buizen 1/16" OD x 0.020" ID	IDEX Health & Science	1548L
Mierenzuur, LC/MS kwaliteit	Fisher Scientific	A117-50
HV3-2 VALVE	Hamilton	86728
Waterstofperoxide	Fisher Scientific	H325-100	elke 30% waterstofperoxide is voldoende
Iodoacetamid (IAA)	ACROS Organics	122270050
Legato 210 spuitpomp	KD Scientific	788212	Elke spuitpomp die 4, 5 mL spuiten kan vasthouden, vloeistof kan trekken en uitstoten, en een manier heeft om de motor stil te zetten, zou moeten werken
Luer Adapter Vrouwelijke Luer naar 1/4-28 Mannelijke Polypropyleen	IDEX Health & Science	P-618L
Methanol, LC/MS kwaliteit	Fisher Scientific	A454SK-4	4 L hoeveelheid is niet noodzakelijk
Microcentrifuge	Thermo Scientific	75002436
N,N'-Dimethylthioureum (DMTU)	ACROS Organics	116891000
NanoTight Sleeve Groen 1/16" ID x.0155" ID x 1.6"	IDEX Health & Science	F-242X
NanoTight Sleeve Geel 1/16" OD x 0.027" ID x 1.6"	IDEX Health & Science	F-246
N-tert-Butyl-α-fenylnitrone (PBN)	ACROS Organics	177350250
Orbitrap Fusion Lumos Tribrid Massaspectrometer	Thermo Scientific	Orbitrap Fusion Lumos Tribrid Massaspectrometer	andere hoge resolutie instrumenten (bijv. Q exactive Orbitrap of Orbitrap Fusion) kunnen worden gebruikt
PE50-C pyro-elektrische energiemeter	Ophir Optronics	7Z02936
Pierce Kwantitatieve Colorimetrische Peptide Assay	Thermo Scientific	23275
Pierce Rapid Gold BCA Eiwit Assay Kit	Thermo Scientific	A53225
Pierce Trypsine Protease, MS kwaliteit	Thermo Scientific	90058
Pierce Universele Nuclease voor Cel Lysis	Fisher Scientific	88702
Polymicro splijtsteen, 1" x 1" x 1/32"	Molex	1068680064	elke capillaire buissnijder is voldoende
Polymicro Flexibele Fused Silica Capillaire Buizen, Binnendiameter 150 µm, Buitendiameter 360 µm, TSP150350	Polymicro Technologies	1068150024
Polymicro Flexibele Fused Silica Capillaire Buizen, Binnendiameter 450 µm, Buitendiameter 670 µm, TSP450670	Polymicro Technologies	1068150025
Polymicro Flexibele Fused Silica Capillaire Buizen, Binnendiameter 75 µm, Buitendiameter 360 µm, TSP075375	Polymicro Technologies	1068150019
Kaliumfosfaat Monobasisch	Fisher Scientific	P382-500
Proteome Discover 2.2 (bottom-up proteomics software)	Thermo Scientific	OPTON-30799
Roterende Magnetische Tumble Stirrer	V&P Scientific, Inc.	VP 710D3
Roterende Magnetische Tumble Stirrer, accessoire kit voor gebruik met Spuitpompen	V&P Scientific, Inc.	VP 710D3-4
Super Flangeless Ferrule met SST Ring, Tefzel™ (ETFE), 1/4-28 Plat-Bodem, voor 1/16" OD	IDEX Health & Science	P-259X
Super Flangeless Moer PEEK 1/4-28 Plat-Bodem, voor 1/16" & 1/32" OD	IDEX Health & Science	P-255X
Super Tumble Stir Discs, 3.35 mm diameter, 0.61 mm dik	V&P Scientific, Inc.	VP 722F
Thermo Scientific Pierce RIPA Buffer	Fisher Scientific	PI89900
Tris Base	Fisher Scientific	BP152-500
Upchurch Scientific Lage Druk Kruisen: PEEK	Fisher Scientific	05-7