Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Snijden en kweken Varkensharten onder fysiologische omstandigheden

17.6K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/60913

⸱

20 maart 2020

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Institute of Molecular Cardiology, Department of Medicine, University of Louisville, 2Department of Bioengineering, University of Louisville, 3Diabetes and Obesity Center, Department of Medicine, University of Louisville, 4Department of Pharmacology and Toxicology, University of Louisville, 5Institute of Cardiovascular Sciences, University of Manchester, 6Faculty of Pharmacy, Zagazig University

* These authors contributed equally

In dit artikel

Samenvatting

Dit protocol beschrijft hoe hartweefsel te snijden en te kweken onder fysiologische omstandigheden gedurende 6 dagen. Dit cultuursysteem kan worden gebruikt als een platform voor het testen van de werkzaamheid van nieuwe harthartfalen therapieën evenals betrouwbare testen van acute cardiotoxiciteit in een 3D-hartmodel.

Samenvatting

Veel nieuwe geneesmiddelen mislukken in klinische studies als gevolg van cardiotoxische bijwerkingen als de momenteel beschikbare in vitro tests en in vivo diermodellen slecht voorspellen menselijke hartverplichtingen, die een multi-miljard dollar last voor de farmaceutische industrie. Vandaar, is er een wereldwijde onvervulde medische behoefte aan betere benaderingen om drugcardiotoxiciteit te identificeren alvorens dure en tijdrovende 'eerst in de mens' proeven aan te gaan. Momenteel worden alleen onrijpe hartcellen (door de mens geïnduceerde pluripotente cardiomyocyten uit stamcellen [hiPSC-CMs]) gebruikt om therapeutische efficiëntie en medicijntoxiciteit te testen, omdat ze de enige menselijke hartcellen zijn die langdurig kunnen worden gekweekt nodig is om de werkzaamheid en toxiciteit van geneesmiddelen te testen. Een enkelceltype kan echter het fenotype van het complexe 3D-hartweefsel dat wordt gevormd uit meerdere celtypen niet repliceren. Belangrijk is dat het effect van geneesmiddelen moet worden getest op volwassen cardiomyocyten, die verschillende kenmerken en toxiciteitreacties hebben in vergelijking met onrijpe hiPSC-CMs. Het kweken van menselijke hartschijfjes is een veelbelovend model van intact menselijk myocardium. Deze technologie biedt toegang tot een compleet meercellig systeem dat het menselijk hartweefsel nabootst en de fysiologische of pathologische omstandigheden van het menselijke myocardium weerspiegelt. Onlangs, door optimalisatie van de cultuur media componenten en de cultuur voorwaarden aan continue elektrische stimulatie op 1,2 Hz en intermitterende oxygenatie van de cultuur medium op te nemen, ontwikkelden we een nieuwe cultuur systeem setup die levensvatbaarheid behoudt en functionaliteit van mens en varken hart plakjes voor 6 dagen in de cultuur. In het huidige protocol geven we als voorbeeld de methode voor het snijden en kweken van varkenshart. Hetzelfde protocol wordt gebruikt om plakjes uit menselijke, honden-, schapen- of kattenharten te kweken. Dit cultuursysteem heeft het potentieel om een krachtig voorspellend human in situ-model te worden voor acute cardiotoxiciteitstests die de kloof tussen preklinische en klinische testresultaten dichten.

Inleiding

Drug geïnduceerde cardiotoxiciteit is een belangrijke oorzaak van de terugtrekking van de markt1. In het laatste decennium van de20e eeuw werden acht niet-cardiovasculaire geneesmiddelen uit de markt genomen omdat ze resulteerden in een plotselinge dood als gevolg van ventriculaire hartritmestoornissen2. Bovendien kunnen verschillende anti-kankertherapieën (hoewel in veel gevallen effectief) leiden tot verschillende cardiotoxische effecten, waaronder cardiomyopathie en hartritmestoornissen. Zo kunnen zowel traditionele (bijvoorbeeld anthracyclines en bestraling) als gerichte (bijvoorbeeld trastuzumab) borstkankertherapieën leiden tot cardiovasculaire complicaties bij een subgroep van patiënten3. Een nauwe samenwerking tussen cardiologen en oncologen (via het opkomende veld van "cardio-oncologie") heeft geholpen om deze complicaties beheersbaar te maken ervoor te zorgen dat patiënten effectief kunnen worden behandeld2. Minder duidelijk zijn de cardiovasculaire effecten van nieuwere stoffen, waaronder Her2- en PI3K-remmers, vooral wanneer therapieën in combinatie worden gebruikt. Daarom is er een groeiende behoefte aan betrouwbare preklinische screening strategieën voor cardiovasculaire toxiciteit in verband met opkomende anti-kanker therapieën voorafgaand aan menselijke klinische proeven. Het gebrek aan beschikbaarheid van kweeksystemen voor menselijk hartweefsel dat functioneel en structureel levensvatbaar is voor meer dan 24 uur is een beperkende factor voor betrouwbare cardiotoxiciteitstests. Daarom is er een dringende noodzaak om een betrouwbaar systeem te ontwikkelen voor het kweken van menselijk hartweefsel onder fysiologische omstandigheden voor het testen van toxiciteit van geneesmiddelen.

De recente stap naar het gebruik van door de mens geïnduceerde pluripotente cardiomyocyten (hiPSC-CMs) in cardiotoxiciteitstests heeft een gedeeltelijke oplossing geboden om dit probleem aan te pakken; echter, de onrijpe aard van de hiPSC-CMs en het verlies van weefsel integriteit in vergelijking met meercellige aard van het hartweefsel zijn belangrijke beperkingen van deze technologie4. Een recente studie heeft deze beperking gedeeltelijk overwonnen door de fabricage van hartweefsels van hiPSC-CMs op hydrogels en hen te onderwerpen aan een geleidelijke toename van elektrische stimulatie in de loop van de tijd5. Echter, hun elektromechanische eigenschappen niet bereiken van de volwassenheid gezien in de volwassen menselijke myocardium. Bovendien is het hartweefsel structureel ingewikkelder, dat bestaat uit verschillende celtypen, waaronder endotheelcellen, neuronen en verschillende soorten stromale fibroblasten die zijn gekoppeld aan een zeer specifiek mengsel van extracellulaire matrixeiwitten6. Deze heterogeniteit van de niet-cardiomyocyte celpopulatie7,8,9 in het volwassen zoogdierhart is een belangrijk obstakel bij het modelleren van hartweefsel met behulp van individuele celtypen. Deze belangrijke beperkingen benadrukken het belang van het ontwikkelen van methoden om de kweek van intact hartweefsel mogelijk te maken voor optimale studies met fysiologische en pathologische aandoeningen van het hart5.

Het kweken van menselijke hartplakken is een veelbelovend model van intact menselijk myocardium. Deze technologie biedt toegang tot een compleet 3D meercellig systeem dat vergelijkbaar is met het menselijk hartweefsel dat betrouwbaar de fysiologische of pathologische omstandigheden van het menselijke myocardkanon kan weerspiegelen. Het gebruik ervan is echter ernstig beperkt door de korte periode van levensvatbaarheid in de cultuur, die niet verder reikt dan 24 uur met behulp van de meest robuuste protocollen die tot 201810,11,12worden gemeld . Deze beperking was te wijten aan meerdere factoren, waaronder het gebruik van lucht-vloeistof interface om de cultuur van de plakjes, en het gebruik van een eenvoudige cultuur medium dat niet ondersteunt de hoge energetische eisen van het hartweefsel. We hebben onlangs een ondergedompeld kweeksysteem ontwikkeld dat in staat is om continue elektrische stimulatie te bieden en de componenten van de cultuurmedia te optimaliseren om hartweefselplakjes tot 6 dagen13levensvatbaar te houden. Dit cultuursysteem heeft het potentieel om een krachtig voorspellend human in situ-model te worden voor acute cardiotoxiciteitstests om de kloof tussen preklinische en klinische testresultaten te dichten. In het huidige artikel, we zijn detaillering het protocol voor het snijden en kweken van het hart plakjes met behulp van een varkenshart als voorbeeld. Hetzelfde proces wordt toegepast op menselijke, hond, schapen of kattenharten. Met dit protocol hopen we de technologie te verspreiden naar andere laboratoria in de wetenschappelijke gemeenschap.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

Alle dierprocedures waren in overeenstemming met de institutionele richtlijnen van de Universiteit van Louisville en goedgekeurd door het Institutioneel Comité voor dierverzorging en -gebruik.

1. Voorbereiding voor slicing (Een dag voor het snijden)

  1. Bereiding van het trillende microtoom
    1. Plaats het keramische blad in de houder door deze stappen te volgen: plaats na het zorgvuldig uitpakken van het blad de scherpe rand eerst in de sleuf van het bladgereedschap. Dan, plaats het blad in de houder door het losmaken van de twee schroeven op de armen van de houder en schuif het mes onder elke ring en duw het stevig terug tegen de achterste stops. Draai de schroeven om het mes vast te maken.
      LET OP: De schroeven mogen niet te strak worden gedraaid.
    2. Kalibreer het mes met behulp van het kalibratieprotocol en de gereedschappen volgens het protocol van de fabrikant.
      LET OP: Kortom, om de uitlijning van het blad met de as van de reis te vergemakkelijken en om de Z-as afbuigingen te minimaliseren, maakt het trillende microtoom gebruik van een demontabel. Wanneer het kalibratieapparaat op het instrument is aangesloten, wordt de aanwezigheid ervan automatisch gedetecteerd en neemt het trillende microtoom de controle over het aanpassen van de amplitude- en frequentieinstellingen van het blad tot een magnitude die de uitlijningsfout van het blad het beste mogelijk maakt.
      1. Druk op de slice-knop om het uitlijningsproces te starten dat het blad automatisch verplaatst, zodat de snijkant zich in optimale positie bevindt ten opzichte van het kalibratieapparaat voor de beste uitlijningsevaluatie. Volg de instructies op het scherm om het blad aan te passen met behulp van de meegeleverde schroevendraaier om ervoor te zorgen dat de Z-uitlijning zich binnen 1 μm bevindt.
    3. Autoclave het binnenbad en alle metalen delen van de vibrerende microtoom.
  2. Autoclave de grote metalen trays (voor het verzamelen van de plakjes en het weken van de elektrische stimulatie plaat covers), alle glazen containers, gewone rechthoek bladen, tangen, schaar, printer distributieriem (snijd ze in 6 mm brede stukken), metalen ringen en 5 L van dubbele gedestilleerd water (ddH2O).
  3. Steriliseer één 1 L-pot, een pot van 500 mL en een plastic lade voor het hart ter plaatse en in vitro perfusie met de cardioplege oplossing.
  4. Bereid 2 L van de snijdende Tyrode's oplossing in een 2 L beker.
    1. Meng voor 1 L van de oplossing van het snijden van Tyrode 3 g/L 2,3-butanedione monoxime (BDM), 140 mM NaCl (8,18 g), 6 mM KCl (0,447 g), 10 mM D -glucose (1,86 g), 10 mM HEPES (2,38 g), 1 mM MgCl2 (1 mL van 1 M oplossing), 1,8 mM CaCl2 (1,8 mL van 1 M oplossing), tot 1 L van ddH2O. Stel de pH aan op 7,40 met NaOH. Filtreer de oplossing vervolgens met een 1.000 mL, 0,22 μm, vacuümfilter/opslagsysteem en bewaar 's nachts bij 4 °C.
  5. Bereid 4 L van de cardioplegic oplossing.
    1. Meng voor 1 l van de cardioplegic oplossing 110 mM NaCl (6,43 g), 1,2 mM CaCl2 (1,2 mL van 1 M oplossing), 16 mM KCl (1,19 g), 16 mM MgCl2 (3,25 g), 10 mM NaHCO3 (0,84 g), 1 U/mL heparin, tot 1 L ddH2O. Pas de pH aan tot 7,40 met NaOH. Filtreer de oplossing vervolgens met een 1.000 mL, 0,22 μm, vacuümfilter/opslagsysteem en bewaar 's nachts bij 4 °C.
      LET OP: Voeg 1.000 U/L heparine toe in cardioplegieoplossing op de dag van het snijden (zie stap 2.1).
  6. Vers bereid 500 mL kweekmiddel in de originele fles in een bioveiligheidskast: meng medium 199, 1x insuline-transferrin-selenium (ITS) supplement, 10% foetaal runderserum (FBS), 5 ng/mL vasculaire endotheelgroeifactor (VEGF), 10 ng/mL FGF-basic en 2x antibioticum-antimycoticus. Filter steriliseren door de 0,22 μm, vacuüm filter / opslag systeem en op te slaan op 4 °C 's nachts.
    LET OP: Pas de pH niet aan, voeg VEGF en FGF vers toe voor gebruik.
  7. Bereid 4% agar gel platen.
    1. Voeg 200 mL gesteriliseerde ddH2O toe in een gesteriliseerde kolf van 500 mL. Weeg 8 g agarose en giet voorzichtig in de kolf. Kook gedurende 2 min in een magnetron, koel dan 5 min op kamertemperatuur.
    2. Giet 25 mL in elke 100 mm petrischaal in een bioveiligheidskast (bereid 6 gerechten) en wacht 1 uur om te stollen. Sluit vervolgens de platen af met paraffinefolie, wikkel met schone wrap en bewaar op 4 °C.
  8. Bereid 4 L van 70% ethanol door verdunnen van de 200-proof absolute ethanol in autoclaved ddH2O.
  9. Bereid 2x antibiotica-antimycotisch in gesteriliseerde ddH2O: meng 980 mL gesteriliseerde ddH2O met 20 mL antibiotica-antimycotisch onder de bioveiligheidskast.

2. VarkenshartPerfusie

  1. Voeg 1 mL van 1.000 U/mL heparine toe aan elke 1 L cardioplegic oplossing. Houd de oplossing op ijs.
    LET OP: Ten minste 3 L zijn nodig voor de perfusie en het behoud van het hart tijdens de overdracht naar de weefselkweekkamer.
  2. Neem de volgende items naar de varkenschirurgie kamer: een grote ijsemmer vol ijs, een gesteriliseerde metalen lade (houd op ijs emmer voor hartperfusie), een gesteriliseerde 500 mL pot, een 1 L pot (om het hart in cardioplegie oplossing terug naar het weefsel cultuur kamer , op ijs), en een gesteriliseerde plastic lade vol ijs (om cardioplegic oplossing op ijs te houden).
  3. Bereid een in-situ hartperfusiesysteem voor met een 3-wegstopcock, een 60 mL-spuit, een 18 G vlindernaaldkatheter en verlengbuizen naar het reservoir met cardioplegische oplossing.
  4. Verdoof het mannetjesvarken uit Yorkshire (2−3 maanden oud, 20−25 kg) eerst met een intramusculaire injectie van ketamine (20 mg/kg)/xylazine (2 mg/kg) cocktail. Bevestig een goede anesthesie door het verlies van kaakspanning. Breng het varken vervolgens naar de operatiekamer, intuber en ventileer de longen mechanisch zoals eerder beschreven14.
  5. Zorg voor anesthesie met (1,5−2%) isoflurane.
  6. Plaats het dier op de juiste zijdelingse positie en scheer de vacht van het borstgebied. Reinig de huid met alcohol scrub, dan steriliseren van de chirurgische site met 10% (w / v) povidone-jodium oplossing.
  7. Open de borst door linker thoracotomie incisie met behulp van een scalpel op de4e intercostale ruimte, en gebruik een borst oprolmechanisme tussen ribben om de borst open te houden en bloot het hart.
    LET OP: Gebruik alle gesteriliseerde instrumenten voor deze procedure.
  8. Steek de vlindernaaldkatheter in het linkeratrium en bevestig de naald met een tassjesluiting. Na een intraveneuze injectie van een bolusdosis heparine (100 U/kg), begint u het hart in situ te doordringen met 500 mL ijskoude cardioplegic oplossing (om de hartslag te vertragen) via de linker atriumkatheter.
  9. Verdoof het varken diep met 5% isofluraan. Snel accijns het hart uit de borst met chirurgische schaar. Cannulate de aorta met een aortacanule en doorbloeding het hart in vitro met een andere 1 L van ijskoude cardioplegic oplossing (100 mL/min) te spoelen vasculatuur bloed.
  10. Na hartperfusie, houd het hart in een 1 L pot gevuld met ijskoude cardioplegie oplossing en houd op ijs tijdens de overdracht naar het weefsel cultuur kamer.

3. Varkenshartweefsel snijden

  1. Zet het weefsel bad op het vibratome, voeg ijs toe aan het weefsel bad koeljas, voeg dan Tyrode's oplossing in het weefsel bad. Zet 1 L plastic pot om de verwijdering van gesmolten ijs te verzamelen uit het weefsel bad koeljas.
  2. Breng onder de bioveiligheidskast het varkenshart over naar een bak met 1 L verse koude cardioplegic oplossing.
  3. Ontleed het hart om de linker ventrikel te isoleren met behulp van intrekbare steriele scalpels. Snijd vervolgens de linker ventrikel in blokken van 1−2 cm3 elk met scheermesjes. Gebruik een stuk voor het snijden en houd de resterende stukken in een 50 mL buis in koude Tyrode's oplossing op ijs voor het snijden later, indien nodig.
    LET OP: Masseer het weefsel voor het snijden met de handen, vooral als dit het tweede blok is. Masseren helpt om de juiste spiervezel configuratie te herstellen en voorkomt elke stijfheid in het hartblok.
  4. Voeg 1−2 druppels weefsellijm (Table of Materials)toe aan de metalen monsterhouder en plak een stuk van het 4% agarblok met een oppervlakte van ongeveer 1 cm2.
  5. Voeg 1−2 druppels weefsellijm toe aan de agar.
  6. Plak het hartblok aan de agar met de hart-epicardium kant naar beneden op het weefsel lijm en zorg ervoor dat het zo plat mogelijk. Breng vervolgens de weefselhouder met het hartblok naar zijn positie in het snijdende bad van het vibratome.
  7. Bevestig de zuurstofbuis aan het snijbad en de metalen lade gevuld met Tyrode's oplossing voor het verzamelen van de plakjes (zuurstofrijk Tyrode's bad). Voeg vervolgens 40 μm celstrainers toe in de metalen lade om de plakjes na het snijden te verzamelen.
  8. De snijpositie aanpassen
    1. Met behulp van de vibratome-werksoftware en het dashboard past u de hoogte van het blad/monster aan. Selecteer de hoogteknop en volg de instructies op het scherm voor het aanpassen van de hoogte. Idealiter, hebben het mes dicht bij de bovenkant van het weefsel, maar onder de papillaire spieren en zorg ervoor dat er vloeistof die het weefsel en het mes voor het snijden.
    2. Pas aan waar u moet beginnen met het snijden van het weefsel door de knop vooraf te selecteren. Druk op de snijknop en verhoog de snelheid met behulp van de knop om het mes naar de rand van het weefsel te bewegen. Druk vervolgens nogmaals op slice om te stoppen en druk op de knop Vooraf om het proces te activeren.
    3. Pas de snijparameters aan: voorsnelheid = 0,03 mm/s, trillingsfrequentie = 80 Hz en horizontale trillingsamplitude = 2 mm. Begin vervolgens met snijden door de segmentknop te selecteren.
    4. Laat het vibratomoom snijden tot het het einde van het weefsel bereikt, maar voordat het de achterkant van de houder van het monster raakt. Druk op dit punt nogmaals op slice om te stoppen. Druk op de knop Terug om terug te gaan naar de startpositie.
    5. Selecteer automatische herhaling (twee keer klikken) waarmee het trillende microtoom het snijproces tot 99 keer automatisch kan herhalen.
  9. Segmenten verzamelen
    1. Wacht tot plakjes zijn volledige lengte en lijken goed (na het krijgen van langs de papillaire spierlagen), dan beginnen met het verzamelen van de plakjes.
    2. Verzamel de plakjes met behulp van een plastic Pasteur pipet gevuld met koude Tyrode's oplossing om voorzichtig pak het weefsel uit het bad. Gebruik indien nodig tangen en veerschaar om de schijf van het hartblok te scheiden als het weefsel nog steeds is bevestigd.
    3. Breng de schijf in een cel zeef in het bad van de zuurstofachtige Tyrode's (zie stap 3.7) en gebruik de vloeistof in de plastic Pasteur pipet om het weefsel plat te liggen op een van de cel strainers, voeg dan een metalen ring op de top om het weefsel naar beneden te houden.
      LET OP: De plakjes moeten ten minste 1 uur worden geïncubeerd in de oplossing van de Tyrode voor de verwerking (dit is voor de BDM om het weefsel te ontspannen).

4. Het kweken van hartsegmenten

  1. Het voorbereiden van de plakjes voor cultuur
    1. Knip het segment van de randen om oneffen randen te voorkomen. Lijm het vervolgens van beide uiteinden tot gesteriliseerd polyurethaan 6 mm brede printerdistributieriem met metalen draden ingebed met behulp van weefsellijm.
    2. Breng de ondersteunde hartplakjes over op 6 putplaten die 6 mL kweekmedium in elke put bevatten.
    3. Plaats de stimulatieplaatdeksel (Table of Materials) op de bovenkant van de 6 putplaat en sluit de cover aan op de elektrische stimulator van de celcultuur ( Tabel vanmaterialen). Pas de stimulator aan om de hartschijfjes elektrisch te stimuleren bij 10 V, 1,2 Hz continu de hele tijd.
      OPMERKING: Na het aansluiten van de stimulatie, zullen de hartschijfjes beginnen te kloppen, en deze beweging zal visueel duidelijk zijn.
    4. Breng de platen naar een couveuse en bewaar de weerstand van 37 °C met bevochtigde lucht en 5% CO2.
  2. Verander cultuur medium 3x per dag en voeg 6 mL van cultuur medium per goed tijdens elke media verandering.
    LET OP: Cultuur medium is zuurstofrijk voor 5 min voorafgaand aan elke verandering van de media. Medium moet ten minste 1x per dag worden gewijzigd; dit is oke in het weekend indien nodig. Twee dagen van slechts 1 media verandering per dag is het maximum dat wordt getest.
  3. Verander de stimulatieplaatdeksel elke dag om het vrijkomen van giftige grafietdeeltjes in het kweekmedium te voorkomen (meestal tijdens de mediaverandering in het midden van de dag).
    1. Verwijder de stimulatieplaatdeksel uit de kweekschaal en plaats de witte schuimplug waar het deksel verbinding maakt met de kabel voor de elektrische stimulator van de celkweek, om waterschade aan het elektrische circuit te voorkomen.
    2. Plaats de plaatdeksel in een bad van autoclaved water met 2x antibiotica-antimycotisch. Bewaar het in dit bad (dat wil zeggen, spoelen bad) 's nachts.
    3. De volgende dag, verplaats de plaat deksel in een 70% ethanol bad voor 5−15 min te ontsmetten. Schud zoveel mogelijk vloeistof uit het apparaat voordat u van bad wisselt.
    4. Breng vervolgens de plaatdeksel over naar het derde en laatste bad (d.w.z. schoon bad), dat bestaat uit autoclaved water en 2x antibacteriële antimycotische, om eventuele resterende ethanolsporen te spoelen.
    5. Gebruik na het spoelen van de plaathoes in het schone bad een schoon pluisjesvrije veeg (met ethanol gespoten) om eventueel restwater op de kunststof onderdelen af te drogen, verwijder vervolgens het witte schuimstuk en plaats de plaatdeksel voorzichtig terug op de kweekplaat.
      LET OP: Raak de zwarte grafietelektroden die in de put gaan niet aan, omdat het apparaat niet langer steriel zal zijn.
    6. Met behulp van steriele tangen, zorg ervoor dat het weefsel in het midden van de put, zodat de plaat deksel niet het weefsel aante raken. Zorg ervoor dat de gebogen kant van de plaat afte dekken overeenkomt met de schuine kant van de plaat en dat de vierkante hoeken line-up.
      LET OP: Om de verontreiniging van de stimulatieplaatkappen te minimaliseren, bewaar ze na het beëindigen van het experiment in schone en lege 6 putplaten.
  4. Voer een MTT-test, calciummetingen en contractiele functiebeoordelingen uit op verse plakjes varkenshart (dag 0) en na 6 dagen in cultuur volgens Ou et al.13.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Met behulp van een commercieel beschikbare celcultuur elektrische stimulator die plaats biedt aan acht 6 goed platen tegelijk, we geëmuleerd de volwassen hart-milieu door het induceren van elektrische stimulatie op de fysiologische frequentie (1,2 Hz), en gescreend op de fundamentele medium componenten om de duur van functionele varkenshart plakjes in cultuur te verlengen13. Aangezien varkens en menselijke harten zijn vergelijkbaar in grootte en anatomie

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Hier beschrijven we de gedetailleerde video protocol voor onze onlangs gepubliceerde methode voor vereenvoudigde medium doorvoer (processen tot 48 plakjes / apparaat) methode die cultuur van varkenshart plakjes mogelijk maakt voor een periode die voldoende lang is om acute cardiotoxiciteit te testen13. De voorgestelde omstandigheden bootsen de omgeving van het hart na, inclusief de frequentie van elektrische stimulatie, beschikbaarheid van voedingsstoffen en intermitterende oxygenatie. We schrijve...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

TMAM bezit aandelen in Tenaya Therapeutics. De andere auteurs melden geen conflicten.

Dankbetuigingen

TMAM wordt ondersteund door NIH grant P30GM127607 en American Heart Association grant 16SDG29950012. RB wordt ondersteund door P01HL78825 en UM1HL113530.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
1,000 mL, 0.22 µm, Vacuum Filter/Storage SystemsVWR28199-812
2,3-Butanedione monoxime (BDM)FisherAC150375000
500 mL, 0.22 µm, Vacuum Filter/Storage SystemsVWR28199-788
6-well C-Dish Cover (electrical-stimulation-plate-cover)Ion OptixCLD6WFC
6-well platesFisher08-772-1B
AgaroseBioline USABIO-41025
Antibiotic-AntimycoticThermo15-240-062
C-Pace EM (cell-culture-electrical-stimulator)Ion OptixCEP100
Calcium Chloride (CaCl2)FisherC79-500
Ceramic Blades for Vibrating MicrotomeCampden Instruments7550-1-C
Cooley Chest RetractorMillennium Surgical63-G5623
D-GlucoseFisherD16-1
Disposable Scalpel #20Biologyproducts.comDS20X
Falcon Cell Strainers, Sterile, CorningVWR21008-952
Fetal Bovine SerumThermoA3160502
Graefe ForcepsFisherNC9475675
Heparin sodium saltSigma-AldrichH3149-50KU
HEPESFisherBP310-1
Histoacryl BLUE Tissue glueAmazonhttps://www.amazon.com/HISTOACRYL-FLEXIBLE-1051260P-Aesculap-Adhesive/dp/B074WB5185/
Iris Spring scissorsFisherNC9019530
Iris Straight ScissorsFisher731210
Isoflurane, USPPiramalNDC 66794-017-25
ITS Liquid Media SupplementSigma-AldrichI3146-5ML
Ketamine HCl (500 mg/10 mL)West-WardNDC 0143-9508
Magnesium Chloride (MgCl2)FisherM33-500
Mayo SuperCut Surgical ScissorsAROSurgical Instruments CorporationAROSuperCut™ 07.164.17
Medium 199, Earle's SaltsThermo11-150-059
Oxygen regulatorPraxair
Oxygen tanks -Praxair
Plastic Pasteur pipettesFisher13-711-48
Potassium Chloride (KCl)FisherAC193780010
Printer Timing BeltAmazonhttps://www.amazon.com/Uxcell-a14081200ux0042-PRINTER-Precision-Timing/dp/B00R1J3KDC/
Razor rectangle bladesFisher12-640
Recombinant Human FGF basicR&D Systems233-FB-025/CF
Recombinant Human VEGFR&D Systems293-VE-010/CF
Retractable scalpelsFisher22-079-716
Sodium Bicarbonate (NaHCO3)FisherAC217125000
Sodium Chloride (NaCl)FisherAC327300010
Vibrating MicrotomeCampden Instruments7000 SMZ-2
Xylazine HCl (100 mg/mL)Heartland Veterinary SupplyNADA 139-236

Referenties

  1. Onakpoya, I. J., Heneghan, C. J., Aronson, J. K. Post-marketing withdrawal of 462 medicinal products because of adverse drug reactions: a systematic review of the world literature. BMC Medicine. 14, 10(2016).
  2. Fermini, B., Fossa, A. A. The impact of drug-induced QT interval prolongation on drug discovery and development. Nature Reviews Drug Discovery. 2 (6), 439-447 (2003).
  3. Moslehi, J. J. Cardiovascular Toxic Effects of Targeted Cancer Therapies. The New England Journal of Medicine. 375 (15), 1457-1467 (2016).
  4. Robertson, C., Tran, D. D., George, S. C. Concise review: maturation phases of human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. Stem Cells. 31 (5), 829-837 (2013).
  5. Ronaldson-Bouchard, K., et al. Advanced maturation of human cardiac tissue grown from pluripotent stem cells. Nature. 556 (7700), 239-243 (2018).
  6. Pinto, A. R., et al. Revisiting Cardiac Cellular Composition. Circulation Research. 118 (3), 400-409 (2016).
  7. Kanisicak, O., et al. Genetic lineage tracing defines myofibroblast origin and function in the injured heart. Nature Communications. 7, 12260(2016).
  8. Fu, X., et al. Specialized fibroblast differentiated states underlie scar formation in the infarcted mouse heart. Journal of Clinical Investigations. 128 (5), 2127-2143 (2018).
  9. Kretzschmar, K., et al. Profiling proliferative cells and their progeny in damaged murine hearts. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (52), E12245-E12254 (2018).
  10. Perbellini, F., et al. Investigation of cardiac fibroblasts using myocardial slices. Cardiovascular Research. 114 (1), 77-89 (2018).
  11. Watson, S. A., et al. Preparation of viable adult ventricular myocardial slices from large and small mammals. Nature Protocols. 12 (12), 2623-2639 (2017).
  12. Kang, C., et al. Human Organotypic Cultured Cardiac Slices: New Platform For High Throughput Preclinical Human Trials. Scientific Reports. 6, 28798(2016).
  13. Ou, Q., et al. Physiological Biomimetic Culture System for Pig and Human Heart Slices. Circulation Research. 125 (6), 628-642 (2019).
  14. Jones, S. P., et al. The NHLBI-sponsored Consortium for preclinicAl assESsment of cARdioprotective therapies (CAESAR): a new paradigm for rigorous, accurate, and reproducible evaluation of putative infarct-sparing interventions in mice, rabbits, and pigs. Circulation Research. 116 (4), 572-586 (2015).
  15. Crick, S. J., Sheppard, M. N., Ho, S. Y., Gebstein, L., Anderson, R. H. Anatomy of the pig heart: comparisons with normal human cardiac structure. Journal of Anatomy. 193 (Pt 1), 105-119 (1998).
  16. Fischer, C., et al. Long-term functional and structural preservation of precision-cut human myocardium under continuous electromechanical stimulation in vitro. Nature Communications. 10 (1), 117(2019).
  17. Franke, J., Abs, V., Zizzadoro, C., Abraham, G. Comparative study of the effects of fetal bovine serum versus horse serum on growth and differentiation of primary equine bronchial fibroblasts. BMC Veterinary Research. 10, 119(2014).
  18. Vuorenpaa, H., et al. Novel in vitro cardiovascular constructs composed of vascular-like networks and cardiomyocytes. In Vitro Cellular & Developmental Biology - Animal. 50 (4), 275-286 (2014).
  19. Qiao, Y., et al. Multiparametric slice culture platform for the investigation of human cardiac tissue physiology. Progress in Biophysics and Molecular Biology. 144, 139-150 (2018).
  20. Watson, S. A., et al. Biomimetic electromechanical stimulation to maintain adult myocardial slices in vitro. Nature Communications. 10 (1), 2168(2019).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Trefwoorden

Hartweefselsnijdenvarkenshartkweekvibratoomsnijdenelektrische stimulatiezuurstofrijk mediumacute cardiotoxiciteitMTT viabiliteitsassaybeoordeling van de contractiele functiemeting van calciumtransi nten
Snijden en kweken Varkensharten onder fysiologische omstandigheden
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleid

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.