We detaileen eenvoudige methode om hoge resolutie time-lapse films van Pseudomonas aeruginosa zwermen die reageren op bacteriofaag (faag) en antibiotica stress met behulp van een flatbed document scanner te produceren. Deze procedure is een snelle en eenvoudige methode voor het monitoren van zwermdynamiek en kan worden aangepast aan de beweeglijkheid en groei van andere bacteriesoorten.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Time-lapse Beeldvorming van bacteriële zwermen en de Collectieve Stress Response
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Zwermen is een vorm van oppervlakte beweeglijkheid waargenomen bij veel bacteriële soorten, waaronder Pseudomonas aeruginosa en Escherichia coli. Hier, dichte populaties van bacteriën bewegen zich over grote afstanden in karakteristieke rank-vormige gemeenschappen in de loop van uren. Zwermen is gevoelig voor verschillende factoren, waaronder medium vocht, vochtigheid, en het gehalte aan voedingsstoffen. Bovendien weerhoudt de collectieve stressrespons, die wordt waargenomen in P. aeruginosa die wordt benadrukt door antibiotica of bacteriofaag (faag), zwermen van het naderen van het gebied met de stress. De hier beschreven methoden gaan over hoe de kritische factoren die van invloed zijn op de zwermen te controleren. We introduceren een eenvoudige methode om de zwermdynamiek en de collectieve stressrespons met hoge temporele resolutie te monitoren met behulp van een flatbeddocumentscanner, en beschrijven hoe u een kwantitatieve analyse van zwermen compileren en uitvoeren. Deze eenvoudige en kosteneffectieve methode zorgt voor nauwkeurige en goed gecontroleerde kwantificering van zwermen en kan worden uitgebreid tot andere soorten op platen gebaseerde groeitesten en bacteriële soorten.
Inleiding
Zwermen is een collectieve vorm van gecoördineerde bacteriële beweeglijkheid die de antibioticaresistentie en de productie van virulentiefactoren in gastheer1verhoogt ,2,3. Dit meercellige gedrag vindt plaats op semi-vaste oppervlakken die lijken op die van slijmlagen die epitheelmembranen in de longen4,5. Biosurfactants worden vaak geproduceerd door zwermpopulaties om de oppervlaktespanning op oppervlakken te overwinnen en de productie hiervan wordt gereguleerd door complexe celcelsignaleringssystemen, ook wel quorum....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
1. Voorbereiding Swarming Agar Platen voor P. aeruginosa Swarming Time-lapse Imaging
- Bereid 1 L van 5x M8 minimale media in een glazen fles door toevoeging van 64 g Na2HPO4•7H2O, 15 g KH2PO4,en 2,5 g NaCl in 500 mL dubbel gedestilleerd water (ddH2O). Pas het uiteindelijke volume aan op 1 L met extra ddH2O. Autoclave om vloeibare media bij kamertemperatuur te steriliseren en op te slaan.
- Bereid 100 mL van 1 M MgSO4 (magnesiumsulfaat) in een glazen fles door 24,6 g MgSO4•7H2O in 50 mL ddH2O. Pas het uiteindelijke volume aa....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
De stappen om P. aeruginosate kweken, benadrukken de cellen, en beeld de zwermende agar platen zijn vertegenwoordigd in figuur 1. We inenten een enkele kolonie van wild-type P. aeruginosa UCBPP-PA14 stam van een LB-agar plaat in 2 mL lb bouillon 's nachts op 37 °C en gespot 5 μL in het midden van de zwermen agar plaat. Time-lapse beeldvorming van deze plaat onthult de eerste groei in de vorm van een kolonie in het midden en vervolgens verspreiden van ranken radiaal uit de kolonie (
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Dit protocol richt zich op het minimaliseren van de variabiliteit in zwermen agar platen en het verstrekken van een eenvoudige en low-cost methode om time-lapse beelden van P. aeruginosa zwermen en reageren op stress te verwerven. Deze procedure kan worden uitgebreid tot het beeld van andere bacteriële systemen door het aanpassen van de media samenstelling en groeivoorwaarden. Voor P. aeruginosa, hoewel M9 of FAB minimaal medium kan worden gebruikt om zwermen te induceren16,.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs hebben niets te onthullen.
Dankbetuigingen
J.-L.B., A.S., en N.M.H-K. schreef en herzag het manuscript. Alle auteurs ontwierpen de experimenten. J.-L.B. voerde de experimenten en analyses uit. Dit werk werd ondersteund door de NIH award K22AI112816 en R21AI139968 subsidie aan A.S. en door de Universiteit van Californië. N.M.H-K. werd ondersteund door Lundbeck Fellowships R220-2016-860 en R251-2017-1070. De financiers hadden geen rol in het besluit om het werk voor publicatie in te dienen. We hebben geen concurrerende belangen te verklaren.
....Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| Reagents | |||
| Bacto agar, gedehydrateerd | BD Difco | 214010 | Voor LB-agarplaat en swarming agar plaat |
| Casamino aciden | BD Difco | 223050 | Voor swarming media |
| D-Glucose | Fisher Chemical | D16500 | Dextrose. Voor swarming media |
| Fosfomycin disodium zout | Tokyo Chemical Industry | F0889 | Stock concentratie: 200 mg/mL. Opgelost in ddH2O |
| Gentamycin sulfaat | Sigma-Aldrich | G1914 | Stock concentratie: 3 mg/mL. Opgelost in ddH2O |
| Kanamycin sulfaat | Sigma-Aldrich | 60615 | Stock concentratie: 100 mg/mL. Opgelost in ddH2O |
| LB-Miller | BD Difco | 244620 | Voor LB bouillon en LB-agar platen |
| Magnesiumsulfaat heptahydraat | Sigma-Aldrich | 230391 | Voor swarming media |
| Kaliumfosfaat monobasisch | Sigma-Aldrich | P0662 | Voor 5x M8 media |
| Natriumchloride | Sigma-Aldrich | S9888 | Voor 5x M8 media |
| Natriumfosfaat dibasisch heptahydraat | Fisher Chemical | S373 | Voor 5x M8 media |
| Strains | |||
| Pseudomonas aeruginosa | Siryaporn lab | AFS27E.118 | PA14 stam |
| DMS3vir | O'Toole lab | DMS3vir20 | Bacteriofaag |
| Benodigdheden | |||
| Aluminiumoxide schuurpapier | 3M | 150 Fijn | Voor zwarte deksels |
| Zwarte stof | Joann | PRD7089 | Zwarte stof |
| Zwarte spuitverf | Krylon | 5592 Matte Black | Voor zwarte deksels |
| Erlenmeyer kolf | Kimax | 26500 | 250 mL |
| Glazen opslagflessen | Pyrex | 13951L | 250 mL, 500 mL, 1.000 mL |
| 8 inch kabelbinders | Gardner Bender | E173770 | Voor het bevestigen van zwarte matte stof |
| Petrischalen (100 mm x 15 mm) | Fisher | FB0875712 | 100 mm x 15 mm polystyreen platen |
| Houtstokjes | Fisher | 23-400-102 | Voor het strepen en inoeculeren van bacteriën |
| Apparatuur | |||
| Autoclaaf | Market Forge Industries | STM-E | Voor het steriliseren van reagentia |
| 25 mL pipette | USA Scientific, Inc. | 1072-5410 | Om 20 mL voor swarming agar platen te pipetten |
| Luchtontvochtiger | Frigidaire | FAD704DWD 70-pint | Om de relatieve luchtvochtigheid in de kamer op ongeveer 45% te houden |
| ImageJ | NIH | v1.52a | Software voor beeldanalyse |
| Incubator | VWR | 89032-092 | Voor het kweken van bacteriën bij 37 °C |
| Isotemp waterbad | Fisher | 15-462-21Q | Voor het koelen van media tot 55 °C |
| Laminaire stroomkap | The Baker Company | SG603A | Voor het drogen van platen |
| P-20 pipet | Gilson | F123601 | Spotten op swarming agar platen |
| Pipet Controller | BrandTech | accu-jet | Om 20 mL voor swarming agar platen te pipetten |
| Roller Drum | New Brunswick | TC-7 | Voor het kweken van bacteriën bij 100 rpm |
| Scanner | Epson | Epson Perfection V370 Foto | Scanner voor het maken van platen |
| Scanner automatiseringssoftware | RoboTask Lite | v7.0.1.932 | Voor beeldvorming met intervallen van 30 minuten |
| Scanner beeldverwervingssoftware | Epson | v9.9.2.5US | Software voor het maken van platen |
Referenties
- Butler, M. T., Wang, Q., Harshey, R. M. Cell density and mobility protect swarming bacteria against antibiotics. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (8), 3776-3781 (2010).
- Lai, S., Tremblay, J., Déziel, E.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
