Methodenartikel

Een screeningmethode voor de identificatie van heterochromatine-bevorderende drugs met drosophila

5.6K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/60917

⸱

12 maart 2020

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Medicine, University of California San Diego

In dit artikel

Samenvatting

Drosophila is een veel gebruikt experimenteel model geschikt voor het screenen van geneesmiddelen met mogelijke toepassingen voor kankertherapie. Hier beschrijven we het gebruik van Drosophila bonte oogkleurfenotypes als een methode voor het screenen van kleine moleculen verbindingen die heterochromatinevorming bevorderen.

Samenvatting

Drosophila is een uitstekend model organisme dat kan worden gebruikt om verbindingen die nuttig kunnen zijn voor kankertherapie scherm. De hier beschreven methode is een kosteneffectieve in vivo methode om heterochromatine-bevorderende verbindingen te identificeren met behulp van Drosophila. De Drosophila's DX1 stam, met een bonte oogkleur fenotype dat de omvang van heterochromatine vorming weerspiegelt, waardoor een hulpmiddel voor een heterochromatine-bevorderend drugscherm. Bij deze screeningmethode wordt oogvariatie gekwantificeerd op basis van het oppervlak van rode pigmentatie dat delen van het oog beslaat en wordt beoordeeld op een schaal van 1 tot 5. De screeningmethode is eenvoudig en gevoelig en maakt het mogelijk om verbindingen in vivo te testen. Drug screening met behulp van deze methode biedt een snelle en goedkope manier voor het identificeren van heterochromatine-bevorderende geneesmiddelen die gunstige effecten kunnen hebben in kanker therapieën. Het identificeren van verbindingen die de vorming van heterochromatine bevorderen, kan ook leiden tot de ontdekking van epigenetische mechanismen voor de ontwikkeling van kanker.

Inleiding

Heterochromatine is een verkorte vorm van DNA die een centrale rol speelt bij genexpressie, bij het reguleren van chromosoomsegregatie tijdens celdeling en bij de bescherming tegen genoominstabiliteit1. Heterochromatine wordt beschouwd als een genrepressieregulator en ter bescherming van de chromosoomintegriteit tijdens celmitose2,3. Het wordt geassocieerd met de di- en tri-methylatie van histon H3 lysine 9 (H3K9me) tijdens afstamming strekkende verplichting 4,5. Bovendien wordt de aanwerving van Chroom-1-eiwitten (Heterochromatine 1) ook beschouwd als geassocieerd met heterochromatine en epigenetische onderdrukking van genexpressie6. Deze eiwitten zijn essentiële componenten en markers van heterochromatinevorming.

Aangezien genomische instabiliteit cellen in staat stelt genetische veranderingen te verwerven die carcinogenese bevorderen, wordt heterochromatine steeds meer erkend in de ontwikkeling van kanker en kan het doelwit zijn voor kankerbehandeling7,8. Momenteel zijn er geen geneesmiddelen die goed zijn ingeburgerd in het helpen van heterochromatinevorming. Hier presenteren we een eenvoudige en snelle maar efficiënte methode voor het screenen van kleine moleculen verbindingen die heterochromatinevorming bevorderen. De screening wordt gedaan door Drosophila te behandelen met een bibliotheek van kleine moleculen. Deze methode maakt gebruik van een bonte oogkleur fenotype in de DX1Drosophila stam die wordt beïnvloed door heterochromatine niveaus. DX1 vliegen bevatten een tandem array van zeven P [lac-w] transgenes, die de bonte expressie / depressie, afhankelijk van heterochromatinisatie, daarom, de omvang van de variëteit in de oogkleur weerspiegelen de heterochromatine niveau. Specifiek, toenemende heterochromatine kan worden gedetecteerd door het stijgende aandeel van bonte oogkleur (wit oog). Integendeel, afnemende heterochromatine zou worden gedetecteerd door het stijgende aandeel van de P[lac-w] transgene expressie (rode ogen)9,10,11,12.

Daarom maken we gebruik van dit Drosophila transgene systeem dat een bonte oogkleur fenotype produceert, omdat de expressie direct gecorreleerd is aan de hoeveelheid heterochromatine aanwezig. Bij ontdekking van verbindingen die worden verdacht van het bevorderen van heterochromatine vorming, kunnen we bevestigen dit vermoeden met behulp van andere methoden, zoals westerse vlek. Deze heterochromatine-bevorderende stoffen kunnen in de toekomst verder worden ontwikkeld voor klinische studies bij patiënten.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

1. Voorbereiding drugsbibliotheek

  1. Identificeer en bereid een geneesmiddelenbibliotheek voor om te worden gescreend met behulp van het juiste oplosmiddel bij een gewenste concentratie (bijvoorbeeld 10 mM in DMSO).
    OPMERKING: Een specifiek voorbeeld voor een geneesmiddelenbibliotheek is het Oncologie Set III van het National Cancer Institute (NCI) Developmental Therapeutics Program (DTP). Compounds in deze set worden geleverd als 20 μL bij 10 mM in 100% DMSO in twee 96-well PP U-bodemplaten en opgeslagen bij -20 °C. De NCI Plate kaarten, en de fundamentele chemische gegevens van elk medicijn kon worden gevonden op de volgende websites:
    NCI-kenteken 4740
    NCI-kenteken 4741

2. Scherm voor heterochromatine-bevorderende drugs met Drosophila

  1. Drosophila Drosophila Fokstrategie (Figuur 1A)
    1. Dag 1: Kruis drie w1118/Y; DX1/CyO mannelijke vliegen en drie of meer maagdelijke w1118 vrouwelijke vliegen in een 25 mm x 95 mm voedsel flacon met 9 mL van standaard Drosophila food media (Bloomington recept). Stel drie replicerenflacons in voor elk medicijn en één controle voor het scherm.
      LET OP: DX1 vliegen werden vriendelijk verstrekt door James Birchler (Universiteit van Missouri)9,13.
    2. Dag 2 en dag 3: Laat de vliegen 2 dagen eieren leggen bij kamertemperatuur (22 °C).
    3. Dag 4: Gebruik een korte uitbarsting van CO2-gas om de ouder vliegen te verdoven en te ontdoen van de ouder vliegt in een "vliegen mortuarium" (een fles met 70% alcohol).
  2. Voer drugs naar Drosophila voor onderzoek.
    1. Verdun elke drugverbinding uit de oorspronkelijke voorraad (20 μL bij 10 mM in 100% DMSO in 96-well PP U-bodemplaten) tot een 10 μM eindconcentratie met 33% DMSO in water. Gebruik 33% DMSO in water zonder enig medicijn als controle.
      OPMERKING: Sommige geneesmiddelen zijn slecht oplosbaar in water en werden opgelost in DMSO. 100% DMSO is giftig voor vliegen. 33% is aanvaardbaar.
    2. Dag 4: Pipetteer 60 μL van een 10 μM medicijnoplossing of controle op de bovenkant van vliegvoedsel. Zorg er op dit punt voor dat de oudervliegen zijn verwijderd en dat er vliegeieren en kruipende eerste-instar larven op het voedsel zijn.
    3. Dag 6: Herhaal pipetteren 60 μL van dezelfde 10 μM medicijnoplossing voor de voedselflacon.
      OPMERKING: Aangezien drugs aan het vliegvoedsel zijn toegevoegd, bevat het voedsel aan het bovenste oppervlak een concentratie van bijna 10 μM en kon het bodemvoedsel niet volledig worden gepenetreerd. Alle vliegen leggen eieren op de voedseltop en eten het bovenste oppervlaktevoedsel.
  3. Observeer en scoor kleurveranderingen in de ogen.
    1. Twee dagen nadat de F1-vliegen tevoorschijn komen (ongeveer op dag 14), onderzoeken de vliegen. Gebruik een korte uitbarsting van CO2 om de F1-vliegen te verdoven en verwijder de vliegen van hun flacon op een poreus ontleedpad met CO2 die onder een filterpapier doorsippend is.
    2. Inspecteer de vliegen op dit pad onder een dissectie microscoop. Bestudeer de hele vlieg en identificeer alle w1118/Y; DX1/+ heterozygoot mannetjes door hun het ontbreken van de CyO dominante krullend vleugel fenotype.
    3. Scoor de oogkleur van elk van de w1118/Y; DX1/+ heterozygoot man vliegt op een schaal van 1 tot 5 (Figuur 1B). Het percentage witte oogkleur werd als volgt beoordeeld:
      1. <5% rood verstrooid oog totaal oppervlak
      2. 6% - 25% rode vlekken oog totale oppervlakte
      3. 26% - 50% rode vlekken oog totale oppervlakte
      4. 51% - 75% rode vlekken oog totale oppervlakte
      5. >75% rode vlekken oog totale oppervlakte
      OPMERKING: Als alternatief homogeniseer vliegkoppen in 100% methanol en gebruik een spectrometer om oogpigmentatie te meten op OD 450 nm. Selecteer alleen mannetjes omdat PEV meer pronouced is in DX1-mannetjes. Score meer dan 10 mannetjes in elk flesje.
    4. Bereken de gemiddelde kleurindex van alle mannetjes van elke flacon gescoord. Werk drievouden uit voor elke verbinding(figuur 1C).
      OPMERKING: Aangezien de kleur van het oog varieert met de leeftijd, is dit een tijdgevoelige stap. De oogkleur moet worden berekend op dezelfde leeftijd - 2 dagen oud. Meestal >10 vliegen moet worden gescoord in elke flacon.
    5. Om te bevestigen dat de verbindingen inderdaad heterochromatinevorming bevorderen, gebruikt u een andere techniek, zoals westerse vlekken om te valideren (figuur 1G).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Dit protocol werd met succes gebruikt om verbindingen te screenen die heterochromatinevorming in Drosophilabevorderen , wat een efficiënt en goedkoop in vivo-systeem is voor de ontwikkeling van geneesmiddelen(figuur 1). We onderzochten een kleine-molecuul drug bibliotheek, Oncologie Set III, die bestaat uit 97 FDA geautoriseerde oncologie drugs, met behulp van de DX1 stam van Drosophila melanogaster (Figuur 1B). De res...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Heterochromatine is een verkorte vorm van DNA die een centrale rol speelt bij het reguleren van genexpressie. Het wordt steeds meer erkend bij kanker en kan dienen als een potentieel doelwit voor kankertherapie15,16,17,18. Kleine moleculen verbindingen worden vaak gebruikt in de ontwikkeling van geneesmiddelen als gevolg van voordelen in de productie, behoud, en metabolisme in menselijke licham...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben geen belangenconflicten bekend te maken.

Dankbetuigingen

Wij danken J. Birchler, E. Bach en het Bloomington Drosophila Stock Center voor diverse Drosophila stammen; het National Cancer Institute (NCI) Developmental Therapeutics Program for the Oncology Set small-molecule drug library; UCSD studenten waaronder Amy Chang, Taesik You, Jessica Singh-Banga, Rachel Meza, en Alex Chavez. Onderzoek gemeld in deze publicatie werd ondersteund door een onderzoekssubsidie van american Thoracic Society aan J.L. en financiering van NIH: R01GM131044 aan W.X.L.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
DrosophilaDX1 stamDX1 vliegen werden vriendelijk ter beschikking gesteld door James Birchler (University of Missouri)
Drosophila voedingsmediaUCSD vliegkeuken
MethotrexaatNCI drug bibliotheek
Dimethylsulfoxide (DMSO)SigmaD2650
Ethyl alcoholSigmaE7023-500ML

Referenties

  1. Morgan, M. A., Shilatifard, A. Chromatin signatures of cancer. Genes Development. 29 (3), 238-249 (2015).
  2. Saksouk, N., Simboeck, E., Dejardin, J. Constitutive heterochromatin formation and transcription in mammals. Epigenetics Chromatin. 8, 3(2015).
  3. Allshire, R. C., Madhani, H. D. Ten principles of heterochromatin formation and function. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 19 (4), 229-244 (2018).
  4. Jenuwein, T., Allis, C. D. Translating the histone code. Science. 293 (5532), 1074-1080 (2001).
  5. Grewal, S. I., Moazed, D. Heterochromatin and epigenetic control of gene expression. Science. 301 (5634), 798-802 (2003).
  6. Heard, E. Delving into the diversity of facultative heterochromatin: the epigenetics of the inactive X chromosome. Current Opinion in Genetics & Development. 15 (5), 482-489 (2005).
  7. Ci, X., et al. Heterochromatin Protein 1alpha Mediates Development and Aggressiveness of Neuroendocrine Prostate Cancer. Cancer Research. 78 (10), 2691-2704 (2018).
  8. Zhu, Q., et al. Heterochromatin-Encoded Satellite RNAs Induce Breast Cancer. Molecular Cell. 70 (5), 842-853 (2018).
  9. Dorer, D. R., Henikoff, S. Expansions of transgene repeats cause heterochromatin formation and gene silencing in Drosophila. Cell. 77 (7), 993-1002 (1994).
  10. Fanti, L., Dorer, D. R., Berloco, M., Henikoff, S., Pimpinelli, S. Heterochromatin protein 1 binds transgene arrays. Chromosoma. 107 (5), 286-292 (1998).
  11. Shi, S., et al. JAK signaling globally counteracts heterochromatic gene silencing. Nature Genetics. 38 (9), 1071-1076 (2006).
  12. Shi, S., et al. Drosophila STAT is required for directly maintaining HP1 localization and heterochromatin stability. Nature Cell Biology. 10 (4), 489-496 (2008).
  13. Ronsseray, S., Boivin, A., Anxolabehere, D. P-Element repression in Drosophila melanogaster by variegating clusters of P-lacZ-white transgenes. Genetics. 159 (4), 1631-1642 (2001).
  14. Loyola, A. C., et al. Identification of methotrexate as a heterochromatin-promoting drug. Scientific Reports. 9 (1), 11673(2019).
  15. Dialynas, G. K., Vitalini, M. W., Wallrath, L. L. Linking Heterochromatin Protein 1 (HP1) to cancer progression. Mutation Research. 647 (1-2), 13-20 (2008).
  16. Janssen, A., Colmenares, S. U., Karpen, G. H. Heterochromatin: Guardian of the Genome. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 34, 265-288 (2018).
  17. Zhu, Q., et al. BRCA1 tumour suppression occurs via heterochromatin-mediated silencing. Nature. 477 (7363), 179-184 (2011).
  18. Hu, X., et al. Unphosphorylated STAT5A stabilizes heterochromatin and suppresses tumor growth. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (25), 10213-10218 (2013).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Drosophila screeningScore van oogvariegatieDX1 stamIdentificatie van methotrexateWestern blot validatieHeterochromatinevormingKankertherapieIn vivo screeningTesten van drug libraries

Gerelateerde artikelen