Geleid Assemblage van Elastin-achtige eiwitten in gedefinieerde supramoleculaire structuren en cargo-encapsulation in vitro

Samenvatting

Op het snijvlak van organische en waterige oplosmiddelen assembleren op maat gemaakte amfifiele elastine-achtige eiwitten zich in complexe supramoleculaire structuren zoals blaasjes, vezels en coacervaten die worden geactiveerd door omgevingsparameters. De beschreven assemblageprotocollen leveren Op eiwitmembraan gebaseerde compartimenten (PMBC's) met tunable eigenschappen, waardoor de inkapseling van verschillende lading.

Samenvatting

Op maat gemaakte eiwithoudende bouwstenen zijn veelzijdige kandidaten voor de assemblage van supramoleculaire structuren zoals minimale cellen, drugsafgiftevoertuigen en enzymsteigers. Door hun biocompatibiliteit en tuniekheid op genetisch niveau zijn Elastin-achtige eiwitten (ELP) ideale bouwstenen voor biotechnologische en biomedische toepassingen. Niettemin blijft de assemblage van op eiwitten gebaseerde supramoleculaire structuren met verschillende fysiochemische eigenschappen en een goed inkapselingspotentieel een uitdaging.

Hier bieden we twee efficiënte protocollen voor begeleide zelfassemblage van amfifiele ELPs in supramoleculaire eiwitarchitecturen zoals sferische coacervates, vezels en stabiele blaasjes. De gepresenteerde assemblageprotocollen genereren Protein Membrane-Based Compartments (PMBC's) op basis van ELP's met aanpasbare fysisch-chemische eigenschappen. PMBC's vertonen fasescheidingsgedrag en onthullen methodeafhankelijke membraanfusie en zijn in staat om chemisch diverse fluorescerende ladingmoleculen in te kapselen. De resulterende PMBC's hebben een hoog toepassingspotentieel als een medicijnformulerings- en leveringsplatform, kunstmatige cel en gecompartimenteerde reactieruimte.

Inleiding

De assemblage van supramoleculaire structuren voor biotechnologische toepassingen wordt steeds belangrijker^1,2,3,4,5. Voor de assemblage van functionele architecturen zoals coacervates, blaasjes en vezels met de gewenste fysisch-chemische eigenschappen is het belangrijk om de fysicochemische en conformatie-eigenschappen van de componenten te begrijpen en te controleren. Door de moleculaire precisie van moleculen in de natuur zijn bouwstenen voor supramoleculaire structuren steeds meer gebaseerd op lipiden, nucleïnezuren of eiwitten. In vergelijking met synthetische polymeren zorgen eiwithoudende bouwstenen voor nauwkeurige controle over opkomende supramoleculaire structuren⁶ op genetisch niveau. De primaire aminozuur (aa) sequentie van de afzonderlijke eiwitbouwstenen codeert intrinsiek de informatie voor hun assemblagepotentieel van het moleculaire tot het macroscopische niveau, evenals de driedimensionale vorm en fysische eigenschappen van de uiteindelijke supramoleculaire structuur⁷.

Gemelde methoden voor de assemblage van verschillende supramoleculaire structuren bevatten vaak amfifiele eiwitten zoals temperatuurgevoelige elastine-achtige eiwitten (ELP)^5,8,9, recombinant oleosine¹⁰en kunstmatige eiwitfifielen¹¹. Temperatuur geactiveerde methoden hebben geleid tot de assemblage van micelles^4,10,12Vezels¹³Bladen¹⁴en blaasjes^9,15,16. Methoden met organische oplosmiddelen zijn toegepast voor de vorming van dynamische eiwitgebaseerde blaasjes^8,11,14. Tot nu toe, toegepaste protocollen voor blaasvorming vaak gebrek aan montage controle over micrometer formaat assemblages^16,17of hebben een beperkte montage opbrengst⁵. Bovendien hebben sommige gemelde elp-gebaseerde blaasjes een verminderde inkapselingspotentieel¹²of beperkte stabiliteit in de tijd⁹. Het aanpakken van deze nadelen, de gepresenteerde protocollen in staat stellen de zelfassemblage van micrometer en sub micrometer formaat supramoleculaire structuren met verschillende fysiochemische eigenschappen, goede inkapseling potentieel en lange tijd stabiliteit. Op maat gemaakte amfifiele ELP's assembleren zich in supramoleculaire structuren, verspreid over het bereik van sferische coacervates en zeer geordende gedraaide vezelbundels tot unilamellaire blaasjes, afhankelijk van het toegepaste protocol en de bijbehorende omgevingsomstandigheden. Grote voertuigen op basis van eiwit membraan compartimenten (PMBC) onthullen alle belangrijke fenotypes zoals membraan fusie en fase scheiding gedrag analoog aan liposomen. PMBCs efficiënt inkapselen chemisch diverse fluorescerende lading moleculen die kunnen worden gecontroleerd met behulp van eenvoudige epifluorescentie microscopie. De repetitieve ELP domeinen die in deze studie worden gebruikt zijn aantrekkelijke bouwstenen voor eiwitgebaseerde supramoleculaire architecturen¹⁸. Van de ELP pentapeptide repeat unit (VPGVG) is bekend dat het andere aa tolereert naast proline op de vierde positie (valine, V), met behoud van de structurele en functionele eigenschappen¹⁹. Het ontwerp van amfifiele ELPs met kenmerkende hydrofiele en hydrofobe domeinen werd gerealiseerd door het inbrengen van aa gastresiduen (X) in de VPGXG herhaling met duidelijke hydrofobe, polariteit en lading²⁰. Amfifiele ELP-domeinen die zijn uitgerust met hydrofobe fenylalanine (F) of isoleucine (I), terwijl het hydrofiele domein geladen glutaminezuur (E) of arginine (R) als gastresiduen bevatte. Een lijst van in aanmerking komende amfifiele ELP-constructies en overeenkomstige aa-sequenties is te vinden in de aanvullende informatie en referenties^8,21. Alle bouwstenen waren voorzien van kleine fluorescerende kleurstoffen of fluorescerende eiwitten voor visualisatie via fluorescentiemicroscopie. mEGFP en andere fluorescerende eiwitten werden N-terminaal gefuseerd met de hydrofiele domeinen van de ELP-amfifielen. Organische kleurstoffen werden geconjugeerd via kopervrije stam bevorderd alkyne-azide cycloaddition (SPAAC) tot een co-translationeel geïntroduceerd onnatuurlijk aminozuur (UAA). De co-translationele integratie van de UAApara-azidophenylalanine (pAzF)²²staat de N-terminal modificatie van het hydrofiele ELP-domein toe. Op deze manier de groene fluorescerende kleurstof BDP-FL-PEG₄-DBCO (BDP) of een klein fluorescerend molecuul met een gespannen cyclooctyne kan worden gebruikt als fluorescerende sonde. Succesvolle integratie van de UAA pAzF en cycloaddition van de kleurstof via SPAAC kan gemakkelijk worden bevestigd via LC-MS / MS als gevolg van efficiënte ionisatie van de overeenkomstige tryptische peptiden⁸. Deze kleine organische kleurstof werd toegepast om de oplosmiddelkeuze voor assemblageprotocollen te verbreden, aangezien fluorescerende eiwitten onverenigbaar zijn met de meeste organische oplosmiddelen. De twee meest efficiënte assemblageprotocollen voor supramoleculaire structuren die in ons lab zijn ontwikkeld, worden hieronder beschreven. De THF zwelling methode is alleen compatibel met organische kleurstof gemodificeerde amfifiele ELP. De extrusiemethode 1-butanol (BuOH) is daarentegen compatibel met veel eiwitten als fluorescerende sonde, bijvoorbeeld mEGFP, omdat de beschreven methode de fluorescentie van deze fusie-eiwitten volledig behoudt. Bovendien werkt de inkapseling van kleine moleculen en vesiculatiegedrag het beste door gebruik te maken van de BuOH extrusiemethode.

Protocol

1. Ontwerp en klonen van amfifiele elastine-achtige eiwitten (ELP's)

1. Kloon en ontwerp de constructies zoals elders beschreven^8,20. Plasmids zijn beschikbaar op aanvraag.

2. Eiwitexpressie, zuivering en bereiding

1. Expressie van F20E20-mEGFP en F20E20-mCherry
   1. Inenting belangrijkste expressie cultuur van 's nachts pre-cultuur aan een OD₆₀₀ van 0,3. Incubeer bij 37 °C, 200 tpm in steriel 400 mL LB medium aangevuld met toegeëigende antibiotica in een kolf van 2 L.
   2. Bereid IPTG-voorraadoplossing (1 M) voor op inductie van de expressiecultuur in ultrazuiver water.
   3. Wanneer OD₆₀₀ 0,5–0,8 is bereikt, voegt u IPTG toe aan expressiecultuur tot een uiteindelijke concentratie van 1 mM en verlaagt u de incubatietemperatuur tot 20 °C. Laat expressie bij 20 °C voor ongeveer 20 uur bij 200 rpm.
2. Expressie van amfifiele ELP met UAA pAzF
   1. Inenting belangrijkste expressie cultuur van 's nachts E. coli pre-cultuur met de twee plasmiden pEVOL pAzF en bijvoorbeeld pET28-NMBL-(TAG)R40F20-his tot een OD₆₀₀ van 0,3 (zie aanvullende informatie voor aminozuur sequenties). Incubeer bij 37 °C, 200 tpm in steriel 400 mL LB medium aangevuld met kanamycine en chlooramfenicol in een kolf van 2 L.
   2. Bereid 100 mM pAzF voorraadoplossing in ultrazuiver water. Voor 10 mL pAzF voorraad oplossing, wegen 206.2 mg pAzF en resuspend it in 8 mL van ultrazuiver water. Om de pAzF op te lossen verhoog de pH van de oplossing met 3 M NaOH en meng krachtig. Wanneer pAzF is opgelost, verlaagt u de pH voorzichtig tot 10,5 en voegt u ultrazuiver water toe aan een eindvolume van 10 mL. Gebruik een steriel filter (0,22 μm) en aliquot de oplossing in 2 mL reactiebuizen.
   3. Bereid 1 M IPTG voorraadoplossing voor in ultrazuiver water en 20% arabinose voorraadoplossing in ultrazuiver water.
   4. Wanneer OD₆₀₀ 0,5–0,8 wordt bereikt, voegt u pAzF toe aan de expressiecultuur aan een uiteindelijke concentratie van 2 mM. Incubatiecultuur gedurende 10 min, 37 °C, 200 rpm om pAzF-opname mogelijk te maken.
   5. Expressie van doeleiwit en expressie van het noodzakelijke tRNA/t-RNA synthetase opwekken via gelijktijdige toevoeging van IPTG (1 mM) en arabinose (2%) en de incubatietemperatuur te verlagen tot 20 °C.
   6. Laat expressie bij 20 °C voor ongeveer 20 uur bij 200 rpm. De uitdrukkingscultuur van de oogst door centrifugering bij 4 °C, 4000 x g, 40 min.
3. Cellyse en eiwitzuivering
   1. Storing de E. coli-pellet opnieuw op in lysisbuffer (10 mL per liter cultuur; 50 mM Tris-HCl pH 8, 500 mM NaCl, 4 M urea, 0,25% Triton X-100) met lysozyme (0,1 mg/mL) en PMSF (0,1 mM). Incubeer gedurende 30 min op ijs en vries en ontdooi daarna tweemaal door het monster onder te dompelen in vloeibare stikstof.
   2. Sonicate de vering (30%, 15 keer, 30 s: 10 s break) en maak het lysaat vrij via centrifugering (4 °C, 10.000 x g voor 40 min).
   3. Eiwit zuiveren met behulp van affiniteitschromatografie (bijvoorbeeld op een nikkelkolom van 1 mL met behulp van een FPLC-systeem dat is aangesloten op een fractiecollector; zie Materiaaltafel). Maak het eiwit los met elutiebuffer (50 mM Tris-HCl, 500 mM NaCl, 4 M urea, 250-500 mM imidazool) en bewaar bij 4 °C tot verdere verwerking.
   4. Analyseer de zuiveringsefficiëntie via SDS-PAGE.

3. Wijziging van elp's via SPAAC

1. Een schatting van de concentratie van de ELP-oplossing.  Een₂₈₀ absorptie voor concentratie-evaluatie is niet waardevol, omdat pAzF-R40F20 sequentie ontbreekt aminozuren absorberen in het UV-bereik. Daarom kan een eerder lyofielende en gewogen ELP-amfifiel worden gebruikt als referentie voor sds-paginabandvergelijking. Door vergelijking van de samengevatte grijswaardeintesiteit van SDS PAGE-banden van ELP-oplossingen met bekende concentraties en uw monster kan de ruwe concentratie van uw monster worden geschat.
2. Voeg 1 μL fluorescerende kleurstof BDP-FL-PEG4-DBCO (10 mM voorraadoplossing; 20 μM eindconcentratie) toe aan 500 μL ELP-oplossing (~20 μM). Incubeer de reactie ongeveer 10 uur bij 15 °C, tijdens het schudden en beschermd tegen licht.
3. Voor verder gebruik, dialyseren de reactie om overmatige BDP te verwijderen.
   1. Equilibrate een dialysemembraan (b.v. 12 kDa cutoff) in ultrazuiver water gedurende 10 min. Snijd het dialysemembraan in de juiste maat die bovenop de opening van een reactiebuis met de aangeklikte ELP-oplossing moet worden geplaatst. Om het dialysemembraan in de opening te fixeren, plaatst u een reactiebuisdeksel met uitgeslagen kern op de opening, waardoor de buis wordt gesloten.
   2. Plaats de reactiebuis ondersteboven in de gekozen buffer. Wissel de buffer (2-5 L) twee keer na dialyse gedurende ten minste 3 uur per keer. Verwijder eventuele luchtbellen gevangen tussen het dialysemembraan en de buffer om een succesvolle dialyse te garanderen.

4. THF zwelling protocol

1. Dialyze homogene ELP-oplossing tegen fosfaat- of trisbuffer (10 mM) met stabiele pH 7,5 om zouten en resterende verbindingen uit zijn tagzuivering te verwijderen.
2. Bereid de lyofiever en koel af tot de begintemperatuur voor vriesdrogen.
3. Aliquot de gedialyseerde eiwitoplossing in 1,5 mL reactiebuizen (50-500 μL per buis) en schokvries in vloeibare stikstof. Om ongewenste vermenging van verschillende eiwitoplossingen tijdens het vriesdrogen te voorkomen, kunnen doppen met een klein gaatje op de reactiebuis worden geplaatst om het gedeeltelijk te verzegelen.
4. Neem de bevroren eiwitmonsters uit de vloeibare stikstof en plaats ze onmiddellijk in de lyofielemachine om te beginnen met vriesdrogen. Het vriesdrogen is voltooid wanneer het monster volledig droog is (ongeveer 24-48 uur). Vervolgens ventileren lyofiele amfifiele ELPs met droge N₂, dan onmiddellijk sluiten de reactie buis deksels om contact met vocht te voorkomen.
5. Voeg pure THF toe aan de lyofiele monsters (ELP, 5-10 μM) en plaats de oplossing in een waterbadsonicator met ijswater gedurende 15 min om zwelling van de ELP in THF mogelijk te maken.
6. Verwarm een thermocycler voor op 30-60 °C voor blaasvorming of tot 90 °C voor vezelvorming en bereid nieuwe reactiebuizen voor die ultrazuiver water of buffer bevatten (50 mM NaH₂PO₄/Na₂HPO_4,50 mM NaCl, pH 5-13). Sferische coacervaten assembleren zich voornamelijk bij 20 °C binnen pH 9-13. De vesitevorming wordt goedgekeurd bij 50-60 °C tussen pH 7 en 9. Vezelvorming wordt predominently geïnduceerd boven 60 °C tussen pH 5 en 12.
7. Plaats na de sonicatiestap de ELP/THF-oplossing en de voorbereide ultrazuivere water- of bufferoplossing in de thermocycler en verwarm tot de gewenste temperatuur gedurende 5 min. Wanneer de temperatuur is bereikt, moet de voorverwarmde ELP/THF-oplossing zorgvuldig worden gestratificeerd bovenop het voorverwarmde ultrazuivere water- of bufferoplossing. Een duidelijke scheiding van de twee fasen met een aparte interface moet zichtbaar zijn.
8. Plaats het mengsel opnieuw in de thermocycler en incubeer gedurende 20 min om vesicle- of vezelvorming op de interface mogelijk te maken. Laat de monsters daarna 10 minuten afkoelen tot kamertemperatuur voor analyse via fluorescentiemicroscopie of dialyse.
9. Dialyze oplossing met de supramoleculaire structuren tegen ultrazuiver water of buffer (50 mM NaH₂PO₄/Na₂HPO₄, 50 mM NaCl, pH 7-10).

5. BuOH extrusieprotocol

1. Bereid een 1-50 μM ELP-oplossing in ultrazuiver water of buffer (50 mM PB pH 7,5, 100 mM NaCl, kan maximaal 4 M urea bevatten). De concentratie van de amfifiele ELP F20R20-mEGFP- en F20R20-mCherry-oplossing kan worden bepaald aan de hand van de molaire uitstervingscoëfficiënten (F20R20-mEGFP A₂₈₀ = 22015 M^-1 cm^-1 en F20R20-mCherry A₂₈₀ = 34380 M^-1 cm^-1) (zie aanvullende informatie voor aas-sequentie).
2. Voeg 10%-20% (v/v) 1-butanol toe en meng de oplossing onmiddellijk door meerdere keren op en neer te ponsen of op te stellen door middel van een spuit. Een gewone 100 μL pipet of Hamilton spuit uitgerust met een 0,25 x 25 mm naald kan worden toegepast. De troebelheid van de oplossing tijdens het mengen moet toenemen, wat duidt op blaasvorming. 1-octanol 5%–15% (v/v) kan ook worden gebruikt voor vesicle extrusie in plaats van 1-butanol.
3. Om een smalle verdeling van de grootte te bereiken, extrudert u blaasjes met behulp van een mini-extruder door een membraan met een poriegrootte van 1 μm bij kamertemperatuur. De membraangrootte die wordt gebruikt voor extrusie bepaalt de bovenste grootte cutoff van de blaasjes.
4. Ga de blaasjes zoals hierboven beschreven (stap 3.3) dialyseren om de resterende 1-butanol te verwijderen.

6. Kleurstof inkapseling met het BuOH extrusieprotocol

1. Meng ongeveer 40 μL ELP-oplossing in 10 mM Tris-HCl, pH 8 met 1 μL Dextran Texas Red (0,0025 mg/mL eindconcentratie).
2. Voeg 10 μL BuOH toe aan de oplossing en extrudeer 5-10 keer door een spuit uitgerust met een naald van 0,25 x 25 mm.

7. Analyse van supramoleculaire structuren met behulp van fluorescentiemicroscopie

1. Plaats een wapeningsring op een glazen schuif en druk de kleefzijde stevig op het glas.
2. Voeg 5 μL van het monster toe aan de binnenkant van de wapeningsring en plaats er een afdekslip bovenop.
3. Sluit het monster af met nagellak aan de randen van de afdekkingsslip om verdamping van het monster tijdens de analyse te voorkomen.
4. Uitvoeren van fluorescentiemicroscopie zoals eerder beschreven⁸.

Resultaten

Protocolontwikkeling voor de productie van blaasjes
Figuur 1 schetst de twee verschillende methoden voor de bereiding van blaasjes. De THF zwellingsmethode aan de linkerkant bestaat uit drie opeenvolgende stappen en resulteert in verschillende supramoleculaire samenstellingen van de ELP, afhankelijk van de temperatuur. In figuur 1A epifluorescentiemicroscopie beelden tonen blaasjes samengesteld uit BDP-R20F20 en f...

Discussie

Een fout bij het volgen van de beschreven protocollen voor de assemblage van gedefinieerde supramoleculaire structuren leidt voornamelijk tot de vorming van niet-specifieke aggregaten(figuur 2, IV) of tot homogeen verdeelde ELP-amfifielen. Kritieke stappen van het protocol worden hieronder besproken:

Voor een hoge expressieopbrengst van de amfifiele ELP is een relatief lage temperatuur van 20°C optimaal. Voor een succesvolle affiniteitsgebaseerde zuivering van de ...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
1 µm and 0.2 µm Steril Filter	VWR
1,4-Dithiothreitol	Merck
1-butanol. >99.5% p.a.	Roth
2log DNA ladder	NEB
2-Mercaptoethanol	Roth
50 mL Falcon tubes	VWR
79249 Alkyne Mega Stokes dye	Sigma Aldrich
Acetic acid glacial	VWR
Acetonitrile, anhydrous, 99.8%	Sigma-Aldrich
Ampicillin sodium-salt, 99%	Roth
BDP-FL-PEG4-DBCO	Jena Bioscience
Biofuge	Heraeus
Bottle Top Filter with PES membrane (45 µm, 22 µm)	Thermo Scientific
Brillant Blue G250 (Coomassie)	Roth
BspQI	NEB
Camera DS Qi1	Nikon
Centrifuge 5417r	Eppendorf
Centrifuge 5810r	Eppendorf
CF-400-Cu square mesh copper grid	EMS
Chloramphenicol	Roth
CompactStar CS 4	VWR
Dextran, Texas Red, 3000 MW, neutral	Life Technologies
Digital sonifier	Branson
Dimethylsulfoxide (DMSO)	Applichem
Dnase I	Applichem
EarI	NEB
EcoRI-HF	NEB
Environmental shaker incubator ES-20	Biosan
Ethanol absolute	Roth
Ethidium bromide solution	Roth
Filter supports	Avanti
Glass plates	Bio-Rad
Glycerol Proteomics Grade	Amresco
Glycin	Applichem
H4-Azido-Phe-OH	Bachhem
Heat plate MR HeiTec	Heidolph
HindIII	NEB
HisTrap FF crude column	GE Life Sciences		Nickel column
Hydrochloride acid fuming, 37%, p.a.	Merck
Illuminator ix 20	INTAS
Illuminator LAS-4000	Fujifilm
Imidazole	Merck
Immersions oil for microscopy	Merck
Incubators shakers Unimax 1010	Heidolph
Inkubator 1000	Heidolph
IPTG, >99%	Roth
Kanamycinsulfate	Roth
L(+)-Arabinose	Roth
Laboratory scales Extend ed2202s/224s-OCE	Sartorius
LB-Medium	Roth
Lyophilizer Alpha 2-4 LSC	Christ
Lysozyme, 20000 U/mg	Roth
Microscope CM 100	Philips
Microscope Eclipse TS 100	Nikon
Microscopy cover glasses (15 x 15 mm)	VWR
Microscopy slides	VWR
Microwave	Studio
Mini-Extruder Set	Avanti Polar Lipids
NaCl, >99.5%, p.a.	Roth
Natriumhydroxid pellets	Roth
Ni-NTA Agarose, PerfectPro	5 Prime
Nucleopore Track-Etch Membrane	Avanti
PH meter 766 calimatic	Knick
Phenylmethylsulfonylflourid (PMSF)	Roth
Polypropylene Columns (1 mL)	Qiagen
PowerPac basic	BioRad
Propanol-2-ol	Emplura
Protein ladder 10-250 kDa	NEB
Recirculating cooler F12	Julabo
Reinforcement rings	Herma
SacI HF	NEB
SDS Pellets	Roth
Sodiumdihydrogen phosphate dihydrate, NaH2PO4	VWR
Sterile syringe filter 0.2 mm Cellulose Acetate	VWR
T4 DNA Ligase	NEB
TEMED	Roth
TexasRed Dextran-Conjugate	MolecularProbes
Thermomix comfort	Eppendorf
THF, >99.5% p.a.	Acros
Triton X 100	Roth
Trypton/Pepton from Casein	Roth
Ultrasonic cleaner	VWR
Urea p.a.	Roth
Vacuum pump 2.5	Vacuubrand
XbaI	NEB
XhoI	NEB
ZelluTrans regenerated cellulose tubular membrane (12.0 S/ 3.5 S/ 1.0 V)	Roth