Hier beschrijven we een protocol voor live celbeeldvorming van de corticale microtubuliercytoskelet bij de shoot apicale meristem en het toezicht op de reactie op veranderingen in de fysieke krachten.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Live Cell Imaging van Microtubule Cytoskeleton en Micromechanische Manipulatie van de Arabidopsis Shoot Apical Meristem
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Inzicht in cel- en weefselniveauregulatie van groei en morfogenese loopt al tientallen jaren voorop in biologisch onderzoek. Dankzij de vooruitgang in moleculaire en beeldvormende technologieën konden we inzicht krijgen in hoe biochemische signalen morfogenetische gebeurtenissen beïnvloeden. Het wordt echter steeds duidelijker dat naast biochemische signalen, mechanische signalen ook invloed hebben op verschillende aspecten van cel- en weefselgroei. Arabidopsis ontspruit apical meristem (SAM) is een koepel-vormige structuur verantwoordelijk voor de generatie van alle bovengrondse organen. De organisatie van het corticale microtubulicytoskelet dat apoplastische cellulosedepositie bemiddelt in plantencellen is ruimtelijk verschillend. Visualisatie en kwantitatieve beoordeling van patronen van corticale microtubuli zijn noodzakelijk voor het begrijpen van de biofysische aard van cellen in de SAM, omdat cellulose de stijfste component van de plantencelwand is. De stereotiepe vorm van corticale microtubuli organisatie is ook een gevolg van weefsel-brede fysieke krachten bestaande in de SAM. Verstoring van deze fysieke krachten en de daaropvolgende monitoring van corticale microtubuli organisatie maakt het mogelijk voor de identificatie van kandidaat-eiwitten die betrokken zijn bij het bemiddelen van mechano-perceptie en transductie. Hier beschrijven we een protocol dat helpt bij het onderzoeken van dergelijke processen.
Inleiding
Plantencellen worden omgeven door een extracellulaire matrix van polysacchariden en glycoproteïnen die mechanisch lijkt op een vezelversterkt composietmateriaal dat zijn mechanische eigenschappen dynamisch kan veranderen1. De groei van plantencellen wordt gedreven door de opname van water in de cel, wat resulteert in een gelijktijdige opbouw van trekkrachten op de celwand. In reactie op dergelijke krachten, wijzigingen in de fysieke toestand van de celwand zorgt voor celuitzetting. Cellen met primaire wanden zijn in staat om een snelle groei te ondergaan in vergelijking met secundaire celwand met cellen voornamelijk als gevolg van verschillen i....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
1. Plantengroei
- Zaai Arabidopsis zaden uitdrukken microtubbule binding domein versmolten met groene fluorescerende eiwitten (MBD-GFP)10 op de bodem en houden in lange dag (16 uur dag / 8 uur nacht), 20 °C / 6 ° C voorwaarden voor 1 week voor ontkieming.
- Breng na het ontkiemen zaailingen over naar nieuwe potten met voldoende groeiruimte om robuuste vegetatieve groei mogelijk te maken. Houd planten op korte dag (8 uur per dag /16 uur 's nachts), 20 °C/16 °C voorwaarden gedurende 3-5 weken.
- Breng planten over op lange dag (16 uur dag /8 uur nacht), 20 °C/16 °C voorwaarden en bewaar tot planten bout (2-3 weken....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Figuur 1 toont typische projectiebeelden verkregen uit MBD-GFP-lijnen met cellen in het midden van de koepel met ongeorganiseerde corticale microtubuli, en cellen aan de periferie met een omtrekverdeling(figuur 1A,B), terwijl de grensdomeincellen corticale microtubuli bevatten die parallel aan de lange as van de cel zijn uitgelijnd. Deze waarnemingen tonen verschillen in de ruimtelijke verdeling van corticale mic.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
De beoordeling van mechanische signaaltransductiegebeurtenissen is cruciaal om moleculaire regelgevers te identificeren die betrokken zijn bij de mechano-waarnemings- en transductietrajecten. Het hier beschreven protocol geeft een kwantitatief beeld van dergelijke gebeurtenissen door de corticale microtubulirespons te gebruiken als uitlezing voor een dergelijk proces in Arabidopsis SAMs. De hier beschreven procedure wordt routinematig gebruikt in verschillende studies in verschillende weefseltypen
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs hebben niets te onthullen.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| FibrilTool | Boudaoud, A. et al., Nat Protoc. 2014 | ||
| FIJI | Schindelin, J. et al., Nat Methods. 2012 | ||
| glycine | Merck | 1.04201.1000 | |
| Leica SP8 confocal microscope | Leica | DM6000 CS | |
| MAP4-GFP | Marc, J. et al., Plant Cell 1998 | ||
| micropore tape | Leukopor | 02482-00 | |
| MorphographX | Strauss, S. et al., Methods Mol Biol. 2019 | ||
| myo-inositol | Sigma | I5125 | |
| N6-benzyladenine | Sigma | B3408 | |
| nicotinic acid | Sigma | N4126 | |
| plastic hinged box | Electron microscopy sciences | 64312 | |
| PPM (Plant Preservative Mixture) | Plant Cell Technology | PPM | |
| Propidium iodide | Sigma | P4864 | |
| pyridoxine hydrochloride | Sigma | P9755 | |
| SURFCUT | Erguvan, O. et al., BMC Biol. 2019 | ||
| thiamine hydrochloride | Sigma | T4625 |
Referenties
- Cosgrove, D. J. Re-constructing our models of cellulose and primary cell wall assembly. Current Opinion in Plant Biology. 22, 122-131 (2014).
- McFarlane, H. E., Doring, A., Persson, S. The cell biology of cellulose synthesis. Annual Reviews in Plant Biology....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
