Traction Force Microscopie naar Studie B Lymphocyte Activatie

Samenvatting

Hier presenteren we een protocol dat wordt gebruikt om tractiekracht microscopie experimenten uit te voeren op B-cellen. We beschrijven de voorbereiding van zachte polyacrylamide gels en hun functionalisering, evenals data-acquisitie aan de microscoop en een samenvatting van data-analyse.

Samenvatting

Tractie kracht microscopie (TFM) maakt het mogelijk om krachten te meten die door een cel op een substraat worden geproduceerd. Deze techniek leidt tractiekrachtmetingen af van een experimenteel waargenomen verplaatsingsveld dat wordt geproduceerd door een cel die aan een elastisch substraat trekt. Hier hebben we TFM aangepast om de ruimtelijke en temporele structuur van het krachtveld te onderzoeken die door B-cellen wordt uitgeoefend wanneer geactiveerd door antigeenbetrokkenheid van de B-celreceptor. Gelstijfheid, kraaldichtheid en eiwitfunctionaliteit moeten worden geoptimaliseerd voor de studie van relatief kleine cellen (~ 6 μm) die interageren met liganden voor celoppervlakreceptoren.

Inleiding

B-cellen zijn de antilichaamproducerende cellen van het immuunsysteem. Om de adaptieve immuunrespons te activeren, verwerven ze eerst het antigeen in een inheemse vorm (d.w.z. niet-verwerkt) via een specifieke receptor genaamd B-celreceptor (BCR)¹. Dit proces vindt plaats in de lymfeklier B-celzone. Zelfs als sommige antigenen de B-cel kunnen bereiken via lymfatische vloeistoffen, worden de meeste antigenen, vooral met een hoog moleculair gewicht (>70 kDa, de limietgrootte voor lymfegevoeren) inderdaad in hun oorspronkelijke vorm gepresenteerd op het oppervlak van een antigeen aanwezige cel (APC), meestal een subcapsulaire sinus macrofagen of foliumvormige dendritische cel, via lectine- of Fc-receptoren (niet-specifieke). Het contact met deze cel leidt tot de vorming van een immuunsynaps waarbij de BCR kracht uitoefent op de APC-geassocieerde antigenen. De binding van een antigeen aan de BCR initieert BCR-signalering, wat krachtgenererende mechanismen kan activeren. Deze krachten kunnen belangrijk zijn voor het versterken van BCR-signalering, maar zijn ook essentieel voor B-cellen om het antigeen te extraheren en vervolgens te internaliseren.

Recente studies hebben aangetoond dat de BCR inderdaad mechanosensitive^{is 2}. Bijvoorbeeld, stijvere substraten ontlokken verbeterde BCR signalering³. Bovendien trekt de kracht die bij de immuunsynaps wordt gegenereerd op enkele BCRs om zijn affiniteit met antigeen te onderzoeken en zo affiniteitsdiscriminatie te waarborgen⁴. Het is daarom interessant om de mechanische reactie van B-cellen op antigeenpresentatie te onderzoeken en deze reactie te ontleden in termen van type receptoren betrokken (IgG/IgM)⁵, hechtingsmoleculen (integrin liganden) of in farmacologisch en genetisch gemodificeerde cellen (d.w.z. het uitschakelen van een eiwit stroomafwaarts van BCR-signalering of cytoskeletdynamica)⁶.

Een eenvoudige methode om de reactie van een cel op een substraat van fysiologische stijfheid te observeren en tegelijkertijd studiekrachten die op het substraat worden uitgeoefend, is Traction Force Microscopie (TFM). TFM bestaat uit het observeren van het verplaatsingsveld dat wordt geproduceerd door de cel die aan een elastisch substraat trekt. Oorspronkelijk werd de vervorming van de gel waargenomen door rimpels van de elastomeer zelf door fase-contrast microscopie⁷, maar het inbrengen van fluorescentie microbeads als fiduciale markers toegestaan voor een betere resolutie en is sindsdien uitgegroeid tot de standaard⁸. Deze methode is gebruikt om de tractie kracht uitgeoefend door aanhangende cellen, weefsels, en zelfs organoïden ingebed in gels te onderzoeken. Verschillende varianten van TFM zijn ontwikkeld⁹ met inbegrip van, in combinatie met superresolution microscopie (dwz, STED¹⁰ of SRRF¹¹), wijziging van de brekingsindex van de gel om TIRF microscopie¹²mogelijk te maken , vervangen van kralen door nanogedrukte patronen¹³, en met behulp van nanopillars in plaats van vlakke oppervlak¹⁴. Voor een volledige herziening van deze variaties, zie Colin-York et al.¹⁵.

Het hier gepresenteerde protocol beschrijft een procedure om krachten te meten die door B-cellen op een antigeengecoate substraat worden uitgeoefend. Deze krachten worden toegepast op de liganden (antigeen) om ze te clusteren en vervolgens uit het antigeen-presenterende substraat te halen. We hebben het standaard TFM-protocol aangepast om de stijfheid van fysiologische antigeen-presenterende substraten, de grootte en de relevante coating voor de B-cellen na te bootsen. Dit protocol maakt de studie van meerdere cellen tegelijk mogelijk en kan worden gebruikt in combinatie met fluorescentiemicroscopietechnieken en chemische behandelingen. Het is echter niet de bedoeling om enkele molecuulkrachtmetingen te sonde, waarvoor optische pincet¹⁶, moleculaire spanningssondes^17,18, biomembranekrachtsondes¹⁹, en atoomkrachtmicroscopie²⁰ meer geschikte technieken zijn. In vergelijking met andere methoden voor het meten van eencellige kracht (bijvoorbeeld micropipettes²¹ of microplaten²²⁾maakt TFM de reconstructie mogelijk van een volledige kaart van de krachten die bij de synaps worden uitgeoefend met een resolutie van ~ 300 nm. Dit is handig om spatio-temporele patronen te identificeren in de krachten die op het oppervlak worden uitgeoefend en, omdat de gel compatibel is met confocale beeldvorming, om ze te correleren met de rekrutering van specifieke eiwitten (bijvoorbeeld cytoskelet en signaaleiwitten).

Hoewel 3D TFM mogelijk is, is het niet compatibel met de stijfheid en de setup die we gebruikten. Vervormingen in 3D zijn haalbaar door andere meer complexe opstellingen zoals uitsteekkracht microscopie (AFM scannen van een vervormbaar membraan waar de cellen zijn verguld)^23,24 en elastische resonator interferentie stress microscopie (ERISM, een gel die fungeert als resonerende holte voor licht en markeren vervormingen van het substraat met nauwkeurigheid van een paar nanometers)²⁵. Hoewel deze technieken veelbelovend zijn, zijn ze nog niet gebruikt in B-cellen. Andere soorten TFM, zoals op nanopillars^14,zouden kunnen worden gebruikt om meer reproduceerbare substraten te hebben. Deze geometrie is echter niet aangepast aan zachte cellen omdat de cel de pilaren door elkaar doorspeed, wat de analyse bemoeilijkt. Deze aanpak is inderdaad gebruikt in T-cellen om het vermogen van de cel te observeren om structuren te bouwen rond de pijlers²⁶.

Ondanks zijn eenvoud, TFM met behulp van polyacrylamide gels zorgt voor de gelijktijdige observatie van vele cellen en kan gemakkelijk en goedkoop worden uitgevoerd in een lab uitgerust met een bank en een epifluorescentie microscoop (hoewel we raden confocale / spinnen schijf).

Om de fysiologische stijfheid van een APC na te bootsen, gebruikten we polyacrylamide gels met een stijfheid van ~ 500 Pa²⁷ en functionaliseerden we de gel met activerende antigenen. In dit protocol hebben we het oppervlak van de polyacrylamide gel gefunctionaliseerd met kippeneilysozyme (HEL). Dit maakt het mogelijk om krachten te meten die worden gegenereerd door stimulatie van de BCR door betrokkenheid van de antigeenbindingsplaats. Het gebruik van dit antigeen en de HEL-specifieke B-cellen van MD4-muizen zorgt voor een relatief uniforme krachtgeneratie in reactie op antigeenligatie²⁸. Echter, andere moleculen (zoals anti-IgM voor B6 muizen) kan worden geënt op de gel, maar de krachten gegenereerd in deze gevallen kunnen meer heterogeen en minder intens. Omdat B-cellen kleine cellen zijn (diameter ~ 6 μm), is het aantal kralen geoptimaliseerd om maximaal te zijn, maar nog steeds traceerbaar. Voor grote cellen die ~kPa krachten op hun substraten uitoefenen, kan men bevredigende resultaten bereiken met behulp van relatief schaarse kralen of het uitvoeren van eenvoudige deeltjesbeeld velocimetrie (PIV) om het vervormingsveld te reconstrueren. Echter, voor kleine cellen zoals B lymfocyten die stress zo klein als ~ 50 Pa uitoefenen, is het gebruik van single particle tracking vereist (deeltjes tracking velocimetrie, PTV) om de gewenste nauwkeurigheid te bereiken bij het reconstrueren van de vervorming veld. Om kralen individueel betrouwbaar te kunnen volgen, moet de vergroting van de objectieve lens ten minste 60x zijn en het numerieke diafragma rond 1.3. Zo moeten de gels relatief dun zijn (<50 μm), anders zijn de kralen niet zichtbaar omdat ze boven de werkafstand van de doelstelling liggen.

Het hoofdprotocol bestaat uit drie secties: gelbereiding, gelfunctionalisatie en beeldvorming; twee meer secties zijn optioneel en zijn gewijd aan de antigeen extractie kwantificering en beeldvorming van fluorescerende cellen.

Protocol

1. Gelbereiding

1. Silanization van de gel ondersteuning
   1. Activeer de coverslip of petrischaal met glazen bodem (die als gelsteun zal worden gebruikt) met een UV-lamp gedurende 2 minuten (wacht 30 s voordat u aan de UV-lamp wordt blootgesteld om blootstelling aan rest ozon te voorkomen).
   2. Silanize de coverslip/glasbodem schotel met behulp van 200 μL aminopropyltrimethoxysilane (APTMS) gedurende 5 minuten. Dit zal de steun voor de covalente binding van de gel voorbereiden.
   3. Was de coverslip/glazen bodemschotel grondig met ultrazuiver water.
   4. Droog de coverslip/glasbodemschotel met vacuümaspiratie.
2. Bereiding van de 18mm coverslip gebruikt om de gel plat
   1. Om de coverslips voor te bereiden, plaats ze eerst in een keramische coverslip houder. Zet vervolgens de coversliphouder in een klein bekerglas (50 mL) en giet siliconen reagens (opgeslagen bij 4 °C, herbruikbaar) over de coverslips, zeker om ze volledig te dekken.
   2. Bedek het bekerglas met aluminiumfolie en incubbate gedurende 3 minuten bij kamertemperatuur. Vul tijdens het wachten een groot bekerglas (500 mL) met ultrazuiver water. Na 3 minuten incubatie in het siliciumreagens, breng de houder van de covers met dekens met dekens over op het bekerglas van water.
   3. Spoel de hoezen goed af met ultrazuiver water, droog ze goed en houd op papierdoekjes. Ga voor de beste resultaten direct naar de volgende sectie.
3. Gelpolymeers
   1. Voor gels van 0,5 kPa meng je 75 μL van 40% acrylamide met 30 μL van 2% bisacrylamide (crosslinker) en 895 μL fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS). Deze premix kan maximaal een maand bij 4 °C worden bewaard.
   2. Voeg aan 167 μL 0,5 kPa gel premix 1% (1,67 μL) kralen, vortex en sonicaat gedurende 5 minuten toe in een badsononicator (standaard bench ultrasone reiniger met vermogen van 50-100 W en frequentie 40 kHz). Houd de mix beschermd tegen licht met behulp van aluminiumfolie.
      OPMERKING: De premix polymeriseert pas als de initiator (TEMED) is toegevoegd.
   3. Voeg 1% (1,67 μL) van 10% w/v ammoniumpersulfaat (APS) toe om polymerisatie te katalyseren.
   4. Voeg 0,1% (0,2 μL) N,N,N′,N′,N′-Tetramethylethyleediamine (TEMED) toe om polymerisatie te starten. Meng met een pipet. Zodra APS en TEMED zijn toegevoegd, polymeriseert de gel snel, dus ga snel over tot gelgie.
4. Gel gieten
   1. Pipet 9 μL van gel mix op elke coverslip / glas-bodem schotel (druppel in het midden, figuur 1A)
   2. Plaats de gesiliteerde/hydrofobe coverslip en vlak de gel(figuur 1B). Druk met behulp van tangen op de coverslip om ervoor te zorgen dat de gel zich verspreidt over het gehele gebied van de coverslip(figuur 1C)totdat deze begint te lekken.
   3. Omkeren de coverslip / glas-bodem schotel in een grote petrischaal en tik op de bank om kralen te dwingen gaan naar de gel oppervlak (Figuur 1D).
   4. Dek af met aluminiumfolie en laat 1 uur om te polymeriseren bij kamertemperatuur in een vochtige kamer (dat wil zeggen, zet een nat weefsel boven de schotel om verdamping te voorkomen).
   5. Voeg na 1 uur PBS toe aan het monster om het vrijkomen van coverslip te vergemakkelijken. Verwijder voorzichtig de coverslip met een naald (de coating met verschillende silanes moet het gemakkelijk afpellen van de coverslip van de gel, figuur 1E).
   6. Laat de gel in PBS.
      LET OP: Gels kunnen nu 5-7 dagen in PBS worden opgeslagen bij 4 °C, maar het is aan te raden om ze binnen 48 uur te gebruiken.

2. Gel functionalisatie

1. Bereid sulfosuccinimidyl 6-(4'-azido-2'-nitrophenylamino)hexanoaat (Sulfo SANPAH) oplossing voor bij 0,5 mg/mL in 10 mM HEPES buffer. Deze kan maximaal een week worden opgeslagen bij 4 °C bedekt met aluminiumfolie.
2. Aspirate de PBS van gels.
3. Voeg bij kamertemperatuur 150 μL Sulfo SANPAH toe aan de gel (figuur 1F).
4. Stel de gel 2 minuten bloot aan UV-behandeling om de sites van Sulfo SANPAH te fotoactiveren en laat deze aan het geloppervlak kleven.
5. Was met PBS drie keer(figuur 1G).
6. Herhaal stap 2.2–2.5.
7. Voeg 's nachts 250 μL HEL (100 μg/mL) toe aan elke gel en broed 's nachts in een vochtige kamer bij 4 °C terwijl u 's nachts bedekt blijft met aluminiumfolie (figuur 1H).
8. Verwijder HEL-antigeen en was drie keer met PBS.
   OPMERKING: HEL fungeert zowel als een antigeen als als een adhesiemolecuul. Het kan worden vervangen door andere moleculen die zich aan de receptor binden (bijvoorbeeld een antimuisigi,IgM, Bovine Serum Albumin, Ovalbumin) of gemengd met integrin liganden (bijvoorbeeld ICAM1 binding aan LFA1). Indien nodig kan antigeenextractie worden waargenomen met een fluorescerende versie van de HEL (verkregen door het molecuul te bevlekken met een eiwitlabelkit, zie stap 4). Houd er rekening mee dat een bepaalde concentratie in bulk mogelijk niet dezelfde oppervlakteconcentratie op de gel oplevert als op het glas: dit moet worden gekwantificeerd met secundaire kleuring als directe vergelijking vereist is.

3. Celbelasting en beeldvorming

1. Voordat beeldvorming, verwijder PBS uit de gels en voeg 500 μL van B-celmedia (RPMI 1640, 10% gedecomplementeerd foetaal kalf serum, 1% penicilline-streptomycine, 2% Natrium Pyruvaat, 50uM Mercaptoethanol en 1X Niet Essentiële Aminozuren) en laat ze in evenwicht te brengen met RT.
2. Celvoorbereiding
   1. Zuiver primaire B-cellen uit milt volgens een negatief selectieprotocol (zie Tabel met materialen). Typische uiteindelijke B-celopbrengst is ongeveer 1 x 10⁷ cellen. Concentraat dit tot 3 x 10⁶ cellen/mL in B-celmedium (RPMI-1640 aangevuld met 10% foetale kalfsserum, 1% penicilline-streptomycine, 0,1% mercaptoethanol en 2% natriumpyruvaat).
   2. Bewaar cellen indien nodig tot 6 uur bij 4 °C.
   3. Houd de cellen 30 minuten op 37 °C voor het verkrijgen van afbeeldingen.
3. Imaging
   1. Gebruik een confocale microscoop met thermische en (eventueel) CO_2-controle.
      OPMERKING: Ongeacht of een confocale of draaiende schijfmicroscoop wordt gebruikt, is het belangrijk om een objectief/gaatje te gebruiken waarmee een pixelgrootte <200 nm de kralen comfortabel kan volgen in de analysefase (bijvoorbeeld 60x, NA 1.3). Epifluorescentie microscopie kan ook worden gebruikt, maar het biedt een lagere signaal-ruisverhouding en kan individuele kraal tracking moeilijker.
   2. Twee hoofdlagen van kralen verschijnen aan de onderkant en de bovenkant van de gel. Focus op het gel vlak.
      LET OP: Een mooie gel zal verschijnen als een sterrenhemel, met kralen ongeveer gelijkmatig verdeeld op hetzelfde vlak.
   3. Programmeer de overname voor 30 minuten met een framerate van 5 s (dit is aanpasbaar aan de behoeften van het experiment, bijvoorbeeld, andere kleuren verwerven, z stack verwerven, enz.)
   4. Aspirate de media uit de gel, waardoor ongeveer 200 μL van de media op de gel. Plaats de gel op de microscoop en vind de oppervlaktelaag van kralen en een mooi gelijkmatig gebied op de gel.
   5. Voeg 80 μL cellen toe (raak de gel niet aan om scherp te blijven).
   6. Zorg ervoor dat de focus nog steeds correct is en dat cellen kunnen worden zien aflopend in het gebied (onder uitgezonden licht). Start de overname voordat de cellen de gel bereiken.
   7. In het geval van onbedoeld contact met gel, trillingen of focusdrift, pas de focus aan.
      OPMERKING: Het is cruciaal om een beeld van de ontspannen gel te verzamelen en dit kan elk beeld worden genomen vóór de komst van de cellen op de gel.

4. Fluorescerend HEL extract

1. Bereid fluorescerende HEL door het binden van een fluorescerende kleurstof (van een andere kleur dan de kralen een zoals Alexa 555), zie de tabel van materialen.
2. Vervang in stap 2.7 de conventionele HEL door de fluorescerende HEL.
3. Verkrijg afbeeldingen met lage verlichtingsinstellingen of een lage framesnelheid (bijvoorbeeld 2 frames per minuut) om fotobleekmiddelen te voorkomen.
4. Om HEL-extractie te kwantificeren, berekent u de intensiteit die over het celgebied is geïntegreerd voor elk frame I(t) gecorrigeerd en genormaliseerd door de intensiteit I(0) van frame 0 volgens de formule:
   
   OPMERKING: Het antigeen geconjugeerd met een fluoroforire is niet zichtbaar (waarschijnlijk te wijten aan het blussen van de fluorofoër op het geloppervlak), maar de aanwezigheid ervan op de gel kan worden geverifieerd met een anti-HEL en een fluorescerend secundair antilichaam. Er kan worden geverifieerd dat de fluoreofofre inderdaad fluorescerend is wanneer het loskomt door het van de gel te strippen met een met anti-HEL bekleed strookje en het te onthullen met een secundair fluorescerend antilichaam (op de coverslip)⁶. Het signaal van het geëxtraheerde antigeen is zeer zwak en wordt soms gemaskeerd door het lekken van de kralen. Als men alleen geïnteresseerd is in antigeenextractie, wordt aanbevolen om de gel voor te bereiden zonder kralen (stappen 1.3.2 en 1.4.3 overslaan).

5. Fluorescentie beeldvorming

1. Verkrijg fluorescerende B-cellen door B-cel te zuiveren uit de milt van genetisch gemodificeerde muizen zoals gedaan voor het wilde type (bijvoorbeeld van Lifeact-GFP of Myosin II GFP muizen).
2. Voor beeldvorming fluorescerende cellen, gebruik (indien mogelijk) een draaiende schijf microscoop met een water onderdompeling lange afstand 40x-100x doelstelling.
3. Houd de belichtingsduur en framerate laag om bleken te voorkomen.
   OPMERKING: De puntspreadfunctie in Z wordt sterk aangetast door de aanwezigheid van de gel, vandaar dat we voorstellen om een wateronderdompelingsdoelstelling te gebruiken. Levende rechtopstaande microscopie met waterdipende doelstellingen lijdt aan sterke sferische afwijkingen veroorzaakt door de aanwezigheid van de (sferische) cel (en celkern) in het emissiepad.

6. Analyse

OPMERKING: Data-analyse wordt in het algemeen uitgevoerd door eerst het corrigeren van de hele stapel voor drift, het vinden van de kralen in elk frame, het bijhouden van hun bewegingen met betrekking tot een referentiekader (genomen in afwezigheid van cellen), interpoleren van de verplaatsing veld en het omkeren van het probleem om de stress te verkrijgen met behulp van Fourier transformatie²⁹. Daarom raden we aan om een combinatie van ImageJ Macro- en MATLAB-programma's te gebruiken die kunnen worden gedownload van een online repository^30.

1. De film openen in ImageJ als stapel afbeeldingen
2. Voer de macro "Crop_and_save.ijm" uit
   1. Selecteer de regio's van belang (ROI) met het gereedschap Rechthoek en voeg ze toe aan de ROI-lijst met de 't'-toets.
   2. Bij het bijsnijden van de cel moet u een gebied van ten minste 5-10 pixels immobiele kralen bevatten. Sluit cellen die te dicht bij de grenzen of andere cellen staan uit de analyse uit. Klik na afloop op 'OK'.
   3. De macro stelt een masker van de cel voor: als dit bevredigend is klik op "OK". Als u niet bevredigend bent, klikt u op 'Niet ok' en selecteert u vervolgens handmatig een gesloten gebied met een selectiegereedschap (bijvoorbeeld 'Vrijhand' of 'Ovaal') en klik je op Doorgaan.
3. Open MATLAB en voer "TFM_v1.m".
   1. Voer de vereiste parameters in: controleer met name de beeldeigenschappen (pixelgrootte, tijdsinterval van acquisitie) en de geleigenschappen (Young modulus E, Poisson ratio).
   2. De referentieafbeelding is standaard ingesteld op de eerste. Stel het indien nodig in op een ander frame of stel het in op '0' om een extern bestand te laden.
   3. Zoek de uitvoer van de software in dezelfde map als het oorspronkelijke bestand (zie voor een beschrijving het User_notice.pdf bestand). Dit omvat een voorlopig spoor van de kralen ("FILENAME.fig"), een plot van de contractiele energie in de tijd ("FILENAME_energy.fig"), een tabel van verschillende hoeveelheden geïntegreerd over de cel (energie, gebied, momenten, enz.) "FILENAME_finaltable.mat", een structuur met de verplaatsing en kracht veld, films van de kraal, verplaatsing veld, stress en energie (die kan worden geopend met elke avi reader).
      OPMERKING: In de invoerparameters is de "Venstergrootte" het venster waarover de verplaatsing is geïnterpoleerd, vandaar de uiteindelijke resolutie van het stress- en verplaatsingsveld. Dit is ingesteld op een paar (standaard vier) pixels. Het is niet raadzaam om dit te verminderen, omdat het de resolutie kunstmatig zou verhogen door regio's te interpoleren waar geen kralen zijn.

Resultaten

Gezien de grootte van de cellen, algoritmen die de verplaatsing kaart van de kralen te extraheren via correlatieve technieken (zoals deeltjesbeeld velocimetrie) zijn in het algemeen niet erg nauwkeurig. Maar afhankelijk van de vereiste mate van resolutie, kan men gemakkelijk verkrijgen kwalitatieve resultaten met behulp van een gratis Fiji / ImageJ plugin^31,32. Hoewel deze aanpak voldoende is om stimulerende versus niet-stimulerende omstandigheden te vergelijken, raden we voor een grondige analyse aan om onze software te gebruiken die te downloaden is vanuit een online repository^30,die de kralen individueel bijhoudt en de verplaatsingsveldkaart op een bepaald tijdstip biedt als de interpolatie van de individuele kraalverplaatsingen³³. Verschillende kwantificeringen zijn op dit moment mogelijk. Bijvoorbeeld (door te veronderstellen dat de verplaatsing wordt veroorzaakt alleen door stress raakvlakken met de gel oppervlak) de software biedt ook de stress op elk punt waardoor die specifieke verplaatsing kaart. Dit is een soort "inversieprobleem": de verplaatsing op een bepaald punt hangt af van de som van alle krachten die over de andere punten worden uitgeoefend. Het "inversiealgoritme" houdt rekening met de fysieke parameters van het substraat: de stijfheid (Young modulus) en Poisson ratio. Directe algoritmen zijn meestal zeer nauwkeurig, maar rekenkundig duur. Algoritmen op basis van Fourier transformeren, net als de onze, uitvoeren in wezen een deconvolution in Fourier ruimte en zijn efficiënter, maar gevoelig voor een aantal fouten (voornamelijk als gevolg van de interpolatie stap). Deze algoritmen vereisen over het algemeen de afstemming van een parameter die voorkomt dat kleine lokale (en mogelijk artefactuele) verplaatsingen te relevant worden in de berekening van het stressveld (Tikhonov regularisatieparameter^8,29; Variabele 'Regularisatie' in het dialoogvenster; hier stellen we meestal gelijk aan 5 x 10^-19). Voor meer geavanceerde interpretatie en analyse, zoals spatio-temporele correlaties, lokale bewegingen, correlaties met tl-kanalen, raden we aan om samen te werken met experts in het veld. Voor een overzicht over computationele methoden zie Schwarz et al.⁹.

Zoals hierboven vermeld, correcte kraal beelden zien eruit als een "sterrenhemel", een uniforme en willekeurige verdeling van lichtpuntjes (Figuur 2A). Gegevens en analyse zijn niet betrouwbaar wanneer het aantal kralen te laag is(figuur 2B)of het beeld onscherp is(figuur 2C). Zodra B-cellen zijn neergestreken op het oppervlak van de gel, de kralen onder de cellen beginnen te bewegen als gevolg van de tractie kracht uitgeoefend door de cel op de gel. Frames waarvoor de kralen niet traceerbaar zijn, moeten worden verwijderd.

Als een controle is het mogelijk om door het oog de beweging van kralen te observeren die het "referentiekader" vergelijken, meestal het frame dat voorafgaat aan het eerste contact van de cel met het substraat. Bij benadering resultaten kunnen worden verkregen uit de single particle tracking (bijvoorbeeld Trackmate, Fiji ³⁴) zoals gedaan in figuur 3A. De analyse biedt een segmentatie van de kralen in de referentieafbeelding ("FILENAME.fig") als besturingselement.

Met de software die we voorstellen, kan men de verplaatsing(figuur 3B) en stressveld (de vector van de lokale stress bij elke pixel en elk keerpunt verkregen door inversie van het verplaatsingsveld, figuur 3C)verkrijgen. Scalaire product van de verplaatsings- en krachtvelden die zijn geïntegreerd in het gebied van de cel, zorgt voor het totale werk dat door de cel op het substraat wordt uitgeoefend (figuur 4A). Deze berekening vereist het masker van de cel geïntroduceerd in stap 6.2 van het protocol.

Om twee biologische omstandigheden te vergelijken (zoals het activeren van HEL versus niet-activerend substraat BSA, of wild type versus knock-out) is het nuttig om de gemiddelde curve(figuur 4B)of, nog meer synthetisch, een gemiddelde waarde te berekenen over de laatste tijdstippen (20 min) waar de energie een plateau bereikt(figuur 4C). Wanneer de ruimtelijke informatie van de krachten relevant is, is het mogelijk om enkele tijdspunten van elke voorwaarde te vergelijken(figuur 4D). Raadpleeg Kumari et al.⁶ voor een diepere analyse.

Een voorbeeld van fluorescentie antigeen extractie time lapse wordt weergegeven in figuur 5A: de progressieve verschijning van fluorescentie signalen op de synapse aangegeven antigeenloslating van de gel. De gemiddelde extractiecurve met het betrouwbaarheidsinterval (standaardfout van het gemiddelde) meer dan 15 cellen wordt weergegeven in figuur 5B.

Figuur 1: Schematische vertoning van de voorbereiding van de gel en de functionalisering ervan. Stappen worden beschreven in het protocol. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figuur 2: Drie voorbeelden van kraalbeelden van verschillende kwaliteiten. (A) Voorbeeld van kraalbeeld met de juiste signaal-ruisverhouding en de juiste dichtheid. (B) Voorbeelden van afbeeldingen met een te onvoldoende aantal kralen en (C) onscherp vlak. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figuur 3: Verwerking van de beelden om het krachtveld te extraheren. (A) Voorbeeld van een afbeelding van de kralen (omtrek van de cel in het wit, uit de transmissieafbeelding gehaald), kraaltracking op tijd t = 5 min (rode overlay) en verplaatsing (pijlen) ten opzichte van tijd t = 0 min (schaalbalk 5 μm). (B) Geïnterpoleerd verplaatsingsveld (weergegeven als vectorkril en magnitudekaart, pijlen zijn evenredig aan de verplaatsing [nm]; zie de kleurenbalk aan de rechterkant); onderkant: een vloeiender beeld van de omvang (verkregen door interpolatie met een bicubic functie). (C) Stressveld van verplaatsingsveld in paneel B (weergegeven als vectorvloeier en magnitudekaart; pijlen zijn evenredig aan de schuifspanning [Pa]; zie de kleurenbalk rechts); onderkant: een vloeiender beeld van de omvang (verkregen door interpolatie met een bicubic functie). Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figuur 4: Voorbeeld van informatie die kan worden geëxtraheerd uit kracht- en verplaatsingsvelden. (A) Voorbeeld van evolutie van energie in de tijd voor een enkele cel: een plateaufase (grijs gemarkeerd) verschijnt na ongeveer 10 minuten. (B) Vergelijking van de gemiddelde energiecurven en (C) van de relatieve plateauniveaus voor 65 cellen verguld op HEL (activerende) gecoate gel en 35 cellen op BSA (non-activating) gecoate gel (mediaan ± interquartile ranges worden getoond, werd de Mann-Whitney-test gebruikt voor statistische significantie). (D) Time-lapse kleurkaarten van stress voor HEL en controle BSA conditie; zowel magnitude en koker percelen worden getoond. Deze beelden zijn aangepast van Kumari et al.⁶. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figuur 5: Voorbeeld van experimenten met fluorescerend antigeen. (A) Time lapse van de extractie van fluorescerende HEL (onder: percentage van het maximum, schaalbalk = 3μm). (B) Antigeen verzamelen in de tijd (Mean ± SEM, n = 15). Deze beelden zijn aangepast van Kumari et al.⁶. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Discussie

De hier beschreven TFM-methode maakt de systematische studie van de actieve mechanische mogelijkheden van B-cellen mogelijk. In de context van B-cellen is dit gerelateerd aan de mogelijkheid om het antigeen te extraheren en te internaliseren. In vergelijking met andere TFM-methoden is het hier gepresenteerde protocol eenvoudig en eerder reproduceerbaar: de stijfheid, gemeten door inkeping van een glazen microsfeer en het gebruik van Hertz-model, ligt tussen de 400 en 600 Pa. Vergelijkbare protocollen zijn niet alleen met succes gebruikt voor B-cellen^35, maar ook voor T-cellen^36. In vergelijking met nanopillars (ook gebruikt voor T lymfocyten³⁷⁾biedt het een vlak homogeen oppervlak, vandaar dat de resultaten gemakkelijker te interpreteren zijn omdat de interactie van de gel voornamelijk beperkt is om raakvlakken te hebben.

Het door ons beschreven protocol geeft toegang tot de spatiotemporale dynamiek van de krachten die door B-cellen worden uitgeoefend op antigeen-presenterende substraten. Op ruimtelijk niveau geeft dit informatie over de lokalisatie van krachten, en in combinatie met fluorescentiemicroscopie, stelt de onderzoeker in staat om lokale krachten te correleren met de aanwezigheid van specifieke moleculen (d.w.z. componenten van het cytoskelet of BCR signalering trapsgewijze). Op temporele hoogte is het mogelijk om hoeveelheden (zoals totale energie of totale stress) te integreren om één waarde per tijdspunt te bieden en het geluid te verminderen. Dit zorgt voor observatie van de evolutie van de tractiekracht in de tijd (groei en plateau) en de aanwezigheid van pulsatiele patronen.

Kritische experimentele aspecten voor de analyse worden als volgt beschreven. i) Celdichtheid: om een correcte analyse uit te voeren, moeten cellen voldoende gescheiden zijn. We beschouwen een cel als analyseerbaar als het een leeg gebied van zijn eigen grootte eromheen heeft. ii) Transmissieafbeelding: het is raadzaam om ten minste een transmissiebeeld te verzamelen van de cellen tijdens het experiment dat in de analyse als masker moet worden gebruikt. (iii) Aantal kralen in de afbeelding: we raden aan om alleen afbeeldingen te analyseren waarbij het aantal kralen in de synaps tussen 30 en 200 ligt (d.w.z. 1-8 kralen/μm²). Lagere dichtheden zorgen niet voor een adequate reconstructie van de kaartverplaatsing. Hoge kraaldichtheden maken het volgen van een deeltje onbetrouwbaar. iv) Het aantal kralen moet tijdens het experiment constant zijn; schommelingen kunnen echter optreden als gevolg van kleine variabiliteit in de beeldvormingsomstandigheden (vooral bij kralen die te dicht bij elkaar liggen). Focus drift, indien zich voordoet, moet worden gecorrigeerd en problematische frames moeten worden weggegooid. (v) Gelkwaliteit: gels met te veel scheuren, variabiliteit in kralenverdeling of gels die te dik zijn, moeten worden weggegooid. (vi) Afhankelijk van het celtype kunnen cellen op late tijdstippen (>300 frames) na herhaalde blootstelling fototoxische effecten ondervinden. Het is raadzaam om het programma uit te voeren op een masker zonder cellen als een "baseline" te vergelijken met de gegevens. Dit geeft een omvang van het geluidsniveau alleen te wijten aan de experimentele omstandigheden.

Gels gebruikt om tractie kracht te meten in de klassieke hechting zorgen voor het onderzoek van processen die zich voordoen bij de focale hechting (actine stromen en rekrutering van signaalmoleculen)-de punten waar krachten worden toegepast^38,39. Krachten bij de synaps worden echter niet uitgeoefend door middel van focale verklevingen. Het spatiotemporale patroon van krachtgeneratie bij de B-cel immuunsynaps is tot voor kort niet kwantitatief onderzocht met behulp van deze methode. Met behulp van TFM, we waargenomen voor de eerste keer, kracht patroon op de B-cel immuun synaps, zoals gepresenteerd in onze recente studie⁶, het openen van bemoedigende perspectieven in de studie van lymfocyten.

Met name maakt deze methode gebruik van een beeld genomen vóór de komst van de cellen op de gel als referentiebeeld voor de krachtberekening. Gebruikelijke TFM-protocollen suggereren het nemen van de referentieafbeelding aan het einde van het experiment, na het losmaken van de cellen met trypsine; Hierdoor kan de onderzoeker op zoek naar een regio die rijk is aan cellen. Hoewel dit ook hier mogelijk is, is trypsine nogal inefficiënt bij het loskoppelen van B-cellen van antigencoated gel, moet men lang wachten op onthechting en het risico van gelmodificatie en bewegingen (die de hele gegevensset onbenut laten) is hoger.

De hier gepresenteerde methode is flexibel en kan worden toegepast om het effect van andere signalen bij de immuunsynaps te bestuderen, omdat het mogelijk is om andere eiwitten op het geloppervlak te enten (bijvoorbeeld integrin liganden en immunoglobulinen zijn getest) en zelfs fluorescerend antigeen (zie punt 4). Bovendien blijven cellen toegankelijk voor de onderzoeker voor medicamenteuze behandeling en lokale verstoringen. Ten slotte is de methode ook compatibel met beeldvorming vaste cellen. Voor deze waarnemingen wordt aanbevolen om de gel op een coverslip te maken, de cellen te bevlekken, de coverslip op een dia te lijmen en pas dan montagemedia en een andere coverslip toe te voegen. Observatie zal dan worden gedaan met de gel op de top om de afbraak van het beeld door de gel te voorkomen.

Mogelijke valkuilen zijn de variabiliteit in gel in polymerisatie en coating. Polymerisatie problemen zijn vooral te wijten aan de kwaliteit van initiator / katalysator. Ook kan de gel opblazen, vooral als niet direct na de montage wordt gebruikt. Dit probleem lijkt niet dramatisch invloed op de mechanische eigenschappen van de gel, maar het kan de kraal laag onbereikbaar voor het doel, effectief waardoor de gel nutteloos. We raden u aan extra gels voor te bereiden op elke aandoening wanneer dit probleem zich voordoet. Er kan ook een zekere variabiliteit in de coating, en het is van cruciaal belang om vers verdunde Sulfo SANPAH.

Tot slot hebben we een eenvoudige, goedkope en reproduceerbare methode beschreven om de krachten van B-cellen op de immunologische synaps te meten wanneer deze wordt geactiveerd door BCR-ligand. Het kan worden aangepast om de reactie op andere liganden en andere soorten lymfocyten (geheugen B-cellen, T-cellen, enz.) te bestuderen met het gebruik van de juiste receptorligand.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
3-aminopropyltrimethoxysilaan (APTMS)	Sigma-Aldrich	281778	Bewaar in geportioneerd, beschermd tegen vocht
40% Acrylamide-oplossing	Biorad	1610140
Alexa555 microschaal eiwitlabeling kit	Molecular Probes	A30007
Ammoniumpersulfaat (APS)	Sigma-Aldrich	A3678
B-cel isolatiekit, Muis	Miltenyi Biotec	130-090-862
B-mercaptoethanol	Gibco	31350-010
2% Bis-oplossing	Biorad	161-0142
Rundserumalbumine (BSA)	Euromedex	04-100-812-C
Dekglas 18mm	VWR	631-1580
Foetaal runderserum	PAA	A15-151	Decomplementeerd (40min @56°C)
Fluorodishes FD35	World Precision Instruments, Inc	FD35100
Fluosfeer: carboxylaat-gemodificeerd, 0.2um, donker rood	Molecular Probes	F8807
Heneigeel Lysozym	Sigma-Aldrich	L6876	Voorraad in portie 100mg/ml
MEM Niet-Essentiële Aminozuren-oplossing (100X)	Thermofisher/Gibco	11140035
N,N,N',N'-tetramethylethylendiamine (TEMED)	Euromedex	50406-B
PBS (Fosfaat Buffer Saline)	Gibco	10010-015
Penicilline-streptomycine	Gibco	15140-010
RMPI 1640 - Glutamax I	Thermofisher	61870-010
Sigmacote	Sigma-Aldrich	SL2
Natriumpyrovaat	Gibco	11360-039
sulfosuccinimidyl 6-(4'-azido-2'-nitrofenylamina)hexanoaat (Sulfo-SANPAH)	Thermo Scientific	22589