Hier presenteren we een methode om fibroblasten en Schwann cellen te zuiveren van zintuiglijke en motorische zenuwen in vitro.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Zuivering van fibroblasten en Schwann cellen van sensorische en motorische zenuwen in Vitro
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
De belangrijkste cellen in het perifere zenuwstelsel zijn de Schwann cellen (SCs) en de fibroblasten. Beide cellen duidelijk uitdrukken de sensorische en motorische fenotypes die betrokken zijn bij verschillende patronen van neurotrofe factor genexpressie en andere biologische processen, die zenuwregeneratie. De huidige studie heeft een protocol vastgesteld om zeer gezuiverde rattensensorische en motorische SC's en fibroblasten sneller te verkrijgen. De ventrale wortel (motorische zenuw) en de rugwortel (sensorische zenuw) van neonatale ratten (7 dagen oud) werden gescheiden en de cellen werden gedurende 4-5 dagen gekweekt, gevolgd door isolatie van sensorische en motorische fibroblasten en SCs door differentiële spijsvertering en differentiële therapietrouwmethoden sequentieel te combineren. De resultaten van immunocytochemie en flow cytometrieanalyses toonden aan dat de zuiverheid van de sensorische en motorische SCs en fibroblasten >90% was. Dit protocol kan worden gebruikt om een groot aantal sensorische en motorische fibroblasten / SCs sneller te verkrijgen, wat bijdraagt aan de exploratie van sensorische en motorische zenuwregeneratie.
Inleiding
In het perifere zenuwstelsel, de zenuwvezels bestaat voornamelijk uit axonen, Schwann cellen (SCs), en fibroblasten, en bevat ook een klein aantal macrofagen, microvasculaire endotheelcellen, en immuuncellen1. SCs wikkel de axonen in een 1:1 verhouding en zijn omsloten door een bindweefsel laag genaamd de endoneurium. De axonen worden vervolgens gebundeld om groepen genaamd fascicles vormen, en elke fascicle is verpakt in een bindweefsel laag bekend als het perineurium. Ten slotte is de hele zenuwvezel verpakt in een laag bindweefsel, dat wordt aangeduid als het epineurium. In het endoneurium bestaat de hele celpopulatie uit 48% SC's, en een aanzienlijk deel van de resterende cellen omvat fibroblasten2. Bovendien zijn fibroblasten belangrijke componenten van alle zenuwcompartimenten, waaronder het epineurium, het perineurium en het endoneurium3. Veel studies hebben aangetoond dat SC's en fibroblasten een cruciale rol spelen in het regeneratieproces na perifere zenuwletsels4,5,6. Na de transsectie van de perifere zenuw regelen de perineuriale fibroblasten celsorde via de ephrin-B/EphB2-signaleringsroute tussen SC's en fibroblasten, waardoor de axonale hergroei door wonden verder wordt geleid5. Perifere zenuwfibroblasten scheiden tenascin-C-eiwit af en verbeteren de migratie van SC's tijdens zenuwregeneratie via β1-integrin signaleringsroute7. Echter, de SCs en fibroblasten gebruikt in de bovenstaande studies werden afgeleid van de heupzenuw, die zowel sensorische en motorische zenuwen omvat.
In het perifere zenuwstelsel voeren de sensorische zenuwen (afferente zenuwen) zintuiglijke signalering uit van de receptoren naar het centrale zenuwstelsel (CNS), terwijl de motorische zenuwen (efferent zenuwen) signalen van het CNS naar de spieren geleiden. Eerdere studies hebben aangetoond dat SCs duidelijke motorische en zintuiglijke fenotypes uitdrukken en neurotrofe factoren afscheiden ter ondersteuning van perifere zenuwregeneratie8,9. Volgens een recente studie, fibroblasten ook uitdrukken verschillende motorische en zintuiglijke fenotypes en invloed op de migratie van SCs10. Zo stelt de verkenning van verschillen tussen motorische en sensorische zenuwfibroblasten/SC's ons in staat om de ingewikkelde onderliggende moleculaire mechanismen van perifere zenuwspecifieke regeneratie te bestuderen.
Op dit moment zijn er vele manieren om SCs en fibroblasten te zuiveren, waaronder de toepassing van antimitotische agentia, antilichaamgemedieerde cytolyse11,12, sequentiële immunopanning13 en laminine substratum14. Echter, alle bovenstaande methoden verwijderen fibroblasten en het behoud van alleen de SCs. Zeer gezuiverde SCs en fibroblasten kunnen worden verkregen door flow cytometrie sorteertechnologie15, maar het is een tijdrovende en kostbare techniek. Vandaar, in deze studie, een eenvoudige differentiële spijsvertering en differentiële therapietrouw methode voor het zuiveren en isoleren van zintuiglijke en motorische zenuwfibroblasten en SCs werd ontwikkeld om een groot aantal fibroblasten en SCs sneller te verkrijgen.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
Deze studie werd uitgevoerd in overeenstemming met de Institutional Animal Care Guidelines van de Nantong University. Alle procedures inclusief de dierlijke proefpersonen werden ethisch goedgekeurd door het Administration Committee of Experimental Animals, de provincie Jiangsu, China.
1. Isolatie en cultuur van motorische en zintuiglijke zenuwfibroblasten en SC's
- Gebruik zeven dagen oude Sprague-Dawley (SD) ratten (n=4) geleverd door het Experimental Animal Center van de Nantong Universiteit van China. Plaats de ratten in een tank met 5% isoflurane gedurende 2-3 minuten, laat de dieren langzaam ademen en hebben geen onafhankelijke activiteit, en vervolgens ontsmetten met behulp van 75% ethanol voorafgaand aan onthoofding.
- Gebruik een schaar om de rughuid ongeveer 3 cm te snijden en de wervelkolom te verwijderen. Open het wervelkanaal voorzichtig om het ruggenmerg bloot te leggen.
- Behoud het ruggenmerg in een petrischaaltje van 60 mm met 2-3 mL van ijskoude D-Hanks' evenwichtige zoutoplossing (HBSS).
- Op basis van de anatomische structuur, accijns op de ventrale wortel (motorische zenuw) en vervolgens de rugwortel (sensorische zenuw) onder een ontledende microscoop. Plaats ze vervolgens in een ijskoude D-Hanks' gebalanceerde zoutoplossing (HBSS).
- Na het verwijderen van de HBSS snijd u de zenuwen met een schaar in stukken van 3-5 mm en verteerbaar met 1 mL van 0,25% (w/v) trypsine bij 37 °C gedurende 18-20 min. Vul vervolgens aan met 3-4 mL DMEM met 10% foetaal runderserum (FBS) om de spijsvertering te stoppen.
- Pipette het mengsel op en neer zachtjes ongeveer 10 keer en centrifugeren op 800 x g gedurende 5 min. Daarna, gooi de supernatant en schort het neerslag in 2-3 mL van DMEM aangevuld met 10% FBS.
- Filter de celsuspensie met een 400 mesh filter en inent de cellen in 60 mm Petrischaal en cultuur bij 37 °C in aanwezigheid van 5% CO2. Na 4-5 dagen van het kweken, isoleren van de passage 0 (p0) fibroblasten en SCs na het bereiken van 90% samenvloeiing.
- Isolatie en cultuur van SC's (Figuur 1)
- Was de cellen eenmaal met behulp van 1x PBS. Voeg 1 mL van 0,25% (w/v) trypsine (37 °C) per 60 mm petrischaal toe om de cellen 8-10 s bij kamertemperatuur te verteren. Voeg daarna 3 mL DMEM toe aangevuld met 10% FBS om de spijsvertering te stoppen.
- Blaas het mengsel voorzichtig op om de SC's los te maken met een pipet. Verzamel en centrifuge de SCs op 800 x g gedurende 5 minuten.
- Gooi het supernatant weg en schort het neerslag op in 3 mL DMEM met 10% FBS, 1% penicilline/streptomycine, 2 μM forskolin en 10 ng/mL HRG, en inent de cellen vervolgens in ongecoate 60 mm Petri schotel. Na het kweken bij 37 °C gedurende 30-45 min, de fibroblasten (een paar aantal fibroblasten worden verteerd met SCs) hechten aan de onderkant van de schotel.
- Breng de supernatant (inclusief de SK's) gedurende 2 dagen over naar een ander poly-L-lysine (PLL)-gecoate medium schotel en cultuur bij 37 °C.
- Isolatie en cultuur van fibroblasten (Figuur 1)
- Na het verwijderen van de SCs (zoals aangegeven in stap 1.8), was de resterende fibroblasten in de gerechten met 1x PBS en voeg vervolgens 1 mL van 0,25% (w/v) trypsine toe om de fibroblasten gedurende 2 minuten bij 37 °C te verteren.
- Voeg DMEM toe aangevuld met 10% FBS om de spijsvertering te beëindigen. Blaas de fibroblasten met behulp van een pipet, en vervolgens verzamelen en centrifugeren ze op 800 x g gedurende 5 min.
- Gooi het supernatant weg, hang het neerslag op met 2 mL DMEM met 10% FBS en inent de cellen in ongecoate petrischaal. De fibroblasten na het kweken gedurende 30-45 min bij 37 °C hechten aan de bodem van de schotel. Gooi de supernatant (inclusief een paar nummers van SCs). Voeg vervolgens 3 mL DMEM aangevuld met 10% FBS toe aan het fibroblastenschotel en cultuur bij 37 °C gedurende 2 dagen.
- Doorsnee de p1-cellen tot ze 90% samenvloeiing hebben bereikt. Zuiver ze vervolgens door differentiële spijsvertering en differentiële hechting weer zoals beschreven in de punten 1.8 en 1.9.
- Verteren de p2 fibroblasten en SCs na het kweken voor 2 dagen, en vervolgens het verzamelen van de cellen, tellen en inenten in 1 x 105 nummers / goed op PLL-gecoate dia's voor immunocytochemie (ICC).
2. ICC voor de identificatie van de celzuiverheid
- Kweek de cellen voor 24 uur bij 37 °C en voer ICC-vlekken uit na differentiële spijsvertering en differentiële hechting van motorische en zintuiglijke fibroblasten en SC's.
- Was de motor en sensorische fibroblasten en SC's met 1x PBS en bevestig ze in 200 μL/well van 4% paraformaldehyde (pH 7.4) gedurende 18 minuten bij kamertemperatuur.
- Blokkeer de monster-SC's met blokkeringsbuffer (0,1% Triton X-100 in 0,01 M PBS met 5% geitenserum) en blokkeer het monster fibroblasten met blokkeerbuffer (0,01 M PBS met 5% geitenserum) gedurende 45 min bij 37 °C na het wassen met PBS driemaal.
- Verwijder de blokkeringsbuffer en broed in met de volgende primaire antilichamen: muismonoklonal anti-CD90-antilichaam (een specifieke marker voor fibroblasten) (1:1000) voor fibroblasten en muisanti-S100-antilichaam (een specifieke marker voor SCs) (1:400) voor SCs bij 4 °C 's nachts.
- Gooi de primaire antilichamen weg, was driemaal met PBS en broed met de volgende secundaire antilichamen: Alexa Fluor 594 goat anti-mouse IgG (1:400) voor fibroblasten en 488-geconjugeerde geitenantimuis IgG (1:400) voor SCs bij kamertemperatuur gedurende 1,5 uur.
- Was de monsters driemaal met PBS en bevlek de kernen met 5 μg/mL Hoechst 33342 kleurstof gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur. Was het monster met 1x PBS driemaal en monteer ze met behulp van het montagemedium (20 μL/slide) op de glazen schuif.
- Neem de cel foto's door confocale laser scanning microscoop in drie willekeurige velden voor elke put. Evalueer het totale aantal kernen en CD90-positieve cellen, S100-positieve cellen en bereken vervolgens het percentage cd90-positieve cellen en S100-positieve cellen. Voer de kleuring in drievoud.
3. Flow cytometrieanalyse (FCA) voor identificatie van celzuiverheid
- Evalueer de zuiverheid van motorische en sensorische fibroblasten en SC's zoals eerder beschreven door FCA16. Vertuur kort de p2-motor en sensorische fibroblasten en SC's met 0,25% (w/v) trypsine, resuspend de celpellets en incuberen ze in fixatiemedium bij kamertemperatuur gedurende 15 min.
- Incubeer de cellen met permeabilisatiemedium en sonde met muismonoklollen anti-CD90-antilichaam (0,1 μg/106 cellen, 200 μL) voor fibroblasten en muisanti-S100-antilichaam (respectievelijk 1:400, 200 μL) voor SCs bij kamertemperatuur gedurende 30 minuten.
- Incubeer de cellen met 488-geconjugeerde geit anti-muis IgG voor 30 min. Gebruik FACS kaliber om flow cytometrie uit te voeren, en analyseren van de gegevens met behulp van Cell Quest software.
- Incubeer de cellen alleen met 488-geconjugeerde geit anti-muis IgG (fibroblasgroep) en muis IgG1 kappa [MOPC-21] (FITC) - Isotype controle (SCs groep), die dient als negatieve controle.
4. Statistische analyse
- Presenteer alle gegevens als middel ± SEM. Beoordeel statistische verschillen in de gegevens door middel van ongepaarde t-testmet behulp van GraphPad Prism 6.0. Stel statistische significantie in op p<0,05. Voer alle tests in drievoud uit.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Lichte microscopische observatie
De SCs en fibroblasten zijn de twee belangrijkste celpopulaties verkregen in de primaire celkweek uit zenuwweefsels. Na inenting voor 1 uur, de meeste van de cellen gehecht aan de onderkant van de schotel, en de celmorfologie veranderd van rond naar ovaal. Na 24 uur kweken vertoonden de SCs een bipolaire of tripolaire morfologie en de lengte daarvan varieerde van 100 tot 200 μm. Na 48 uur traden aggregatie en proliferatie van cellen op,...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
De twee belangrijkste celpopulaties van perifere zenuwen opgenomen SCs en fibroblasten. De voornamelijk gekweekte fibroblasten en SCs kunnen nauwkeurig helpen bij het modelleren van de fysiologie van fibroblasten en SCs tijdens perifere zenuwontwikkeling en regeneratie. De studie toonde aan dat P7 rattensciatische zenuwcellen ongeveer 85% van de S100-positieve SC's, 13% van de OX7-positieve fibroblasten en slechts 1,5% van de OX42-positieve macrofagen13bevatten. Hoewel het aantal fibroblasten lage...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs hebben niets te onthullen.
Dankbetuigingen
Deze studie werd ondersteund door het National Key Research and Development Program of China (Grant No. 2017YFA0104703), de National Natural Foundation of China (Grant No. 31500927).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| Alexa Fluor 594 Goat Anti-Mouse IgG(H+L) | Life Technologies | A11005 | Verdunning: 1:400 |
| CoraLite488-geconjugeerd Affinipure Goat Anti-Mouse IgG(H+L) | Proteintech | SA00013-1 | Verdunning: 1:400 |
| Confocal laser scanning microscope | Leica Microsystems | TCS SP5 | |
| Cell Quest software | Becton Dickinson Biosciences | ||
| D-Hank's balanced zout oplossing | Gibco | 14170112 | |
| DMEM | Corning | 10-013-CV | |
| Dissectiemicroscoop | Olympus | SZ2-ILST | |
| Foetaal bovien serum (FBS) | Gibco | 10099-141C | |
| Forskolin | Sigma | F6886-10MG | |
| Fluoroshield Mounting Medium | Abcam | ab104135 | |
| Fixatiemedium/Permeabilisatiemedium | Multi Sciences (LIANKE) Biotech, Co., LTD | GAS005 | |
| Flow cytometry | Becton Dickinson Biosciences | FACS Calibur | |
| Muis IgG1 kappa [MOPC-21] (FITC) - Isotype Control | Abcam | ab106163 | Verdunning: 1:400 |
| Muis monoklonaal anti-CD90 antilichaam | Abcam | ab225 | Verdunning: 1:1000 voor ICC, 0,1 µg voor 106 cellen voor Flow Cyt |
| Muis anti-S100 antilichaam | Abcam | ab212816 | Verdunning: 1:400 |
| Polylysine (PLL) | Sigma | P4832 | |
| Recombinant Human NRG1-beta 1/HRG1-beta 1 EGF Domein Eiwit | R&D Systems | 396-HB-050 | |
| 0,25% (w/v) trypsine | Gibco | 25200-072 |
Referenties
- Stierli, S., et al. The regulation of the homeostasis and regeneration of peripheral nerve is distinct from the CNS and independent of a stem cell population. Development (The Company of Biologists). , (2018).
- Schubert, T., Friede, R. L. The role of endoneurial fibroblasts in myelin degradation. Journal of Neuropathology and Experimental Neurology. 40 (2), 134-154 (1981).
- Dreesmann, L., Mittnacht, U., Lietz, M., Schlosshauer, B. Nerve fibroblast impact on Schwann cell behavior. European Journal of Cell Biology. 88 (5), 285-300 (2009).
- Lavdas, A. A., et al. Schwann cells engineered to express the cell adhesion molecule L1 accelerate myelination and motor recovery after spinal cord injury. Experimental Neurology. 221 (1), 206-216 (2010).
- Parrinello, S., et al. EphB signaling directs peripheral nerve regeneration through Sox2-dependent Schwann cell sorting. Cell. 143 (1), 145-155 (2010).
- Benito, C., Davis, C. M., Gomez-Sanchez, J. A. STAT3 Controls the Long-Term Survival and Phenotype of Repair Schwann Cells during Nerve Regeneration. Journal of Neuroscience Research. 37 (16), 4255-4269 (2017).
- Zhang, Z. J., Jiang, B. C., Gao, Y. J. Chemokines in neuron-glial cell interaction and pathogenesis of neuropathic pain. Cellular and Molecular Life Sciences. 74 (18), 3275-3291 (2017).
- Hoke, A., et al. Schwann cells express motor and sensory phenotypes that regulate axon regeneration. Journal of Neuroscience. 26 (38), 9646-9655 (2006).
- Brushart, T. M., et al. Schwann cell phenotype is regulated by axon modality and central-peripheral location, and persists in vitro. Experiment Neurology. 247, 272-281 (2013).
- He, Q., et al. Differential Gene Expression in Primary Cultured Sensory and Motor Nerve Fibroblasts. Frontiers in Neuroscience. 12, 1016(2018).
- Weinstein, D. E., Wu, R. Chapter 3, Unit 17: Isolation and purification of primary Schwann cells. Current Protocols in Neuroscience. , (2001).
- Palomo Irigoyen, M., et al. Isolation and Purification of Primary Rodent Schwann Cells. Methods in Molecular Biology. 1791, 81-93 (2018).
- Cheng, L., Khan, M., Mudge, A. W. Calcitonin gene-related peptide promotes Schwann cell proliferation. Journal of Cell Biology. 129 (3), 789-796 (1995).
- Pannunzio, M. E., et al. A new method of selecting Schwann cells from adult mouse sciatic nerve. Journal of Neuroscience Methods. 149 (1), 74-81 (2005).
- Shen, M., Tang, W., Cao, Z., Cao, X., Ding, F. Isolation of rat Schwann cells based on cell sorting. Molecular Medicine Reports. 16 (2), 1747-1752 (2017).
- He, Q., Man, L., Ji, Y., Ding, F. Comparison in the biological characteristics between primary cultured sensory and motor Schwann cells. Neuroscience Letters. 521 (1), 57-61 (2012).
- Weiss, T., et al. Proteomics and transcriptomics of peripheral nerve tissue and cells unravel new aspects of the human Schwann cell repair phenotype. Glia. 64 (12), 2133-2153 (2016).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
