Aanpasbare schuine stereotactische benadering voor veelzijdige neurowetenschappelijke technieken

Samenvatting

Hier wordt een stereotactische procedure beschreven die zich kan richten op uitdagende en moeilijk bereikbare hersengebieden (vanwege ruimtelijke beperkingen) met behulp van een schuine coronale benadering. Dit protocol is aanpasbaar aan zowel muis- als rattenmodellen en kan worden toegepast op diverse neurowetenschappelijke toepassingen, waaronder canule-implantatie en micro-injecties van virale constructies.

Samenvatting

Stereotactische chirurgie is een essentieel hulpmiddel in het moderne neurowetenschappelijke laboratorium. Het vermogen om moeilijk bereikbare hersengebieden nauwkeurig en nauwkeurig te targeten, vormt echter nog steeds een uitdaging, vooral bij het richten op hersenstructuren langs de middellijn. Deze uitdagingen omvatten het vermijden van de superieure sagittale sinus en de derde ventrikel en het vermogen om zich consequent te richten op selectieve en discrete hersenkernen. Bovendien vertrouwen meer geavanceerde neurowetenschappelijke technieken (bijv. Optogenetica, vezelfotometrie en beeldvorming met twee fotonen) op gerichte implantatie van belangrijke hardware in de hersenen, en ruimtelijke beperkingen zijn een veel voorkomende belemmering. Hier wordt een aanpasbaar protocol gepresenteerd voor stereotactische targeting van hersenstructuren van knaagdieren met behulp van een schuine coronale benadering. Het kan worden aangepast aan 1) muis- of rattenmodellen, 2) verschillende neurowetenschappelijke technieken en 3) meerdere hersengebieden. Als representatief voorbeeld omvat het de berekening van stereotactische coördinaten voor het richten van de hypothalamische ventromediale kern (VMN) van de muis voor een optogenetisch remmingsexperiment. Deze procedure begint met de bilaterale micro-injectie van een adeno-geassocieerd virus (AAV) dat codeert voor een lichtgevoelig chloridekanaal (SwiChR++) naar een Cre-afhankelijk muismodel, gevolgd door de schuine bilaterale implantatie van fiberoptische canules. Met behulp van deze benadering tonen de bevindingen aan dat activering van een subset van VMN-neuronen nodig is voor intacte glucose-contraregulerende reacties op insuline-geïnduceerde hypoglykemie.

Inleiding

Neurale controle van gedrag, voeding en metabolisme omvat coördinatie van zeer complexe, integratieve en redundante neurocircuits. Een drijvend doel van het neurowetenschappelijke veld is om de relatie tussen neuronale circuitstructuur en functie te ontleden. Hoewel klassieke neurowetenschappelijke hulpmiddelen (d.w.z. laesies, lokale farmacologische injecties en elektrische stimulatie) vitale kennis hebben blootgelegd over de rol van specifieke hersengebieden die gedrag en metabolisme regelen, worden deze hulpmiddelen beperkt door hun gebrek aan specificiteit en omkeerbaarheid¹.

Recente ontwikkelingen op het gebied van neurowetenschappen hebben het vermogen om de circuitfunctie te ondervragen en te manipuleren op een celtypespecifieke manier met een hoge spatiotemporale resolutie aanzienlijk verbeterd. Optogenetische^2- en chemogenetische^{3-benaderingen} maken bijvoorbeeld de snelle en omkeerbare manipulatie van activiteit in genetisch gedefinieerde celtypen van vrij bewegende dieren mogelijk. Optogenetica omvat het gebruik van lichtgevoelige ionkanalen, channelrhodopsinen genoemd, om neuronale activiteit te beheersen. De sleutel tot deze techniek is de genafgifte van channelrhodopsine en een lichtbron om de opsine te activeren. Een veel voorkomende strategie voor genafgifte is door een combinatie van 1) genetisch gemanipuleerde muizen die Cre-recombinase tot expressie brengen in discrete neuronen, en 2) Cre-afhankelijke virale vectoren die coderen voor channelrhodopsine.

Hoewel optogenetica een elegant, zeer nauwkeurig middel biedt om neuronale activiteit te beheersen, is de methode afhankelijk van succesvolle stereotactische micro-injectie van de virale vector en fiberoptische plaatsing in een gedefinieerd hersengebied. Hoewel stereotactische procedures gemeengoed zijn binnen het moderne neurowetenschappelijke laboratorium (en er zijn verschillende uitstekende protocollen die deze procedure beschrijven)^4,5,6, in staat zijn om consequent en reproduceerbaar discrete hersengebieden langs de middellijn te richten (d.w.z. de middelmatige hypothalamus, een hersengebied dat cruciaal is voor de regulatie van homeostatische functies⁷) biedt extra uitdagingen. Deze uitdagingen omvatten het vermijden van de superieure sagittale sinus, derde ventrikel en aangrenzende hypothalamische kernen. Bovendien zijn er aanzienlijke ruimtelijke beperkingen aan de bilaterale implantatie van hardware die nodig is voor remmingsstudies. Met deze uitdagingen in gedachten presenteert dit protocol hierin een aanpasbare procedure voor het richten op discrete hersengebieden via een schuine stereotactische benadering.

Protocol

Alle procedures werden goedgekeurd in overeenstemming met de National Institutes of Health, de Guide for the Care and Use of Animals en werden goedgekeurd door zowel de Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) als Environmental Health and Safety aan de Universiteit van Washington.

1. Berekening van schuine coördinaten

1. Markeer met behulp van een coronale hersenatlas een rechterdriehoek zodat de hypotenusa door het doelgebied van belang gaat. In het representatieve voorbeeld (figuur 1) wordt de hypothalamische ventromediale kern (VMN) in een hoek van 15° van de coronale middellijn gericht.
   OPMERKING: De plaatsing van de rotatieas afgebeeld in figuur 1 (en dus de lengte van kant C) is willekeurig en kan worden gewijzigd om elk hersengebied te targeten. Hoewel dit contra-intuïtief lijkt, zullen latere stappen in het protocol de positie van de kop in de z-as zodanig aanpassen dat dit punt uitlijnt met het stereotactische rotatiecentrum (zie rubriek 6). Het wordt echter aanbevolen om een coronale rotatiehoek van 15 ° niet te overschrijden vanwege fysieke beperkingen van het hoofdhouderapparaat.
2. Bepaal de gewenste hoek (a) en geschatte lengte van kant B en gebruik trigonometrie om de lengte van zijden A en C te berekenen. Deze stap is belangrijk voor het goed positioneren van het hoofd tijdens het draaien.
   OPMERKING: In het voorbeeld in figuur 1worden atlasrasterlijnen gebruikt om de lengte van zijde B te benaderen, wat een lengte van 7,576 mm oplevert. Deze informatie wordt gebruikt om de lengte van kant A te berekenen:
   
   In dit voorbeeld geeft 2,03 mm de R/L-afstand aan van de middellijn waarop de fiberoptische canule de hersenen binnenkomt wanneer het hoofd 15° wordt gedraaid.
   1. Bereken eventueel de lengte van kant C om de D/V-coördinaat te benaderen:
      
      OPMERKING: 1) De lengte van de hypotenusa (C) vertegenwoordigt niet de diepte van de injectie, maar zal nuttig zijn bij het bepalen van de D / V-coördinaat, die mogelijk moet worden aangepast aan de toegenomen lengte versus zijde B voor straight-in injecties. Het wordt daarom aanbevolen om testinjecties uit te voeren om de D/V-coördinaat te optimaliseren. 2) In dit voorbeeld gericht op het VMN worden twee sets coördinaten verkregen: één voor de micro-injectie die niet-schuin is (A/P = -1,4, R/L = 0,4 bij 0°, D/V = -5,7) en één voor de schuine fiberoptische implantatie (A/P = -1,4, R/L = 0,0 bij 15°, D/V = -5,4).

2. Voorbereiding van de stereotaks voor een schuine procedure

1. Controleer of het stereotactische frame en de micromanipulator zijn gekalibreerd (zie de Kopf-handleiding voor het volledige protocol).
2. Plaats de middelste hoogtemeter in de fitting van de basisplaat van de hoofdhouder.
3. Bevestig de centreerbare scope in de gereedschapshouder en kijk vervolgens naar de scope. Pas de positie van de micromanipulator aan totdat het vizier is uitgelijnd en gericht op het meetkruis.
   OPMERKING: Tijdens deze stap wordt de scoop in het brandpuntsvlak van het rotatiecentrum van de hoofdhouder geplaatst. Eenmaal vastgesteld, mag de micromanipulator niet worden verplaatst tijdens de resterende stappen.
4. Plaats de oorstaven in de houders en centreer ze zodanig dat de indicatorlijnen aan beide zijden op 0 staan(figuur 3A).
5. Gebruik de mediaal-laterale en voorste-achterste knoppen op de hoofdhouder(figuur 2)om de oorstaven in het x- en y-vlak boven de dwarshaar van de middelste hoogtemeter uit te lijnen(figuur 3A).
6. Als u de positie van de oorstang in de z-as wilt uitlijnen, verwijdert u de oorstaven uit de houder en verwijdert u de middelste hoogtemeter. Plaats de oorstaven terug en centreer ze opnieuw op 0.
7. Kijk naar beneden in de scope. Gebruik respectievelijk de verticale pookknop(figuur 3B)en de coronale kantelknop om de oorbalken te laten zakken en draaien totdat het vizier van de scoop tijdens de coronale rotatie gecentreerd blijft tussen de oorbalken.
8. De stereotaks is nu gekalibreerd en klaar. Breng geen verdere aanpassingen aan in de positie van de hoofdhouder.

3. Voorbereiding van materialen voor injectie/implantatie

1. Zorg ervoor dat alle instrumenten, chirurgische hulpmiddelen en materialen worden gesteriliseerd en in een steriel chirurgisch veld naast de stereotaks worden geplaatst.
2. Behandel en bewaar virale constructies volgens hun bioveiligheidsniveau en relevante wettelijke vereisten voor institutionele bioveiligheid.
3. Trek het virus op in de spuit en zorg ervoor dat u de juiste hanteringspraktijken en persoonlijke beschermingsmiddelen gebruikt.

4. Anesthesie

1. Noteer het lichaamsgewicht van de muis voorafgaand aan de operatie.
2. Verdoof de muis diep met isofluraan.
3. Zorg ervoor dat de muis diep verdoofd is door een teenknijptest uit te voeren totdat de flinching-reactie afwezig is. Als het dier sterke reflexen blijft vertonen, verhoog dan de concentratie en / of duur van de anesthesie.
4. Breng oogzalf aan op elk oog om ze vochtig te houden tijdens de operatie.
5. Scheer de hoofdhuid van net achter de oren tot net achter de ogen met een tondeuse.
6. Voorzag de muis van een IACUC-goedgekeurd analgeticum.
7. Houd het dier tijdens de chirurgische ingreep voortdurend in de gaten en bied thermische ondersteuning.

5. Chirurgische ingreep

1. Plaats de kop in de kophouder door de bovenste snijtanden in de opening in de bijtbalk te plaatsen en zorg ervoor dat de tong onder de bijtbalk zit.
2. Bevestig het hoofd in de oorbalken door de oorstaven voorzichtig in de externe auditieve meatus te steken, zodat de oorstaven symmetrisch zijn geplaatst (meestal tussen drie en vier voor een volwassen muis). Deze stap is van cruciaal belang om ervoor te zorgen dat het hoofd stabiel en gecentreerd is voor rotatie.
3. Bereid het geschoren incisiegebied aseptisch voor met drie afwisselende scrubs van betadine en alcoholdoekjes, of met een alternatieve institutioneel goedgekeurde voorbereiding op de operatieplaats.
4. Plaats een chirurgisch gordijn over het dier om een steriel chirurgisch veld te behouden en het risico op postoperatieve infectie te verminderen.
5. Leg de schedel bloot door een incisie te maken langs de sagittale middellijn van de hoofdhuid. Schraap voorzichtig het oppervlak van de schedel om eventuele fascia te verwijderen en de hechtingen bloot te leggen.
   OPMERKING: Als hechtlijnen moeilijk te visualiseren zijn, kan waterstofperoxide op de schedel worden aangebracht met behulp van een steriele applicator met katoenen punt om de hechtingsvisualisatie te verbeteren.
6. Plaats de centreerkijker in de houder en centreer het vizier op bregma(figuur 4,linkerpaneel). Nul de micromanipulator.
7. Beweeg het vizier caudaal naar lambda en noteer de bregma-lambda (B-L) afstand.
   OPMERKING: Als de hechtlijnen geen rechte lijn langs de middellijn volgen, wordt aanbevolen om de middellijn vast te stellen met behulp van de "lijn van de beste pasvorm" door zowel bregma als lambda. Als de bovenstaande stappen echter worden gevolgd, moet de eerste plaatsing van het scope-reticle halverwege tussen de oorbalken liggen en de B-L-middenlijnnaad naderen.
8. Als de B-L-afstand aanzienlijk kleiner of groter is dan 4,21 mm, past u de toegewezen bregma stapsgewijs aan om een B-L-afstand van 4,21 mm ± 0,2 mm te verkrijgen.
9. Vervang het centreerbereik door de uitlijningsindicator. Plaats de sondes op lambda en bregma en stel de dorsale kantelknop op de hoofdhouder in op het vlakke in het sagittale vlak (neus omhoog of omlaag gericht) en gebruik vervolgens de centreerbare scope om bregma opnieuw toe te wijzen.
10. Gebruik de uitlijningsindicator om het waterpas te zetten in het coronale vlak met behulp van de coronale kantelknop. Meet op meerdere punten in de rostrale / caudale as om rekening te houden met oppervlaktevervormingen in de schedel.
11. Let op de positie op de draaiknop van de coronale kantelknop, aangezien dit de rotatiepositie van 0° is.

6. Uitlijnen van de centrale rotatieassen voor schuine coördinaten

1. Bevestig de centreerkijker in de gereedschapshouder en plaats de micromanipulator op de berekende coördinaat uit sectie 1. Merk op dat de R/L-coördinaat voor de schuine implantatie overeenkomt met de lengte van zijde A.
   1. In het voorbeeld in figuur 1zijn de schuine coördinaten voor fiberoptische plaatsing gericht op het VMN (A/P = -1,4, R/L = [2,03] bij 0° coronale rotatie, [0,00] bij 15° coronale rotatie, D/V = -5,4).
2. De scope waarnemen en deze coördinaat markeren (R/L 2,03 mm vanaf de middellijn volgens het VMN-voorbeeld; Figuur 4, middenpaneel). Dit merkteken vertegenwoordigt het punt waarop de canule de hersenen binnenkomt zodra het hoofd is gedraaid.
3. Verplaats de micromanipulator over de middellijn (R/L = 0,00). Gebruik de coronale kantelknop om de kop te draaien naar de hoek die is berekend in sectie 1.
   1. Als het vizier al in lijn is met het merkteken, gaat u verder met sectie 7.
   2. Als het vizier niet in lijn is met het referentiemerk, past u de positie van de kop in de z-as aan met behulp van de verticale pookknop (figuur 2) totdat het vizier zo dicht mogelijk bij het merkteken staat.
4. Draai het hoofd terug naar de 0° coronale positie. Als de verticale verschuiving is aangepast in stap 6.3, wijs bregma opnieuw toe met behulp van het centreerbereik.
5. Herhaal stap 6.3 en 6.4 totdat het vizier consequent het referentiemerk raakt wanneer de kop wordt gedraaid(figuur 4C).
6. Op dit punt moet het willekeurige rotatiepunt dat in sectie 1 is vastgesteld, nu worden uitgelijnd met het stereotactische rotatiecentrum.

7. Micro-injectie

1. Plaats de stereotactische boor in de houder en manoeuvreer de micromanipulator naar de eerste injectiecoördinaat.
   1. Volgens het voorbeeld voor het richten van het VMN, boor op A / P = -1,4 en R / L = 0,4 terwijl de kop waterpas is.
2. Laat de boor zakken totdat het bit net boven de schedel ligt. Zet de boor aan en laat voorzichtig zakken totdat het bit net door de schedel is geboord (niet de dura).
3. Herhaal dit voor de contralaterale injectieplaats.
4. Gebruik een steriele naalddriver om een 90° buiging in een naald van 27-30 G te brengen (bijvoorbeeld van een steriele insulinespuit van 0,5 ml) en gebruik de gebogen naald om voorzichtig door de dura mater te prikken.
5. OPMERKING: Als er een bloeding optreedt, oefen dan druk uit met een steriele applicator met katoenen punt en reinig met steriel water totdat het bloeden is gestopt.
6. Wanneer u klaar bent om te injecteren, plaatst u voorzichtig een gevulde Hamilton-spuit in de stereotactische houder.
   OPMERKING: De coördinaten op de micromanipulator zijn niet meer van toepassing na het overschakelen naar een nieuw gereedschap. Gebruik het midden van het braamgat als het nieuwe doel voor injectie.
7. Plaats de naald voorzichtig boven het braamgat.
8. Laat de naald zakken totdat deze de dura in het midden van het braamgat iets raakt. KRITIEK: Nul de micromanipulator alleen in de z-as, zodat de coördinaten op de micromanipulator voor de stereotactische centreerafstand en boor worden gehandhaafd.
9. Laat de naald langzaam in de hersenen zakken en let er goed op dat de naald niet afbuigt aan de rand van het braamgat. Blijf zakken tot 0,05 mm ventraal naar de D/V-injectiecoördinaat en wacht 1 minuut. Deze extra stap creëert een kleine "zak" om virale terugstroom bij het verwijderen van naalden te minimaliseren.
10. Til de naald langzaam op naar de D/V-coördinaat en start de injectie.
    OPMERKING: De stroomsnelheid en het volume variëren afhankelijk van de doelregio en het experimentele ontwerp. Voor optogenetische uitschakeling van VMN-neuronen is voldoende dekking gewenst, zodat 200 nL virus wordt geïnjecteerd met een snelheid van 1 nL / s.
11. Wacht na de micro-injectie 10 minuten op de injectieplaats om de efflux van het virus tijdens het stoppen te minimaliseren.
12. Trek de micropipette langzaam terug uit de hersenen met een snelheid van ongeveer 1 mm / min.
13. Zodra de naald vrij is van de schedel, werpt u een klein volume virus uit om ervoor te zorgen dat de naald niet verstopt is met bloed of weefsel. Gebruik een steriele applicator met katoenen punt om het virus te verwijderen voordat u doorgaat.
14. Herhaal stap 7.6–7.12 voor de contralaterale zijde.
15. Sluit de micro-injectiebramen af met botwas om de genezing te verbeteren(figuur 5B).

8. Fiberoptische implantatie

OPMERKING: Na virale injectie worden bilaterale fiberoptische canules geïmplanteerd onder de berekende hoek per sectie 1. Merk op dat deze coördinaten al op de schedel van sectie 6 moeten worden gemarkeerd.

1. Herhaal stap 7.1 –7.4 voor de schuine coördinaten.
2. Breng de kop terug naar de niveau 0° positie.
3. Gebruik vervolgens de handboor om vier extra gaten voor de botschroeven te produceren: twee moeten vooraan en twee achteraan worden geplaatst(figuur 5A). Deze zullen dienen als ankers om de fiberoptica aan de schedel te bevestigen(figuur 5D).
   OPMERKING: Zorg ervoor dat u de gaten ver genoeg van de schuine coördinaatbraaggaten plaatst om het ferrulegedeelte van de fiberoptische die boven de schedel zit, te huisvesten.
4. Gebruik zo voorzichtig mogelijk de kleine platte schroevendraaier om de botschroeven zo in te stellen dat ze stevig in de schedel zitten, maar niet in de hersenen doordringen.
5. Klem een fiberoptische canule in de canulehouder en plaats deze in de stereotactische houder.
6. Draai de kop naar de berekende hoek en maak nogmaals op dat de coördinaten op de micromanipulator niet van toepassing zijn op het nieuwe gereedschap. Gebruik het midden van de schuine braamgaten als implantatiedoel.
7. Laat de fiberoptische totdat deze net de dura in het midden van het braamgat raakt(figuur 5C). Zet de micromanipulator op nul in de z-as en vertraag vervolgens langzaam de fiberoptische naar de D/V-gehoekte coördinaat (-5,4 volgens het VMN-voorbeeld).
8. Gebruik cyanoacrylaatgel om de fiberoptische ferrule aan te sluiten op de ipsilaterale ankerschroeven en breng vervolgens een versnellingsmiddel aan met een micropipettepunt(figuur 5D).
9. Zodra de cyanoacrylaatgel volledig is uitgehard, maakt u de canulehouder voorzichtig los en tilt u op totdat u vrij bent van de fiberoptische ferrule.
10. Herhaal stap 8,5-8,9 voor de contralaterale schuine coördinaat en maak de kop waterpas. Maak voor extra veiligheid een extra verbinding tussen de twee schuine fiberoptische canules met de cyanoacrylaatgel en accelerant(Figuur 5D).
11. Bereid een kleine, relatief dunne hoeveelheid tandcement voor. Breng aan op het oppervlak van de schedel en zorg ervoor dat u de ankerschroeven en de basis van de fiberoptische canules grondig bedekt. Laat voldoende van de ferrule schoon voor de volgende paring met de fiberoptische patchkabels.
12. Zodra het cement droog is, verwijdert u de muis uit het stereotactische apparaat.
13. Plaats de muis in een herstelkooi met thermische ondersteuning. Laat het herstellen en overbrengen naar de thuiskooi zodra het alert, mobiel en verzorging lijkt.

9. Postoperatieve zorg

1. Controleer dieren dagelijks gedurende 3 dagen postoperatief op gedrag, houding, activiteit en verzorging en houd een register bij van voedselinname en lichaamsgewicht.
2. Als dieren algemene indicatoren van pijn of een slechte gezondheid vertonen, raadpleeg dan dierenartsdiensten.
3. Geef muizen minstens 2 weken de tijd voor herstel en voor virale expressie voordat ze met gedragsstudies beginnen.

10. Optogenetica

1. Voor de uitvoering van optogenetische studies, zie Sidor et al.⁸.
2. Valideer virale expressie en vezelplaatsing aan het einde van studies.

Resultaten

Dit protocol beschrijft een chirurgische procedure voor het uitvoeren van optogenetische studies om de rol van hypothalamische VMN-neuronen in glycemische controle te ondervragen⁹. Het eerst werd gebruik gemaakt van een standaard (niet-schuine) stereotactische benadering voor de bilaterale micro-injectie van een remmend channelrhodopsinevirus naar het VMN. Hoewel een schuine benadering ook geschikt zou zijn, werd de standaard (niet-schuine) benadering gekozen omdat deze voldoende is om het herseng...

Discussie

Recente ontwikkelingen in de neurowetenschappen hebben geavanceerd inzicht en begrip in de activiteit en functie van hersenneurocircuits ondersteund. Dit omvat de toepassing van optogenetische en chemogenetische technologieën om discrete neuronale populaties en hun projectieplaatsen in vivo te activeren of tot zwijgen te brengen. Meer recent omvatte dit de ontwikkeling van genetisch gecodeerde calciumindicatoren (bijv. GCaMP, RCaMP) en andere fluorometrische biosensoren (bijv. Dopamine, noradrenaline) voor in vivo regist...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Fiberoptic Cannulae	Doric Lenzen	MFC_200/230-0.57_###_MF1.25_FLT	Aanpasbaar
Kopf Model 1900 Stereotaxic Uitlijningssysteem	Kopf	Model 1900
Kopf Model 1900-51 Center Hoogte Meter	Kopf	Model 1900-51
Kopf Model 1905 Uitlijning Indicator	Kopf	Model 1905
Kopf Model 1911 Stereotaxic Boor	Kopf	Model 1911
Kopf Model 1915 Centrerings Scope	Kopf	Model 1915
Kopf Model 1922 60-Graad Niet-Ruptuur Oor Beugels	Kopf	Model 1922
Kopf Model 1923-B Muis Gasanesthesie Hoofdhouder	Kopf	Model 1923-B
Kopf Model 1940 Micro Manipulator	Kopf	Model 1940
Micro4 Microinjectie Systeem	World Precision Instruments	--
Muis bot schroeven	Plastics One	00-96 X 1/16
Stereotaxic Cannula Houder, 1.25mm ferrule	Thor Labs	XCL
Chirurgische Boor	Cell Point Scientific	Ideal Micro Drill