Methodenartikel

Ballistische etikettering van piramidale neuronen in hersenschijfjes en in de primaire celcultuur

DOI:

10.3791/60989

⸱

2 april 2020

 ,  ,  , 
1Program in Behavioral Neuroscience, Department of Psychology, University of South Carolina

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

We presenteren een protocol voor het etiketteren en analyseren van piramidale neuronen, wat essentieel is voor het evalueren van potentiële morfologische veranderingen in neuronen en dendritische stekels die ten grondslag kunnen liggen aan neurochemische en gedragsafwijkingen.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Er is gemeld dat de grootte en vorm van dendritische stekels is gerelateerd aan hun structurele plasticiteit. Om de morfologische structuur van piramidale neuronen en dendritische stekels te identificeren, kan een ballistische etiketteringstechniek worden gebruikt. In het huidige protocol worden piramidale neuronen gelabeld met DilC18(3) kleurstof en geanalyseerd met behulp van neuronale reconstructie software om neuronale morfologie en dendritische stekels te beoordelen. Om neuronale structuur te onderzoeken, worden dendritische vertakkingsanalyse en Sholl-analyse uitgevoerd, waardoor onderzoekers conclusies kunnen trekken over respectievelijk dendritische vertakkingcomplexiteit en neuronale arbor-complexiteit. De evaluatie van dendritische stekels wordt uitgevoerd met behulp van een automatische ondersteunde classificatie algoritme integraal onderdeel van de reconstructie software, die stekels ingedeeld in vier categorieën (dat wil zeggen, dun, paddestoel, stompe, filopodia). Bovendien worden ook drie extra parameters (d.w.z. lengte, hoofddiameter en volume) gekozen om veranderingen in de dendritische wervelkolommorfologie te beoordelen. Om het potentieel van brede toepassing van de ballistische etiketteringstechniek te valideren, werden piramidale neuronen uit in vitro celkweek met succes gelabeld. Over het algemeen is de ballistische etiketteringsmethode uniek en nuttig voor het visualiseren van neuronen in verschillende hersengebieden bij ratten, die in combinatie met geavanceerde reconstructiesoftware onderzoekers in staat stelt om de mogelijke mechanismen die ten grondslag liggen te verduidelijken neurocognitieve disfunctie.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

In 2000, Gan et al. beschreven een snelle etikettering techniek voor individuele neuronen en glia in het zenuwstelsel dat verschillende lipofiele kleurstoffen gecombineerd, waardoor voor de gelijktijdige etikettering van vele hersencellen met verschillende kleuren1,2. Meer recent, een ballistische etikettering techniek werd beschreven door Seabold et al.3 dat fluorescerende kleurstoffen (Dil) geïntroduceerd in de neuronen van de hersenen plakjes. Een veelzijdige kleuring techniek, ballistische etikettering wordt gewaardeerd om zijn vermogen om te worden gebruikt in meerdere diersoorten en over een breed scala van leeftijden. Bovendien kan het worden gecombineerd met immunokleuring om subpopulaties van hersencellen te identificeren3. In vergelijking met traditionele technieken (bijvoorbeeld Golgi-Cox zilverimpregnatie, micro-injectie)4biedt ballistische etikettering een mogelijkheid om morfologische kenmerken duidelijker te onderscheiden, waaronder dendritische stekels, een functie die van cruciaal belang is voor het tekenen van conclusies over neuronale complexiteit en synaptische connectiviteit5.

Excitatory piramidale neuronen worden gekenmerkt door een enkele, grote apicale dendriet, meerdere kortere basale dendrieten, en duizenden dendritische stekels6. Piramidale neuronen worden gevonden in meerdere hersengebieden in verband met hogere orde cognitieve verwerking, met inbegrip van de prefrontale cortex (PFC) en hippocampus. In de PFC worden piramidale neuronen waargenomen in lagen II/III en laag V, waarbij elk unieke morfologie vertoont. In het bijzonder, piramidale neuronen in laag II/III van de PFC hebben een kortere apicale dendriet en minder vertakking dan piramidale neuronen in laag V6. Binnen de hippocampus bevinden zich piramidale neuronen in zowel de CA1- als de CA3-regio's, waarbij elk verschillende morfologieën wordt weergegeven. In het bijzonder vertonen piramidale neuronen in de CA1-regio een meer onderscheidend apicale dendriet, waarbij vertakkingen verder van het soma plaatsvinden, ten opzichte van de CA3-regio6.

Dendritische stekels op piramidale neuronen in zowel de PFC en hippocampus zijn de primaire plaats van excitatory synapsen7. Morfologische kenmerken van dendritische stekels, die klassiek zijn gekarakteriseerd in drie primaire categorieën (d.w.z. dun, stomp, of paddestoel8),zijn gerelateerd aan de grootte van de excitatory synaps9. Dunne stekels, gekenmerkt door een lange, dunne nek, kleine bolvormige hoofd, en kleinere postsynaptische dichtheden, zijn meer onstabiel en ontwikkelen zwakkere verbindingen. Echter, paddestoel stekels, die een grotere dendritische wervelkolom hoofd hebben, worden erkend voor het vormen van sterkere synaptische verbindingen, een effect als gevolg van hun grotere omvang. In scherp contrast, stompe stekels zijn verstoken van een wervelkolom nek, vertonen een ongeveer gelijke hoofd en nek volume verhouding8. Binnen de hippocampus kunnen ook vertakte stekels worden waargenomen, waarbij de wervelkolom meerdere hoofden heeft die uit dezelfde dendritische wervelkolom nek10komen. Daarom kunnen de morfologische veranderingen van dendritische stekels de functionaliteit en de structurele capaciteit weerspiegelen. Bovendien hebben studies aangetoond dat de grootte en vorm van dendritische stekels betrekking heeft op hun structurele plasticiteit, wat leidt tot het idee dat kleine stekels betrokken zijn bij leren en aandacht, terwijl grotere, stabielere stekels, betrokken zijn bij langetermijnprocessen, waaronder geheugen11. Bovendien kan de verdeling van dendritische stekels langs het dendriet worden geassocieerd met synaptische connectiviteit5,12.

Zo heeft het huidige methodologische document drie doelen: 1) Presenteer ons protocol voor ballistische etikettering, dat is gebruikt met een slagingspercentage (d.w.z. neuronen die voldoen aan selectiecriteria en geschikt zijn voor analyse) van 83,3%5,12,13 en over meerdere hersengebieden (d.w.z. PFC, nucleus accumbens, hippocampus); 2) De generaliseerbaarheid van de techniek en de toepassing ervan op in vitro gekweekte neuronen aantonen; 3) Detail de methodologie gebruikt in neuronale reconstructie software en de conclusies die kunnen worden getrokken uit dergelijke gegevens.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Alle dierprotocollen werden beoordeeld en goedgekeurd door het Animal Care and Use Committee van de Universiteit van South Carolina (federaal betrouwbaarheidsnummer: D16-00028).

1. Bereiding van DiI/Tungsten kraalbuizen

  1. Los 100 mg polyvinylpyrrolidone (PVP) op met 10 mL ddH2O. Vortex de PVP-oplossing licht.
  2. Vul de slang met de PVP-oplossing (zie Materiaaltafel)en laat deze 20 min staan. Vervolgens, verdrijven de PVP-oplossing door de andere kant van de slang met behulp van een 10 mL spuit.
  3. Combineer 170 mg wolfraammicrodragerkralen met 250 μL methyleenchloride. Vortex de wolfraam kraal schorsing grondig.
  4. Combineer 6 mg lipofiele DilC18(3) kleurstof met 300 μL methyleenchloride. Draai de DilC18(3) kleurstofoplossing grondig.
    LET OP: Voer stappen 1.3–1.4 uit in een rookkap.
  5. Pipetteer 250 μL van de wolfraamkraalsvering op een glazen schuif. Wacht tot de vering aan de lucht droog (~ 3 min).
  6. Voeg 300 μL DilC18(3) kleurstofoplossing toe aan de bovenkant van de wolfraamkraalophangingslaag. Meng de DiIC18(3) kleurstof oplossing en wolfraam kraal vering grondig met een pipet tip en laat het mengsel aan de lucht drogen (~ 3 min).
  7. Eenmaal gedroogd, gebruik dan een scheermesje om het mengsel te splitsen in twee 1,5 mL centrifuge buizen. Vul de buizen met water.
  8. Sonicate in een waterbad (Amp I, 100%) tot homogeen (~ 5 min). Zorg ervoor dat de punt van de sonicator direct op de buizen ligt met de kraalvering.
  9. Combineer de twee 1,5 mL gehomogeniseerd mengsel in een conische buis van 15 mL. Sonicate het mengsel voor nog eens 3 min.
  10. Trek de wolfraam kralen-DilC18(3) kleurstof mengsel in de PVP-gecoate slang met behulp van een 10 mL spuit. Voer de slang in het bereidingsstation (zie Materiaaltafel).
  11. Draai 1 min op het voorbereidingsstation. Verwijder voorzichtig al het water uit de slang met behulp van een 10 mL spuit.
  12. Zet het stikstofgas aan en pas de stikstofstroom aan op ongeveer 0,5 liter per minuut (LPM), draai de slang in het voorbereidingsstation en droog met stikstof gedurende 30 minuten.
  13. Haal de slang uit het bereidingsstation en snijd in 13 mm lengtes (overeenkomend met de laadgrootte van de cartridge) met behulp van een buizensnijder. Houd de lengtes van 13 mm in sprankelende flacons in het donker.

2. Voorbereiding van hersensecties

OPMERKING: Volwassen mannelijke F344/N ratten werden paar gehuisvest in een gecontroleerde omgeving onder een 12/12 licht: donkere cyclus met ad libitum toegang tot voedsel en water. Alle dieren werden verzorgd met behulp van richtlijnen die door de National Institutes of Health in de Gids voor de zorg en het gebruik van proefdieren.

  1. Diep verdoven ratten met behulp van 5% sevoflurane.
  2. Ga naar de volgende stap wanneer de ratten niet reageren op schadelijke stimuli en reflexen afwezig zijn.
  3. Zet de rat in een supine positie in een chemische rookkap.
  4. Maak een incisie door de huid langs de thoracale middellijn. Scheid het middenrif en open de kist met een schaar. Steek een naald van 20 G × 25 mm in de linker hartkamer.
  5. Snijd onmiddellijk het rechter atrium met een schaar. Perfuse 50 mL van 100 mM PBS met 5 mL/min van debiet. Perfuse 100 mL van 4% paraformaldehyde gebufferd in 100 mM PBS.
  6. Verwijder de hele rat hersenen direct na perfusie.
  7. Postfix het hele brein gedurende 10 min met 4% paraformaldehyde.
    LET OP: Niet postfix in 4% paraformaldehyde voor meer dan 30 min, omdat het van invloed op de etikettering.
  8. Snijd 500 μm dikke coronale secties met behulp van een rat hersenen matrix (zie Tabel van materialen). Maak de eerste snede en houd het mes op zijn plaats. Maak een tweede snede met behulp van een tweede mes en verticaal verwijderen van het eerste mes, het houden van het weefsel op het bladoppervlak.
  9. Plaats de hersenschijfjes in een 24 putplaat met 1 mL van 100 mM PBS in elke put. Herhaal dit proces totdat alle plakjes zijn doorgesneden.

3. Ballistische etikettering en visualisatie van hersensecties

  1. Verwijder de PBS van elke gerichte goed.
  2. Laad de cartridge met een stuk DiI/Tungsten kraalslang en plaats deze in de applicator.
  3. Plaats een stuk filterpapier tussen twee mesh-schermen. Sluit de applicator aan op de heliumslang. Pas de uitvoerdruk van helium aan op 90 pond per vierkante inch (psi).
  4. Plaats de applicator verticaal met de hand op het midden van de beoogde put op een afstand van 1,5 cm tussen het monster en het mesh-scherm. Vuur de DiI / Tungsten kralen slang.
    LET OP: Zorg ervoor dat u alle PBS uit de beoogde putten verwijdert voordat u gaat fotograferen.
  5. Laad de cartridge met de volgende DiI/Tungsten kraalslang. Ontsla continu de DiI/Tungsten kralen van de slang op de resterende plakjes.
  6. Vul de 24 putplaat met 100 mM PBS. Was met 500 μL verse 100 mM PBS 3x. Laat de plakjes niet omdraaien tijdens het wassen met PBS.
  7. Voeg 500 μL verse 100 mM PBS toe en houd de plakjes 3 uur in het donker op 4 °C.
  8. Breng de hersenen plakjes op glazen dia's met behulp van een fijne borstel.
    OPMERKING: Drie hersensecties kunnen op elke glazen plaat worden overgebracht.
  9. Voeg onmiddellijk 1 mL antifade montagemedium toe aan elke sectie. Plaats een coverslip van 22 mm x 50 mm over de hersendelen. Droog de glazen glijbanen in het donker gedurende 2 dagen.
  10. Schakel het confocale microscoopsysteem in en schakel over naar een 60× doelstelling.
  11. Stel het confocale microscoopsysteem in op een vergroting van 60× (A/1.4, olie) en een Z-vlak interval van 0,15 μm (pinhole maat 30 μm, back-projected pinhole radius 167 nm). Gebruik een golflengte van 543 nm om beelden van de neuronen van belang te verwerven.
  12. Verkrijg Z-stack beelden voor het beoogde neuron type op basis van hersengebied grenzen en morfologische kenmerken van neuronen.
    LET OP: Verwerf ten minste drie beelden van elk dier.

4. Gebruik van de methode met celcultuur

  1. Isoleer primaire corticale neuronen van F344/N ratten op postnatale dag één met behulp van eerder gerapporteerde methodologie14.
  2. Cultuur primaire corticale neuronen in een 35 mm glazen bodem schotel voor een week. Verander de helft van het kweekmedium met vers neuron groeimedium op de derde dag na isolatie. Was de glazen bodemschaal 2x met 1 mL van 100 mM PBS.
  3. Fix with 4% paraformaldehyde for 15 min at temperature. Herhaal stap 3.2–3.6 om de cellen ballistisch te labelen.
  4. Was met 1 mL van 100 mM PBS 3x. Voeg 500 μL verse PBS van 100 mM toe en houd deze 3 uur lang op 4 °C in het donker.
  5. Voeg 200 μL antifade montagemedium toe.
  6. Verkrijg Z-stack afbeeldingen voor elk gericht neuron met behulp van de parameters in stap 3.10.

5. Neuronale analyse en dendritische wervelkolom kwantificering

  1. Blinde neuronen met codenummers om vooringenomenheid van de experimentator te voorkomen.
  2. Stel selectiecriteria vast voor neuronen op basis van het hersengebied van belang.
    OPMERKING: Selectiecriteria voor neuronen omvatten continue dendritische kleuring, lage achtergrond, geen kleurstof clusters binnenkant van de cellen, minimale verspreiding van de DiI kleurstof in de extracellulaire ruimte, correcte morfologie van piramidale neuronen (Figuur 1).
  3. Open neuronale reconstructie software (Zie de bijgevoegde Video 1).
  4. Laad een afbeeldingsbestand door te klikken op de afbeelding "Bestandsmap" in de linkerbovenhoek.
  5. Klik op "Soma" en markeer de soma van de neuronen op de afbeelding.
  6. Klik op" Tree" en selecteer "User-Guided".
  7. Traceer alle dendritische takken van belang.
    OPMERKING: Voor piramidale neuronen, die worden gekenmerkt door een apicale dendriet en meerdere basilaire dendrieten, wordt alleen het apicale dendrietje getraceerd. Zorg ervoor dat alle verbindingstakken aan elkaar zijn bevestigd.
  8. Klik op "Spine".
  9. Definieer detectieparameters en klik op "Alles detecteren".
    OPMERKING: Voor hersensegmenten zijn de consistente parameters die worden gebruikt in hersengebieden: 2.0 (Outer Range), 0.3 (Minimum Height), 100% (Detector Sensitivity) en 10 (Minimum Count). Voor celkweek is het noodzakelijk om de detectorgevoeligheid te verhogen en het minimumaantal te verlagen.
  10. Classificeren stekels door "Classificeren Alle" te selecteren.
    OPMERKING: Dendritische stekels worden geclassificeerd met behulp van een algoritme dat integraal deel uitmaakt van de neuronale reconstructiesoftware15.
  11. Sla tracering op door de schijfafbeelding in de linkerbovenhoek te selecteren.
  12. Uitvoeren van neuronale en dendritische wervelkolom morfologische analyses.
    1. Open neuronale reconstructie kwantitatieve analyse software (Zie bijgevoegde Video 2).
    2. Laad de afbeelding door te klikken opBestanden "Gegevensbestand openen".
    3. Klik op "Analysis" en "Branched Structure Analysis" om neuronale morfologie en dendritische wervelkolommorfologie te analyseren.
    4. Voor neuronale morfologie klikt u op" Boomtotalen" en selecteert u het vak voor "Dendrite Totalen".
    5. Voor dendritische wervelkolommorfologie klikt u op "Spines" en selecteert u het vakje voor "Spine Details".
    6. Sla uitvoer op als een tekstbestand (.txt) door met de rechtermuisknop op de uitvoertabel te klikken en"Opslaan in bestand" teselecteren.
    7. Klikop" Analyseren " en "Sholl Analyse".
    8. Stel de startstraal in op 10 μm en de straaltoename op 10 μm.
    9. Klik op het vak "Dendrieten" en klik op "Weergeven".
    10. Sla uitvoer op als een tekstbestand (.txt) door met de rechtermuisknop op de uitvoertabel te klikken en"Opslaan in bestand" teselecteren.

6. Gegevensanalyse

  1. Analyseer de gegevens van de neuronale morfologie (d.w.z. dendritische vertakkings)
    1. Voeg het aantal dendrieten bij elke branchorder toe en deel door het totale aantal dendrieten. Vermenigvuldig met 100 om de relatieve frequenties te berekenen voor het aantal dendrieten bij elke branchorder.
  2. Analyseer de Sholl-analysegegevens om de complexiteit van neuronale arbor en dendritische wervelkolomconnectiviteit te onderzoeken.
    1. Bereken de gemiddelde en standaardfout van het gemiddelde voor het aantal kruispunten in elke straal.
    2. Som het aantal stekels dat afhankelijk is van het type wervelkolom (d.w.z. dun, stompe, paddestoel) bij elke straal en deel door het totale aantal stekels voor dat wervelkolomtype. Vermenigvuldig met 100 om de relatieve frequenties te berekenen voor het aantal stekels bij elke straal.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

In figuur 2Awerden de typische piramidale neuronen in het hippocampal gebied in de rattenhersendelen geïdentificeerd door ballistische etiketteringstechnologie, gekenmerkt door één grote apicale dendrieten en een aantal kleinere basale dendrieten rond het soma. Figuur 2B toont het neuron in de neuronale reconstructie kwantitatieve analyse software na de soma werd gedetecteerd, dendritische takken werden getraceerd, en stekels werden gedetecteerd. Vervolgens werd...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

In dit protocol beschrijven we een veelzijdige etiketteringstechniek voor neuronen uit zowel rattenhersenen als in vitro gekweekte neuronen. Verder rapporteren we de methodologie voor het gebruik van neuronale reconstructie software en neuronale reconstructie kwantitatieve analyse software om neuronale morfologie en dendritische stekels te beoordelen. De beoordeling van neuronale morfologie en dendritische stekels biedt een kans om veranderingen in dendritische vertakkingscomplexiteit, neuronale arbor complexiteit, dendr...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Geen van de auteurs heeft belangenconflicten te verklaren.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit werk werd gefinancierd door NIH subsidies HD043680, MH106392, DA013137 en NS100624.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
20Gx25mm PrecisionGlide naaldBD305175
24-well celcultuurplaatCostar3562
35 mm Glass Bottom DishesMatTek CorporationP35G-1.5-20-C
Antibiotic-Antimycotic oplossingCellgro30004CI100X
B-27 supplementLife Technologies17504-04450X
Barrel linerBIO-RAD165-2417
BoraxSigmaB9876
BoorzuurSigmaB0252
Cartridge houderBIO-RAD165-2426
Confocal beeldvormingssoftwareNikonEZ-C1versie 3.81b
Confocal microscoopNikonTE-2000E
DekglasVWR637-137
DilC18(3)Fisher ScientificD282
DMEM/F12 mediumLife Technologies10565-018
Dumont #5 ForcepsWorld Precision Instruments14095
Dumont #7 ForcepsWorld Precision Instruments14097
F344 rat(Harlan Laboratories, Indianapolis, IN)
GlucoseVWR101174Y
GlutaMaxLife Technologies35050-061100X
HBSSSigmaH464110X
Helios diffusieschottenBIO-RAD165-2475
Helios gene gun kitBIO-RAD165-2411
Helios gene gun systeemBIO-RAD165-2431
Helium slang montageBIO-RAD165-2412
Iris ForcepsWorld Precision Instruments15914
Iris ScissorsWorld Precision Instruments500216
MethyleenchlorideFisher ScientificD150-1
Neurobasal mediumLife Technologies21103-049
Neurolucida 360 softwarembf biosciencedendritische stekelanalyse
ParaformaldehydeSigma-Aldrich158127-500G
ParaformaldehydeSigmaP6148
Poly-L-LysineSigmaP9155
PolyvinylpyrrolidonFisher Scientific5295
ProLong Gold antifade reagensFisher ScientificP36930montagemedium
Rat brain matrix, 300 - 600g, Coronal, 0.5mmTed Pella15047
SevofluraanMerritt Veterinary Supply347075
Sodium BicarbonateLife Technologies25080
SuperFrost Plus SlidesFisher Scientific12-550-154%
SpuitkitBIO-RAD165-2421
Tefzel buisBIO-RAD165-2441
Trypsin-EDTALife Technologies15400-054
Buis snijderBIO-RAD165-2422
Buis voorbereidingsstationBIO-RAD165-2418
Tungsten M-25 Microcarrier 1.7 µmBIO-RAD165-2269
Vannas ScissorsWorld Precision Instruments500086

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Gan, W. B., Grutzendler, J., Wong, W. T., Wong, R. O., Lichtman, J. W. Multicolor "DiOlistic" labeling of the nervous system using lipophilic dye combinations. Neuron. 27, 219-225 (2000).
  2. Gan, W. B., Grutzendler, J., Wong, R. O., Lichtman, J. W. Ballistic delivery of dyes for structural and functional studies of the nervous system. Cold Spring Harbor Protocol. 2009 (4), 5202(2009).
  3. Seabold, G. K., Daunais, J. B., Rau, A., Grant, K. A., Alvarez, V. A. DiOLISTIC labeling of neurons from rodent and non-human primate brain slices. Journal of Visualized Experiments. (41), (2010).
  4. Spacek, J. Dynamics of the Golgi method: a time-lapse study of the early stages of impregnation in single sections. Journal of Neurocytology. 18 (1), 27-38 (1989).
  5. McLaurin, K. A., Li, H., Booze, R. M., Mactutus, C. F. Disruption of Timing: NeuroHIV Progression in the Post-cART Era. Science Reports. 9 (1), 827(2019).
  6. Spruston, N. Pyramidal neurons: dendritic structure and synaptic integration. Nature Reviews Neurosciences. 9 (3), 206-221 (2008).
  7. Megias, M., Emri, Z., Freund, T. F., Gulyas, A. I. Total number and distribution of inhibitory and excitatory synapses on hippocampal CA1 pyramidal cells. Neuroscience. 102, 527-540 (2001).
  8. Peters, A., Kaiserman-Abramof, I. R. The small pyramidal neuron of the rat cerebral cortex. The perikaryon, dendrites and spines. American Journal of Anatomy. 127, 321-355 (1970).
  9. Harris, K. M., Sultan, P. Variation in the number, location, and size of synaptic vesicles provides an anatomical basis for the nonuniform probability of release at hippocampal CA1 synapses. Neuropharmacology. 34, 1387-1395 (1995).
  10. Sorra, K. E., Fiala, J. C., Harris, K. M. Critical assessment of the involvement of perforations, spinules, and spine branching in hippocampal synapse formation. Journal of Comparative Neurology. 398, 225-240 (1998).
  11. Mancuso, J. J., Chen, Y., Li, X., Xue, Z., Wong, S. T. C. Methods of dendritic spine detection: from Golgi to high-resolution optical imaging. Neuroscience. 251, 129-140 (2012).
  12. McLaurin, K. A., et al. Synaptic connectivity in medium spiny neurons of the nucleus accumbens: A sex-dependent mechanism underlying apathy in the HIV-1 transgenic rat. Frontiers in Behavior Neurosciences. 12, 285(2018).
  13. Roscoe, R. F. Jr, Mactutus, C. F., Booze, R. M. HIV-1 transgenic female rat: synaptodendritic alterations of medium spiny neurons in the nucleus accumbens. Journal of Neuroimmune Pharmacology. 9 (5), 642-653 (2014).
  14. Li, H., Aksenova, M., Bertrand, S. J., Mactutus, C. F., Booze, R. Quantification of Filamentous Actin (F-actin) Puncta in Rat Cortical Neurons. Journal of Visualized Experiments. (108), e53697(2016).
  15. Rodriguez, A., Ehlenberger, D. B., Dickstein, D. L., Hof, P. R., Wearne, S. L. Automated Three-Dimensional Detection and Shape Classification of Dendritic Spines from Fluorescence Microscopy Images. PLoS ONE. 3 (10), 1371(2008).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Dendritische stekelsneuronale reconstructieSholl analyseconfocale microscopieDiI C18 3 kleurstofwolfraam microcarrier beads

Gerelateerde artikelen