Methodenartikel

Gestandaardiseerde Histomormetrische evaluatie van artrose in een chirurgisch muismodel

DOI:

10.3791/60991

⸱

6 mei 2020

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Center for Orthopedic Research and Translational Sciences, Department of Orthopedics and Rehabilitation, Pennsylvania State College of Medicine, 2Department of Biochemistry and Molecular Biology, Pennsylvania State College of Medicine, 3Department of Pharmacology, Pennsylvania State College of Medicine

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Het huidige protocol stelt een rigoureuze en reproduceerbare methode voor kwantificering van morfologische gewrichtsveranderingen die gepaard gaan met artrose. Toepassing van dit protocol kan waardevol zijn bij het monitoren van ziekteprogressie en het evalueren van therapeutische interventies bij artrose.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Een van de meest voorkomende gewrichtsaandoeningen in de Verenigde Staten, artrose (OA) wordt gekenmerkt door progressieve degeneratie van gewrichtskraakbeen, voornamelijk in de heup-en kniegewrichten, wat resulteert in aanzienlijke effecten op de mobiliteit van de patiënt en de kwaliteit van leven. Tot op heden zijn er geen bestaande curatieve therapieën voor OA in staat om te vertragen of te remmen kraakbeen degeneratie. Momenteel is er een uitgebreid lichaam van lopend onderzoek om OA-pathologie te begrijpen en nieuwe therapeutische benaderingen of middelen te ontdekken die efficiënt kunnen vertragen, stoppen of zelfs OA kunnen omkeren. Het is dus van cruciaal belang om een kwantitatieve en reproduceerbare benadering te hebben om oa-geassocieerde pathologische veranderingen in het gewrichtskraakbeen, synovium en subchondrale bot nauwkeurig te evalueren. Momenteel, OA ernst en progressie worden voornamelijk beoordeeld met behulp van de Artrose Research Society International (OARSI) of Mankin scoren systemen. Ondanks het belang van deze scoresystemen zijn ze semikwantitatief en kunnen ze worden beïnvloed door de subjectiviteit van de gebruiker. Wat nog belangrijker is, ze niet nauwkeurig te evalueren subtiele, maar toch belangrijk, veranderingen in het kraakbeen tijdens de vroege ziekte staten of vroege behandelingsfasen. Het protocol dat we hier beschrijven maakt gebruik van een geautomatiseerd en semigeautomatiseerd histomorfometrisch softwaresysteem om een gestandaardiseerde, rigoureuze en reproduceerbare kwantitatieve methodologie vast te stellen voor de evaluatie van gezamenlijke veranderingen in OA. Dit protocol biedt een krachtige aanvulling op de bestaande systemen en zorgt voor een efficiëntere detectie van pathologische veranderingen in het gewricht.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Een van de meest voorkomende gewrichtsaandoeningen in de Verenigde Staten, OA wordt gekenmerkt door progressieve degeneratie van gewrichtskraakbeen, voornamelijk in de heup-en kniegewrichten, wat resulteert in aanzienlijke effecten op de mobiliteit van de patiënt en de kwaliteit van leven1,2,3. Gewrichtskraakbeen is het gespecialiseerde bindweefsel van diarthrodiale gewrichten ontworpen om wrijving te minimaliseren, beweging te vergemakkelijken en gewrichtscompressie te verdragen4. Gewrichtskraakbeen bestaat uit twee primaire componenten: chondrocyten en extracellulaire matrix. Chondrocyten zijn gespecialiseerde, metabolisch actieve cellen die een primaire rol spelen in de ontwikkeling, het onderhoud en de reparatie van de extracellulaire matrix4. Chondrocyte hypertrofie (CH) is een van de belangrijkste pathologische tekenen van OA-ontwikkeling. Het wordt gekenmerkt door een verhoogde cellulaire grootte, verminderde proteoglycan productie, en verhoogde productie van kraakbeen matrix-vernederende enzymen die uiteindelijk leiden tot kraakbeen degeneratie5,6,7. Verder spelen pathologische veranderingen in het subchondal bot en synovium van het gewricht een belangrijke rol in oa-ontwikkeling en progressie8,9,10,11,12. Tot op heden zijn er geen bestaande curatieve therapieën diekraakbeendegeneratie1,2,3,13,14remmen . Zo is er uitgebreid lopend onderzoek dat tot doel heeft oa-pathologie te begrijpen en nieuwe therapeutische benaderingen te ontdekken die in staat zijn om OA te vertragen of zelfs te stoppen. Daarom is er een toenemende behoefte aan een kwantitatieve en reproduceerbare aanpak die een nauwkeurige evaluatie van oa-geassocieerde pathologische veranderingen in het kraakbeen, synovium en subchondrale bot van het gewricht mogelijk maakt.

Momenteel worden oa ernst en progressie voornamelijk beoordeeld met behulp van de OARSI of Mankin scoring systems15. Deze scoresystemen zijn echter slechts semikwantitatief en kunnen worden beïnvloed door de subjectiviteit van de gebruiker. Wat nog belangrijker is, ze niet nauwkeurig te evalueren subtiele veranderingen die zich voordoen in het gewricht tijdens de ziekte of in reactie op genetische manipulatie of een therapeutische interventie. Er zijn sporadische rapporten in de literatuur die histomorfometrische analyses van het kraakbeen, synovium, of subchondralbot16,17,18,19,,,20,21beschrijven . Een gedetailleerd protocol voor een rigoureuze en reproduceerbare histomorfometrische analyse van al deze gemeenschappelijke componenten ontbreekt echter nog steeds, waardoor een onvervulde behoefte in het veld ontstaat.

Om pathologische veranderingen in OA te bestuderen met histomorfometrische analyse, gebruikten we een chirurgisch OA-muismodel om OA te induceren via destabilisatie van de mediale meniscus (DMM). Onder de gevestigde modellen van murine OA, DMM werd geselecteerd voor onze studie, omdat het gaat om een minder traumatisch mechanisme van letsel22,23,24,25,26. In vergelijking met meniscal-ligamenteuze letsel (MLI) of voorste kruisbandletsel (ACLI) operaties, DMM bevordert een meer geleidelijke progressie van OA, vergelijkbaar met OA ontwikkeling bij de mens22,24,25,26. Muizen werden twaalf weken na de DMM-operatie geëuthanaseerd om veranderingen in het gewrichtskraakbeen, subchondrale bot en synovium te evalueren.

Het doel van dit protocol is om een gestandaardiseerde, rigoureuze en kwantitatieve aanpak vast te stellen om gezamenlijke veranderingen te evalueren die oa vergezellen.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Twaalf weken oude mannelijke C57BL/6 muizen werden gekocht bij Jax Labs. Alle muizen werden gehuisvest in groepen van 3-5 muizen per micro-isolator kooi in een kamer met een 12 uur licht / donker schema. Alle dierlijke procedures werden uitgevoerd volgens de National Institute of Health (NIH) Guide for the Care and Use of Laboratory Animals en goedgekeurd door het Animal Care and Use Committee van Pennsylvania State University.

1. Posttraumatische artrose (PTOA) chirurgisch model

  1. Anesthetize muizen met behulp van een ketamine (100 mg/kg)/xylazine (10 mg/kg) combinatie via intraperitoneale injectie, toedienen buprenorfine (1 mg/kg) via intraperitoneale injectie voor pijnbestrijding, en scheren het haar over de knie. Controleer op het ontbreken van een pedaalreflex voordat u met de operatie begint.
  2. Destabilisatie van de mediale meniscus (DMM) operatie uitvoeren zoals eerder beschreven22,23.
    OPMERKING: Raadpleeg glasson et al. en Singh et al. referenties voor meer gedetailleerde chirurgische protocol informatie22,23.
    1. Maak een 3 mm longitudinale incisie van de distale patella naar het proximale scheenbeenplateau van het rechterkniegewricht. Gebruik een hechting om de knieschijfpees te verplaatsen.
    2. Open de gezamenlijke capsule mediaal naar de pees en verplaats de infrapatellar vetpad om de intercondylar regio, mediale meniscus, en meniscotibial ligament23visualiseren .
    3. Transect de mediale meniscotibialligament om DMM te voltooien en het gewricht te destabiliseren22,23. Sluit de incisieplaats met nietjes of hechtingen.
  3. Voer schijnoperaties uit na een soortgelijke procedure, maar zonder transsectie van de mediale meniscotibiale ligament.
    OPMERKING: Muizen werden gerandomiseerd om ofwel DMM of schijnchirurgie te ontvangen. Volgens de eerder gepubliceerde literatuur ontwikkelen muizen significante PTOA 12 weken na de DMM-operatie22,23,24.

2. Muiseuthanasie en monsterverzameling

  1. Muis euthanasie
    1. Twaalf weken na DMM, verdoven muizen met behulp van een ketamine (100 mg/kg)/xylazine (10 mg/kg) combinatie via intraperitoneale injectie.
    2. Maak een middellijn incisie door de huid langs de thorax en trek de ribbenkast om het hart bloot voor perfusie fixatie27.
      OPMERKING: Raadpleeg de referentie van de Gage et al. voor aanvullende informatie over het protocol voor een goede verfixatie van knaagdieren en de videoweergave van de juiste montage en procedures van de apparatuur27.
    3. Stel het perfusieapparaat in volgens het protocol van de fabrikant.
    4. Euthanaser de muis door heparinized zoutdoor de linker ventrikel te doordringen tot het bloed wordt gewist en de lever bleek wordt. Doormantel de muis met 10% neutraal gebufferd formaline tot volledige muis fixatie is bereikt.
      LET OP: Een met succes geperfundeerde muis wordt stijf. De gemiddelde perfusietijd met behulp van het geautomatiseerde pompsysteem is 5-7 min.
  2. Verzameling en bereiding van monsters
    1. Isoleer de knieën door het snijden van het bot in het midden van het dijbeen en mid-tibia en ontleden het omliggende spierweefsel.
    2. Zet de fixatie voort door kniegewrichten op te slaan in 10% neutraal gebufferd formaline bij kamertemperatuur gedurende 24 uur, dan bij 4 °C gedurende 6 dagen.
    3. Ontkalk het bot door het monster 1 week bij kamertemperatuur op te slaan in EDTA-ontkalkingsbuffer bij lichte schudden28. Verander de ontkalkingsbufferoplossing elke 3 dagen.
      OPMERKING: Ontkalkingsbuffer werd bereid door het oplossen van 140 g ultrazuivere EDTA tetranatrium in een oplossing van 850 mL gedestilleerd water plus 15 mL glaciale azijnzuur. De buffer werd pH geëquilibreerd tot 7,6 door druppelige toevoeging van glaciale azijnzuur aan de oplossing. Bij het bereiken van pH = 7,6 werd de buffer met gedestilleerd water op 1 L gebracht. Ontkalkingsbuffer werd vers bereid en binnen 1 week na de bereiding gebruikt.
    4. Was de knieën met 50% ethanol, dan 70% ethanol voor 15 min per stuk, dan verwerken voor inbedding.
      OPMERKING: Vloeistofoverdrachtverwerking werd uitgevoerd door de Moleculaire en Histopathologie Kern in Penn State Milton S. Hershey Medical Center. Raadpleeg de histologiekern van de instelling voor aanbevelingen over optimale monsterverwerking.
    5. Sluit de muisknieën in paraffine in met het mediale aspect van het gewricht naar het onderste oppervlak van het paraffineblok. Breng lichte druk uit op de scheenbeenzijde van het gewricht tijdens het inbedden om ervoor te zorgen dat tibiale en femorale oppervlakken zo dicht mogelijk bij hetzelfde vlak liggen.

3. Microtome-sectie en diaselectie

  1. Microtome sectie
    1. Gebruik de vlakverstelknoppen op de blokhouder van de microtoom om een goede richting van het monsterblok te garanderen.
    2. Gezicht het paraffine blok, zodat de distale aspect van het dijbeen, proximale regio van het scheenbeen, en voorste en achterste hoorns van de mediale meniscus verschijnen in hetzelfde vlak voor sectie collectie (Aanvullende figuur 1A). Begin met het verzamelen van secties op dia's wanneer de voorste en achterste hoorns van de mediale meniscus van elkaar beginnen te scheiden.
    3. Zorg ervoor dat het scheenbeen, dijbeen en menisci in hetzelfde vlak verschijnen door structuurgroottes te vergelijken. Het scheenbeen en het dijbeen moeten van vergelijkbare grootte zijn, met zowel meniscushoorns in grootte als vorm(aanvullend figuur 1A). Als een structuur te groot lijkt in vergelijking met zijn tegenhanger, geeft dit aan dat extra facing nodig is. Belangrijk is, bevestigen dat de gezamenlijke ruimte intact blijft.
    4. Neem sagittale delen van de paraffine-ingebedde muisknieën door het mediale gewrichtscompartiment in 5 μm secties en verzamel de secties op dia's. Verzamel ongeveer 30 secties per paraffineblok.
  2. Diaselectie
    1. Selecteer drie representatieve secties met een uitzondering van 50 μm voor elk monster vanaf de vijfde sectie (dia's 5, 15 en 25). Geselecteerde dia's worden gebruikt voor latere kleuring, OARSI-scoring en histomorfometrische analyse.
      OPMERKING: Selecteer in een blok met 30 secties dia's van het begin (dia's 5–10), midden (dia's 15–20) en het einde (dia's 25–30) van de set om het hele voorbeeld duidelijk weer te geven. Selecteer dia's van vergelijkbare diepteniveaus tussen de monsters.

4. Hematoxylin, Safranin Orange en Fast Green kleuring

  1. Deparffinize de geselecteerde dia's met drie veranderingen van xyleen. Hydrateer de dia's met twee veranderingen van 100% ethanol, twee veranderingen van 95% ethanol en een verandering van 70% ethanol.
  2. Bevlek de dia's met hematoxylin gedurende 7 min en was vervolgens met stromend water gedurende 10 min. Vlek met Fast Green gedurende 3 min en spoel in 1,0% glaciale azijnzuur gedurende 10 s. Vlek met Safranin-O gedurende 5 min en spoel snel af door te dompelen in 0,5% glaciale azijnzuur.
  3. Spoel glijbanen in twee veranderingen van gedestilleerd water en laat de lucht drogen.
  4. Duidelijke dia's in drie veranderingen van xyleen voor 5 min elk dan monteren met xyleen op basis van montage media en een coverslip.
    OPMERKING: Hematoxylin dient als de nucleaire vlek voor het identificeren van gebieden van beenmerg. Safranin-O wordt gebruikt om kraakbeen, proteoglycanen, mucin en mastcelkorrels te bevlekken. Fast Green wordt gebruikt als een tegenvlek voor bot.

5. Diabeeldvorming

  1. Beeld de Safranin-O en Fast Green gekleurde dia's met behulp van een beschikbare camera bevestigd aan een microscoop en computer-based imaging software.
  2. Open de beeldvormende software (zie Tabel van materialen)en schik het kniegewricht gebied van belang (ROI) in het midden van het beeldvenster. Als u een rotatiemicroscoopdiafase gebruikt, lijnt u de dia zo uit dat het scheenbeenoppervlak de breedte van de horizontale as van het beeldvormingsgebied overspant.
  3. Stel de witbalans van de camera in voordat u begint met het beeld van een reeks voorbeelden (Aanvullende figuur 2). Beeld het gewrichtscompartiment op zowel 4x als 10x vergroting, zodat zowel het scheenbeen als het dijbeengewrichtsoppervlak en het scheenbeensubchondrale bot zijn opgenomen in elk van de afbeelding ROI's(Aanvullende figuur 1A, B). Sla afbeeldingen op voor elk van de drie geselecteerde niveaus die moeten worden gebruikt voor OARSI-scores.
    OPMERKING: Het instellen van de witbalans van de camera is afhankelijk van de software en camerasystemen die worden gebruikt. Ga over het algemeen naar het tabblad Camera of Het menu Hoofdbeeldvorming en blader omlaag naar Witbalans instellen. Selecteer Witbalans instellen en er verschijnt een kleine cursor of pictogram( Aanvullende figuur 2A). Selecteer met de cursor een gebied in de afbeelding/het voorbeeld dat vrij is van vlekken, zoals de gewrichtsruimte, om de witbalans in te stellen.

6. Artrose research society international (OARSI) scoort15

  1. Randomiseren van de drie geselecteerde Safranin-O en Fast Green gekleurde dia's van alle monsters.
  2. Voer OARSI scoren op een blinde manier met drie waarnemers. Kortom, geef één afbeelding tegelijk weer in een gerandomiseerde volgorde en laat drie waarnemers elke afbeelding scoren, correlerend met een van de drie niveaus die voor elk monster zijn geselecteerd.
    LET OP: Raadpleeg de OARSI-scoretabel voor gedetailleerde beschrijvingen van de indelingsschaal15.
  3. Bereken de gemiddelde score voor elke sectie aan de hand van individuele scores van elke waarnemer. Bepaal de gemiddelde score per monster door de gemiddelde score van de drie representatieve secties te nemen.

7. Histomorfometrische analyse

OPMERKING: Live beelden van het kniegewricht worden bekeken op een touchscreen monitor met behulp van een microscoop camera, en een stylus wordt gebruikt om handmatig te traceren van de ROI's. Ingebouwde algoritmen van de histomorfometriesoftware kwantificeren de opgegeven parameters (zie Protocol hieronder) in de gedefinieerde ROI's. Belangrijk is dat dezelfde Safranin-O en Fast Green gekleurde secties gebruikt in OARSI scoren worden gebruikt voor histomormetrische analyse.

  1. Software-installatie en meetvoorbereiding
    1. Schakel de microscoop, camera, computer en touchscreen monitor in. Klik op het softwarepictogram om het softwareprogramma te starten. Plaats de dia op het microscooppodium om te bekijken.
    2. Centreer het monster in het meetvenster. Zorg ervoor dat het meetrooster is ingesteld op de juiste vergroting om het doel te evenaren dat op de microscoop wordt gebruikt (Aanvullend figuur 3).
    3. Ga naar het tabblad Bestand boven aan het scherm en blader omlaag naar Leesinstellingen. Open het venster Instellingen en selecteer het juiste instellingenbestand voor de parameters die moeten worden gemeten.
    4. Selecteer de parameter die moet worden gemeten in de lijst aan de rechterkant van het scherm (Aanvullende figuur 3). Gebruik de stylus of muiscursor om afbeeldingen te traceren volgens de onderstaande stappen om specifieke weefsel-ROI's te meten. Wanneer u met elke meting bent voltooid, klikt u met de rechtermuisknop om de meting te beëindigen en door te gaan naar de volgende parameter.
      OPMERKING: De lijst met parameters die moeten worden gemeten, wordt gemaakt door middel van een duidelijk voorkeursbestand dat in overleg met het softwarebedrijf is opgezet met het oog op het meten van de beschreven ROI's. Zie discussie voor meer informatie over de volledige setup.
    5. Voltooi alle metingen en navigeer vervolgens naar het tabblad Overzichtsgegevens onder aan het softwarescherm(Aanvullende figuur 3). Klik op het schermvenster, druk op de toets Invoegen op het toetsenbord of kopieer en plak de gegevens in een aparte spreadsheet.
      OPMERKING: Voer histomorfometrische analyse uit op een gerandomiseerde en geblindeerde manier. Na het voltooien van alle parametermetingen voor alle monsters, orden en gemiddelde de metingen van de drie dia's van elk monster.
  2. Metingen van de totale, verkalkte en onverkalkte kraakbeengebieden
    OPMERKING: Gebruik een commercieel beschikbare software (zie Materiaaltabel)om deze stappen uit te voeren. Zie aanvullende figuur 1B,C voor verduidelijking over kraakbeengebieden, knooppunten en subchondrale botgebieden die in dit gedeelte worden besproken.
    1. Teken een lijn over de superieure rand van het scheenbeen kraakbeen oppervlak waar het kraakbeen voldoet aan de gezamenlijke ruimte. Teken een tweede lijn op de chondro-osseous kruising waar het verkalkte kraakbeen het subchondrale bot ontmoet (Figuur 1B). Gebruik de functie Gebied van de software om automatisch de totale kraakbeengebiedmeting te verkrijgen.
    2. Teken een lijn langs het getijdenmerk, een natuurlijk voorkomende lijn die de verkalkte en onverkalkte gebieden van kraakbeen scheidt. Teken een tweede lijn op de chondro-osseous kruising waar het verkalkte kraakbeen het subchondrale bot ontmoet (Figuur 1B). Gebruik de functie Gebied stoom automatisch de verkalkte kraakbeengebiedmeting te verkrijgen.
    3. Bereken het ongecalcificeerde kraakbeengebied door het verkalkte kraakbeengebied af te trekken van het totale kraakbeengebied(figuur 1B).
  3. Bepaling van het chondrocytegetal en fenotype
    1. Afzonderlijke telfuncties maken binnen de instellingen in de histomorfometriesoftware om matrixproducerende en matrixniet-producerende chondrocyten te onderscheiden (Figuur 1B).
    2. Bepaal het aantal matrices die wel of geen chondrocyten produceren met behulp van de stylus om een kleine stip te maken over elke chondrocyte die het opgegeven fenotype uitdrukt (figuur 1B).
      OPMERKING: Tel cellen op basis van hun fenotype als matrixproducerende (d.w.z. sterke Safranin-O-kleuring) of matrix die niet produceert (d.w.z. zeer zwak of geen Safranin-O-kleuring).
  4. Meting van de tibiale articulaire oppervlakteomtrek
    1. Meet de absolute tibiale articulaire oppervlakteomtrek door een lijn over het oppervlak van het scheenbeen kraakbeen te traceren, zorgvuldig definiërend individuele fibrillaties (figuur 1C).
    2. Teken een tweede lijn langs het getijdenteken om te dienen als een interne controle voor het vlak van elke sectie(figuur 1C).
    3. Bereken de tibiale articulaire oppervlaktefibrillatie-index door de tibiale articulaire oppervlakteomtrek te delen door de tidemark perimeter.
      OPMERKING: Tidemark perimeters zijn over het algemeen gelijk over monsters, dus het verschil in de articulaire oppervlakte perimeters tussen sham en DMM was over het algemeen klein of absolute perimeter of fibrillatie index werden gebruikt.
  5. Meting van de subchondrale bot- en beenmergruimten
    1. Meet het subchondrale beenmergruimtegebied met behulp van de functie Gebied door gebieden in het subchondrale gebied te schetsen dat alleen met hematoxylin is gekleurd (d.w.z. negatief voor Fast Green) om het totale beenmergruimtegebied in het subchondrale bot te bepalen. Teken lijnen rond de omtrek van deze gebieden om het totale gebied van alle beenmergruimte binnen het tibiale subchondrale bot te bepalen (figuur 2B).
    2. Meet het totale subchondrale gebied met behulp van de gebiedsfunctie door het gebied tussen de chondro-osseous verbinding en de superieure rand van de groeiplaat te schetsen, zijwaarts uit te breiden tot de regio's van de voorste en achterste osteofyten (figuur 2B).
    3. Bereken het subchondrale botgebied door het subchondrale beenmergruimtegebied af te trekken van het totale subchondrale gebied(figuur 2B,C).
  6. Meting van de voorste en achterste osteofytengebieden
    1. Om het osteofytegebied te meten, traceer tugeerde u de voorste en achterste osteofyten van het proximale scheenbeen met behulp van de gebiedsfunctie (Figuur 2B,E,F).
      OPMERKING: Osteofyten zijn benige projecties die zich vormen tussen het gewrichtskraakbeen en de groeiplaat, voorste of achterste naar het subchondrale gebied. Osteofyte gebieden op de voorste en achterste zijden van het scheenbeen worden bepaald door het traceren van het gebied voorste of achterste aan het subchondrale bot. De verbinding tussen de osteofyten en subchondrale bot wordt duidelijk afgebakend door een lijn van cellen die zich uitstrekt van het gewrichtskraakbeen tot de groeiplaat. De kruising tussen de osteofyt en synovium wordt bepaald door een overgang tussen benige en vezelig weefsel.
  7. Meting van de synoviale dikte
    1. Meet de voorste dijbeensyyuze dikte met behulp van de functie Gebied door het tekenen van een lijn van de binnenste invoegpositie van de voorste synovium op het dijbeen naar het bevestigingspunt op de meniscus (Figuur 3B).
    2. Teken een tweede lijn van de buitenste invoeging van het synovium op het dijbeen naar de bevestiging ervan aan de meniscus (figuur 3B).
    3. Bereken de synoviale dikte door het totale synoviale gebied te delen door de synoviale omtrek.

8. Statistische analyse

  1. Verzamel de gemeten parameters en gemiddelde de resultaten van de drie representatieve secties voor elk monster. Analyseer de gegevens met behulp van een ongepaarde Student's t-test om twee groepen of eenrichtingsANOVA te vergelijken met drie of meer groepen.
  2. Geef de gegevens weer als gemiddelde ± standaard fout van het gemiddelde.
    OPMERKING: Statistische significantie werd bereikt op p ≤ 0,05.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

DMM-geïnduceerde OA resulteert in gewrichtskraakbeendegeneratie en chondrocyteverlies
DMM-geïnduceerde OA resulteerde in een verhoogde OARSI score in vergelijking met sham muizen, duidelijk gekenmerkt door oppervlakteerosie en kraakbeenverlies (Figuur 1A,D). Het hier beschreven histomorfometrieprotocol heeft verschillende oa-geassocieerde veranderingen gedetecteerd, waaronder een afname van het totale kraakbeenareaal en in het ongecalcificeerde kraakbeeng...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Recent onderzoek naar artrose heeft ons begrip van de kruisbestuiving tussen de verschillende weefsels in het gewricht en de rol die elk weefsel speelt bij het initiëren van de ziekte of progressie8,,9,10,35,36. Het is dan ook duidelijk geworden dat de beoordeling van OA niet beperkt moet blijven tot de analyse van het kraakbeen, maar ook een analyse van het s...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

We willen graag de hulp erkennen van het departement vergelijkende geneeskunde personeel en de moleculaire en histopathologie kern in Penn State Milton S. Hershey Medical Center. Financieringsbronnen: NIH NIAMS 1RO1AR071968-01A1 (F.K.), ANRF Artritis Research Grant (F.K.).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
10% Buffered Formalin PhosphateFisher ChemicalSF100-20Voor monsterfixatie na oogst
Acetic Acid, Glacial (Certified A.C.S.)Fisher ChemicalA38S-212Voor de bereiding van decalcificatiebuffer en azijnzuuroplossing voor kleuring
Cintiq 27QHD Creative Pen DisplayWacomhttps://www.wacom.com/en-es/products/pen-displays/cintiq-27-qhd-touchVoor histomorphometrische analyse en beeldvorming
Cintiq Ergo standWacomhttps://www.wacom.com/en-es/products/pen-displays/cintiq-27-qhd-touchVoor histomorphometrische analyse en beeldvorming
Ethylenediaminetetraacetic acid, tetrasodium salt dihydrate, 99%Acros OrganicsAC446080010Voor de bereiding van decalcificatiebuffer
Fast Green stainSIGMA Life SciencesF7258Voor monsterskleuring
Fisherbrand Superfrost Plus Microscope SlidesFisher12-550-15Voor het verzamelen van monstersneden
HistoPrep XyleneFisherbrandHC-700-1GALVoor deparaffinisatie en kleuring van monsters
Histosette II Tissue Cassettes - Combination Lid and BaseFisher15-182-701AVoor monsterverwerking en inbedding
HP Z440 WorkstationHPProductnummer: Y5C77US#ABAVoor histomorphometrische analyse en beeldvorming
Manual Rotary MicrotomeLeicaRM 2235Voor monstersneden
Marking pensLeica3801880Voor het labelen van monsters, cassettes en slides
OLYMPUS BX53 MicroscopeOLYMPUShttps://www.olympus-lifescience.com/en/microscopes/upright/bx53f2/Voor histomorphometrische analyse en beeldvorming
OLYMPUS DP 73 Microscope CameraOLYMPUShttps://www.olympus-lifescience.com/en/camera/color/dp73/Voor histomorphometrische analyse en beeldvorming (uit productie)
ORION STAR A211 pH meterThermo ScientificSTARA2110Voor de bereiding van decalcificatiebuffer
OsteoMeasure SoftwareOsteoMetricshttps://www.osteometrics.com/index.htmVoor histomorphometrische meting en analyse
Perfusion Two Automated Pressure Perfusion systemLeicaModel # 39471005Voor het oogsten van muizenknieën
PRISM 7 SoftwareGraphPadInstitutioneel toegangsaccountStatistische analyse
Safranin-O stainSIGMA Life SciencesS8884Voor monsterskleuring
ThinkBoneStage - Rotating Microscope StageThink Bone Consulting Inc. - OsteoMetrics (leverancier)http://thinkboneconsulting.com/index_files/Slideholder.phpVoor histomorphometrische analyse en beeldvorming
Wacom Pro Pen StylusWacomhttps://www.wacom.com/en-es/products/pen-displays/cintiq-27-qhd-touchVoor histomorphometrische analyse en beeldvorming
Weigerts Iron Hematoxylin AFisher5029713Voor hematoxylinskleuring
Weigerts Iron Hematoxylin BFisher5029714Voor hematoxylinskleuring

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Ma, V. Y., Chan, L., Carruthers, K. J. Incidence, prevalence, costs, and impact on disability of common conditions requiring rehabilitation in the United States: stroke, spinal cord injury, traumatic brain injury, multiple sclerosis, osteoarthritis, rheumatoid arthritis, limb loss, and back pain. Archives of Physical Medicine and Rehabililation. 95 (5), 986-995 (2014).
  2. Hopman, W., et al. Associations between chronic disease, age and physical and mental health status. Journal of Chronic Diseases in Canada. 29 (3), 108-116 (2009).
  3. Lorenz, J., Grässel, S. Experimental osteoarthritis models in mice. Mouse Genetics. Methods in Molecular Biology. Singh, S., Coppola, V. 1194, Humana Press. New York, NY. 401-419 (2004).
  4. Sophia Fox, A. J., Bedi, A., Rodeo, S. A. The basic science of articular cartilage: structure, composition, and function. Journal of Sports Health. 1 (6), 461-468 (2009).
  5. Van der Kraan, P., Van den Berg, W. Chondrocyte hypertrophy and osteoarthritis: role in initiation and progression of cartilage degeneration. Osteoarthritis and Cartilage. 20 (3), 223-232 (2012).
  6. Hodsman, A. B., et al. Parathyroid hormone and teriparatide for the treatment of osteoporosis: a review of the evidence and suggested guidelines for its use. Endocrine Reviews. 26 (5), 688-703 (2005).
  7. Pitsillides, A. A., Beier, F. Cartilage biology in osteoarthritis-lessons from developmental biology. Nature Reviews Rheumatology. 7 (11), 654(2011).
  8. Yuan, X., et al. Bone-cartilage interface crosstalk in osteoarthritis: potential pathways and future therapeutic strategies. Osteoarthritis and Cartilage. 22 (8), 1077-1089 (2014).
  9. Goldring, S. R., Goldring, M. B. Changes in the osteochondral unit during osteoarthritis: structure, function and cartilage-bone crosstalk. Nature Reviews Rheumatology. 12 (11), 632(2016).
  10. Martel-Pelletier, J., et al. Osteoarthritis. Nature Reviews Disease Primers. 2 (1), 16072(2016).
  11. Goldring, M. B., Otero, M. Inflammation in osteoarthritis. Current Opinion in Rheumatology. 23 (5), 471(2011).
  12. Sellam, J., Berenbaum, F. The role of synovitis in pathophysiology and clinical symptoms of osteoarthritis. Nature Reviews Rheumatology. 6 (11), 625(2010).
  13. Ma, H., et al. Osteoarthritis severity is sex dependent in a surgical mouse model. Osteoarthritis and Cartilage. 15 (6), 695-700 (2007).
  14. Katon, W., Lin, E. H., Kroenke, K. The association of depression and anxiety with medical symptom burden in patients with chronic medical illness. General Hospital Psychiatry. 29 (2), 147-155 (2007).
  15. Glasson, S., Chambers, M., Van Den Berg, W., Little, C. The OARSI histopathology initiative-recommendations for histological assessments of osteoarthritis in the mouse. Osteoarthritis and Cartilage. 18, 17-23 (2010).
  16. Pastoureau, P., Leduc, S., Chomel, A., De Ceuninck, F. Quantitative assessment of articular cartilage and subchondral bone histology in the meniscectomized guinea pig model of osteoarthritis. Osteoarthritis and Cartilage. 11 (6), 412-423 (2003).
  17. O'Driscoll, S. W., Marx, R. G., Fitzsimmons, J. S., Beaton, D. E. Method for automated cartilage histomorphometry. Tissue Engineering. 5 (1), 13-23 (1999).
  18. Matsui, H., Shimizu, M., Tsuji, H. Cartilage and subchondral bone interaction in osteoarthrosis of human knee joint: a histological and histomorphometric study. Microscopy Research Technique. 37 (4), 333-342 (1997).
  19. Hacker, S. A., Healey, R. M., Yoshioka, M., Coutts, R. D. A methodology for the quantitative assessment of articular cartilage histomorphometry. Osteoarthritis and Cartilage. 5 (5), 343-355 (1997).
  20. Pastoureau, P., Chomel, A. Methods for Cartilage and Subchondral Bone Histomorphometry. Cartilage and Osteoarthritis. Methods in Molecular Medicine. DeCeuninck, F., Sabatini, M., Pastoureau, P. 101, Humana Press. New York, NY. 79-91 (2004).
  21. McNulty, M. A., et al. A comprehensive histological assessment of osteoarthritis lesions in mice. Cartilage. 2 (4), 354-363 (2011).
  22. Glasson, S., Blanchet, T., Morris, E. The surgical destabilization of the medial meniscus (DMM) model of osteoarthritis in the 129/SvEv mouse. Osteoarthritis and Cartilage. 15 (9), 1061-1069 (2007).
  23. Singh, S. R., Coppola, V. Mouse Genetics: Methods and Protocols. , Humana Press. New York, NY. (2004).
  24. Fang, H., Beier, F. Mouse models of osteoarthritis: modelling risk factors and assessing outcomes. Nature Reviews Rheumatology. 10 (7), 413(2014).
  25. Culley, K. L., et al. Mouse Models of Osteoarthritis: Surgical Model of Posttraumatic Osteoarthritis Induced by Destabilization of the Medial Meniscus. Osteoporosis and Osteoarthritis. Methods in Molecular Biology. Westendorf, J., van Wijnen, A. 1226, Humana Press. New York, NY. 143-173 (2015).
  26. Van der Kraan, P. Factors that influence outcome in experimental osteoarthritis. Osteoarthritis and Cartilage. 25 (3), 369-375 (2017).
  27. Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole animal perfusion fixation for rodents. Journal of Visualized Experiments. (65), e3564(2012).
  28. Callis, G., Sterchi, D. Decalcification of bone: literature review and practical study of various decalcifying agents. Methods, and their effects on bone histology. Journal of Histotechnology. 21 (1), 49-58 (1998).
  29. Lajeunesse, D., Massicotte, F., Pelletier, J. P., Martel-Pelletier, J. Subchondral bone sclerosis in osteoarthritis: not just an innocent bystander. Modern Rheumatology. 13 (1), 0007-0014 (2003).
  30. Li, G., et al. Subchondral bone in osteoarthritis: insight into risk factors and microstructural changes. Arthritis Research Therapy. 15 (6), 223(2013).
  31. Kapoor, M., Martel-Pelletier, J., Lajeunesse, D., Pelletier, J. P., Fahmi, H. Role of proinflammatory cytokines in the pathophysiology of osteoarthritis. Nature Reviews Rheumatology. 7 (1), 33(2011).
  32. Scanzello, C. R., Goldring, S. R. The role of synovitis in osteoarthritis pathogenesis. Bone. 51 (2), 249-257 (2012).
  33. Benito, M. J., Veale, D. J., FitzGerald, O., van den Berg, W. B., Bresnihan, B. Synovial tissue inflammation in early and late osteoarthritis. Annals of the Rheumatic Diseases. 64 (9), 1263-1267 (2005).
  34. De Lange-Brokaar, B. J., et al. Synovial inflammation, immune cells and their cytokines in osteoarthritis: a review. Osteoarthritis and Cartilage. 20 (12), 1454-1499 (2012).
  35. Findlay, D. M., Kuliwaba, J. S. Bone-cartilage crosstalk: a conversation for understanding osteoarthritis. Bone Research. 4, 16028(2016).
  36. Lories, R. J., Luyten, F. P. The bone-cartilage unit in osteoarthritis. Nature Reviews Rheumatology. 7 (1), 43(2011).
  37. Pritzker, K. P., et al. Osteoarthritis cartilage histopathology: grading and staging. Journal of Osteoarthritis and Cartilage. 14 (1), 13-29 (2006).
  38. Hayami, T., et al. Characterization of articular cartilage and subchondral bone changes in the rat anterior cruciate ligament transection and meniscectomized models of osteoarthritis. Bone. 38 (2), 234-243 (2006).
  39. Priemel, M., et al. mineralization defects and vitamin D deficiency: Histomorphometric analysis of iliac crest bone biopsies and circulating 25-hydroxyvitamin D in 675 patients. Journal of Bone and Mineral Research. 25 (2), 305-312 (2010).
  40. Yukata, K., et al. Continuous infusion of PTH 1–34 delayed fracture healing in mice. Scientific Reports. 8 (1), 13175(2018).
  41. Kawano, T., et al. LIM kinase 1 deficient mice have reduced bone mass. Bone. 52 (1), 70-82 (2013).
  42. Zhang, L., Chang, M., Beck, C. A., Schwarz, E. M., Boyce, B. F. Analysis of new bone, cartilage, and fibrosis tissue in healing murine allografts using whole slide imaging and a new automated histomorphometric algorithm. Bone Research. 4, 15037(2016).
  43. Wu, Q., et al. Induction of an osteoarthritis-like phenotype and degradation of phosphorylated Smad3 by Smurf2 in transgenic mice. Arthritis Rheumatism. 58 (10), 3132-3144 (2008).
  44. Hordon, L., et al. Trabecular architecture in women and men of similar bone mass with and without vertebral fracture: I. Two-dimensional histology. Bone. 27 (2), 271-276 (2000).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Muismodel voor artrosehistomorfometrische analysemeting van het kraakbenoppervlakevaluatie van het subchondrale botkwantificering van het osteofytische oppervlakbeoordeling van de synoviale diktetelling van het aantal chondrocytenberekening van de fibrillatie indexDMM ge nduceerde artrosekwantitatieve gewrichtsbeoordeling

Gerelateerde artikelen