Kanker is een dodelijke ziekte als gevolg van zijn vermogen om uitzaaiingen naar verschillende organen. Het bepalen van het vermogen van kankercellen om te migreren en binnen te vallen onder verschillende behandelingsvoorwaarden is cruciaal voor het beoordelen van therapeutische strategieën. Dit protocol presenteert een methode om de real-time gemetastaseerde vermogens van een glioblastoom kanker cellijn te beoordelen.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Impedantie-gebaseerde Real-time meting van kanker cel migratie en invasie
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Kanker ontstaat als gevolg van ongecontroleerde proliferatie van cellen geïnitieerd door genetische instabiliteit, mutaties, en milieu-en andere stressfactoren. Deze verworven afwijkingen in complexe, meerlaagse moleculaire signaleringsnetwerken veroorzaken afwijkende celproliferatie en overleving, extracellulaire matrixafbraak en metastase naar verre organen. Naar schatting wordt ongeveer 90% van de sterfgevallen ten gevolge van kanker veroorzaakt door de directe of indirecte effecten van de uitgezaaide verspreiding. Daarom is het belangrijk om een zeer betrouwbaar, uitgebreid systeem op te zetten om het gedrag van kankercellen te karakteriseren bij genetische en milieumanipulaties. Een dergelijk systeem kan een duidelijk inzicht geven in de moleculaire regulatie van kankermetastase en de mogelijkheid voor een succesvolle ontwikkeling van gelaagde, nauwkeurige therapeutische strategieën. Vandaar, nauwkeurige bepaling van kankercel gedrag zoals migratie en invasie met winst of verlies van functie van gen(en) maakt beoordeling van de agressieve aard van kankercellen. Het real-time meetsysteem op basis van celimpedantie stelt onderzoekers in staat om tijdens een heel experiment voortdurend gegevens te verzamelen en de resultaten direct te vergelijken en te kwantificeren onder verschillende experimentele omstandigheden. In tegenstelling tot conventionele methoden vereist deze methode geen fixatie, kleuring en monsterverwerking om cellen te analyseren die migreren of binnenvallen. Deze methode papier benadrukt gedetailleerde procedures voor real-time bepaling van migratie en invasie van glioblastoom kankercellen.
Inleiding
Kanker is een dodelijke ziekte als gevolg van zijn vermogen om uitzaaiingen naar verschillende organen. Het bepalen van kanker genotypes en fenotypes is van cruciaal belang voor het begrijpen en ontwerpen van effectieve therapeutische strategieën. Decennia van kankeronderzoek hebben geleid tot de ontwikkeling en aanpassing van verschillende methoden om kankergenotypes en fenotypes te bepalen. Een van de laatste technische ontwikkelingen is real-time meting van celmigratie en invasie op basis van celimpedantie. Celhechting aan substraten en celcelcontacten speelt een belangrijke rol bij cel-naar-cel communicatie en regulatie, ontwikkeling en onderhoud van weefsels. Afwijkingen in celhechting leiden tot het verlies van celcelcontact, afbraak van extracellulaire matrix (ECM) en winst van migratie- en binnenvallende vermogens door cellen, die allemaal bijdragen aan metastase van kankercellen naar verschillende organen1,2. Er zijn verschillende methoden beschikbaar om celmigratie (wondgenezing en Boyden-kamertesten) en invasie (Matrigel-Boyden kamertest)3,4,5te bepalen. Deze conventionele methoden zijn semikwantitatief omdat cellen moeten worden gelabeld met een fluorescerende kleurstof of andere kleurstoffen, hetzij voor of na het experiment om celfenotypes te meten. Bovendien zijn mechanische verstoringen in sommige gevallen nodig voor het maken van een wond voor het meten van de migratie van cellen naar de wondplaats. Bovendien zijn deze bestaande methoden tijdrovend, arbeidsintensief en meten ze de resultaten op slechts één eenmalig punt. Bovendien zijn deze methoden gevoelig voor het maken van onjuiste metingen als gevolg van inconsistente behandeling tijdens de experimentele procedure6.
In tegenstelling tot conventionele methoden meet het real-time celanalysesysteem celimpedantie in real-time zonder pre- of poststaining en mechanische schade van cellen. Wat nog belangrijker is, kan de duur van een experiment worden uitgebreid zodat de biologische gevolgen op een tijd-afhankelijke manier kunnen worden bepaald. Het uitvoeren van het experiment is tijdefficiënt en niet arbeidsintensief. Het analyseren van gegevens is relatief eenvoudig en nauwkeurig. In vergelijking met andere methoden is deze methode een van de beste real-time metingen om celmigratie en invasie6,7,8,9te meten .
Giaever en Keese waren de eersten die de impedantie-gebaseerde meting van een celpopulatie op het oppervlak van elektroden10beschreven. Het real-time celanalysesysteem werkt volgens hetzelfde principe. Het gebied van elke microplaat put is ongeveer 80% bedekt met een array van gouden micro-elektroden. Wanneer het elektrodeoppervlak door cellen wordt bezet als gevolg van hechting of verspreiding van de cellen, verandert de elektrische impedantie. Deze impedantie wordt weergegeven als de celindex, die direct evenredig is met de cellen die het elektrodeoppervlak bedekken nadat ze het microporeuze membraan binnendringen (de mediane poriegrootte van dit membraan is 8 μm)11.
Crk en CrkL zijn adaptereiwitten die SH2- en SH3-domeinen bevatten en spelen een belangrijke rol in verschillende cellulaire functies, zoals cytoskeletregulatie, celtransformatie, proliferatie, hechting, epitheel-mesenchymale overgang, migratie, invasie en metastase door te bemiddelen eiwit-eiwit interacties in vele signaleringstrajecten1,12,1313,14,15,16,17, 18. Daarom is het belangrijk om de Crk /CrkL-afhankelijke migratie- en invasieve vermogens van kankercellen te bepalen. Real-time celanalyse werd uitgevoerd om de migratie- en invasieve vermogens van glioblastoomcellen te bepalen bij genknockdown van Crk en CrkL.
Deze methode paper beschrijft gedetailleerde metingen van Crk- en CrkL-gemedieerde migratie en invasie van menselijke glioblastoom cellen.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
LET OP: Alle celkweekmaterialen moeten steriel zijn en het hele experiment moet onder steriele omstandigheden in een bioveiligheidskast worden uitgevoerd.
1. Cultuur en elektroporatie van de U-118MG Glioblastoom Cell Line
- Kweek de U-118MG cellijn in 5% foetaal runderserum (FBS) met Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) (kweekmedium) en Houd op 37 °C in een vochtige atmosfeer met 5% CO2 incubator (kweekomstandigheden).
- Gebruik 70– 80% confluent gezonde cellen voor elektroporatie.
- Voor het oogsten van cellen, was de cellen groeien in kweekgerechten met 1x PBS en voeg 2 mL van 0,05% trypsin-EDTA. Plaats in de couveuse voor 30 s en verwijder de trypsin-EDTA. Verzamel cellen in het kweekmedium in een buis van 15 mL.
- Tel de cellen met behulp van een handheld geautomatiseerde celteller, centrifugeer cellen op 100 x g gedurende 5 min en gooi de supernatant weg.
- Hang de celpellet op in het kweekmedium en neem 600.000 cellen voor elke aandoening in een microcentrifugebuis. Pas het celnummer aan op basis van experimentele ontwerpen en groeipercentages.
- Breng de celsuspensie over op een microcentrifugebuis en voeg 800 μL van Dulbecco's fosfaatgebufferde zoutoplossing (DPBS) toe. Draai naar beneden met behulp van een minicentrifuge voor 30 s en gooi de supernatant weg.
- Voeg 60 μL resuspensiebuffer R toe aan de celpellet en voeg de siRNAs (d.w.z. niet-targeting siRNA, Crk siRNA, CrkL siRNA of zowel Crk als CrkL siRNAs) toe bij een concentratie van 6 μM aan de respectievelijke microcentrifugebuis. Meng ze voorzichtig door te tikken.
- Elektroporate 10 μL cellen met een elektroporratiesysteem bij 1.350 V voor 10 ms met drie pulsen en breng de geëlektroereerde cellen over in 5 mL van het kweekmedium. Herhaal de elektroporatie voor de rest van de cellen voorbereid voor elke aandoening.
- Voltooi alle respectievelijke elektroporatie. Breng geëlektrorated cellen in twee 35 mm gerechten per conditie en kweek ze onder kweekomstandigheden gedurende 3 dagen.
- Behandel op de derde dag alle geëlektrorated cellen in 0,5% FBS met DMEM (laag serummedium) gedurende 6 uur voorafgaand aan de werkelijke celimpedantiemeting.
2. Voorbereiding van het real-time celanalysesysteem, de plaat van celinvasie en migratie (CIM) en de geëporated U-118MG-cellen voor plating
- Plaats het real-time celanalysesysteem 5-6 uur voor de start van het experiment in een CO2-incubator onder kweekomstandigheden om het systeem te stabiliseren volgens de kweekomstandigheden.
- Voor de invasietest, plaat 50 μL DMEM (gewoon medium) met extracellulaire matrix (ECM) gel op 0,1 μg/μL in elke put van de bovenste kamer van de CIM-plaat. Om te voorkomen dat er luchtbellen, gebruik maken van de omgekeerde pipettermethode. Verwijder onmiddellijk 30 μL ECM-gel, waardoor er 20 μL in de put achterblijft.
- Na de ECM gel coating, bewaar de plaat in de couveuse onder kweekomstandigheden voor 4 uur met zijn deksel op. Neem tijdens de ECM-gelcoating en het drogen preventieve maatregelen om direct contact te voorkomen van de elektroden van de bovenste2 kamer van de platen met de handen, de oppervlakken van de bioveiligheidskast of de CO 2-incubator.
- Als u het impedantiemetprogramma wilt instellen, dubbelklikt u op het bijbehorende softwarepictogram (zie Tabel met materialen)om de systeemsoftwaretoepassing (besturingseenheid) te openen. Elke wieg heeft een individueel venster met verschillende tabbladen om de experimentele omstandigheden, de impedantie meten tijdinterval en duur, en data-analyse.
- Stel onder het tabblad Indeling vierdubbele putten in voor elke biologische toestand en stel tweestapscelimpedantiemetingen in onder het tabblad Planning. De eerste stap is voor een eenmalige nulmeting (één sweep met een interval van 1 min), en de tweede stap is het meten van de celimpedantie in de respectieve individuele wiegen voor een daadwerkelijk experiment. Voor migratie, gebruik 145 sweeps met een 10 min interval, en voor invasie, 577 sweeps met een 10 min interval, individueel ingesteld) in de respectieve individuele wiegen.
- Een h voor het begin van de celimpedantiemet, voeg 160 μL DMEM toe met 10% FBS als chemoattractant in de putten van de onderste kamer van de plaat. Monteer ofwel de bovenste kamer met de ECM gel-gecoate putten of ongecoate putten met de onderste kamer om invasie en migratie te meten, respectievelijk.
- Vul de putten in de bovenste kamer met 50 μL laag serummedium en plaats ze in de wieg van het systeem. Controleer of alle putten door de besturingseenheid worden herkend door op het tabblad Bericht te klikken. Als het bericht als OK wordtweergegeven, is de plaat in de houder klaar voor het experiment.
- Preincubeer de volledig verpakte platen in de couveuse onder kweekomstandigheden gedurende 1 uur voorafgaand aan metingen in de wieg van het real-time celanalysesysteem, wat essentieel is voor de acclimatisatie van een verpakte plaat aan de celkweekomstandigheden.
- Voor het oogsten van cellen behandeld met een laag serum medium, trypsinize de cellen als in stap 1.3, verzamelen ze in een laag serum medium, en tellen de cellen als in stap 1.4.
- Centrifugeer na het tellen de cellen op 100 x g gedurende 5 min en gooi de supernatant weg.
- Resuspend 800,000 cellen in 800 μL van laag serum medium voor de migratie en invasie testen. Bovendien, resuspend 300.000 cellen in 2 mL van cultuur medium en zaad in een 35 mm schotel voor westerse vlek analyse om de gereguleerde knockdown van Crk en CrkL te bevestigen.
3. Basislijnlezing, Zaaien van de cellen en celimpedantiemeting en visualisatie
- Meet de basislijnmeting door op de knop Start van de wieg te klikken. De basislijn moet worden gelezen na het voorincubatie van de platen gedurende 1 uur in de wieg van het real-time celanalysesysteem onder kweekomstandigheden in de CO2-incubator en voordat de cellen naar de respectievelijke putten in de bovenste kamer worden gesijpeld.
LET OP: Zodra op de startknop van de wieg is geklikt, vraagt de besturingseenheid of het experimentele bestand moet worden opgeslagen. Nadat het bestand is opgeslagen, meet de cradle analyzer de basislijncelimpedantie zoals ingesteld in het programma in eerste instantie en gaat een pauzemodus in totdat de startknop van de wieg opnieuw wordt geklikt om celimpedantie in de tweede stap te meten. - Haal beide platen voor migratie en invasie uit de wiegen na de nulmeting en bewaar ze in de bioveiligheidskast.
- Zaad 100 μL cellen (100.000 cellen) in quadruplicaten voor elke biologische toestand in de bovenste kamer van de CIM-plaat in de respectieve putten, zoals geprogrammeerd in de controle-eenheid van de wieg door omgekeerde pipetteren om luchtbellen te voorkomen.
- Na het zaaien, houd de plaat onder een bioveiligheidskast gedurende 30 min bij kamertemperatuur, zodat cellen gelijkmatig tot de bodem kunnen settelen. Breng de plaat terug naar de desbetreffende wieg en klik op de startknop van de wieg om te beginnen met het meten van celimpedantie zoals geprogrammeerd in de tweede stap van 2,5.
- Na de laatste sweep is het experiment voltooid en worden de resultaten automatisch opgeslagen.
- Visualiseer onder het tabblad Gegevensanalyse de wijzigingen in celimpedantie als celindex op een tijdsafhankelijke manier tijdens of na voltooiing van het experiment. Elk van de respectieve voorwaarden van quadruplicaten kan individueel of als gemiddelden en/of standaarddeviaties worden gevisualiseerd door op de optievakken voor gemiddelde en standaarddeviatie te klikken.
- Als u celindexgegevens wilt exporteren naar een spreadsheetbestand, opent u een leeg spreadsheetbestand, plaatst u de cursor in het midden van het venster Gegevensanalyse en klikt u met de rechtermuisknop. Kies in het dialoogvenster dat wordt weergegeven de optie Gegevens kopiëren naar lijstindelingen plak de gegevens in de geopende spreadsheet.
- Pas de tijd in de ruwe gegevens aan om de werkelijke begintijd van de celimpedantiemeting weer te geven. De begintijd van de tweede stap is ingesteld als nul.
LET OP: De besturingseenheid heeft de mogelijkheid om de celindex met of zonder normalisatie te verkrijgen (d.w.z. genormaliseerde celindex) en de resultaten op een tijdsafhankelijke manier te visualiseren als een grafische presentatie. In dit voorbeeld worden celindexgegevens geëxporteerd zonder normalisatie voor verwerking en grafische presentatie. - Laat het experiment los door op de knop Loslaten in elke houder te klikken.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Er is gesuggereerd dat Crk en CrkL belangrijk zijn voor celmigratie en invasie in verschillende kankercellenlijnen 13,17. Hoewel Crk en CrkL eiwitten zijn structureel en functioneel op elkaar en spelen essentiële overlappende functies16,19,20,21, veel gen knockdown studies voor Crk en CrkL hebben niet duidelijk aangepakt of de knockdown...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
De real-time meting van celmigratie en -invasie met behulp van het real-time celanalysesysteem is een eenvoudig, snel en continu bewakingsproces met meerdere, significante voordelen ten opzichte van de traditionele methoden die gegevens op één enkel tijdspunt leveren. Net als bij de traditionele methoden moeten experimentele omstandigheden worden geoptimaliseerd voor elke cellijn voor het real-time celanalysesysteem, omdat elke cellijn kan verschillen in termen van hechting aan het substraat, de groei, de cel-naar-celcon...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs hebben niets te onthullen.
Dankbetuigingen
Wij danken Olivia Funk voor haar technische hulp bij de real-time cel analyse systeem gegevens. We danken ook het Medical Writing Center van Children's Mercy Kansas City voor het bewerken van dit manuscript. Dit werk werd ondersteund door Tom Keaveny Endowed Fund for Pediatric Cancer Research (to TP) en door Children's Mercy Hospital Midwest Cancer Alliance Partner Advisory Board financiering (to TP).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| Biosafety cabinet | ThermoFisher Scientific | 1300 Series Class II, Type A2 | |
| CIM plates | Cell Analysis Division of Agilent Technologies, Inc | 5665825001 | Cell invasion and migration plates |
| Crk siRNA | Dharmacon | J-010503-10 | |
| CrkL siRNA | Ambion | ID: 3522 and ID: 3524 | |
| Dulbecco’s modified eagle’s medium (DMEM) | ATCC | 302002 | Culture medium used for cell culture |
| Dulbecco's phosphate-buffered saline (DPBS) | Gibco | 21-031-CV | DPBS used to wash the cells |
| Fetal bovine serum (FBS) | Hyclone | SH30910.03 | |
| Heracell VIOS 160i CO2 incubator | ThermoFisher Scientific | 51030285 | CO2 incubator |
| Matrigel | BD Bioscience | 354234 | Extracellular matrix gel |
| Neon electroporation system | ThermoFisher Scientific | MPK5000 | Electroporation system |
| Neon transfection system 10 µL kit | ThermoFisher Scientific | MPK1025 | Electroporation kit |
| Non-targeting siRNA | Dharmacon | D-001810-01 | siRNA for non targated control |
| Odyssey CLx (Imaging system) | LI-COR Biosciences | Western blot imaging system | |
| RTCA software | Cell Analysis Division of Agilent Technologies, Inc | Instrument used for experiment | |
| Scepter | Millipore | C85360 | Handheld automated cell counter |
| Trypsin-EDTA | Gibco | 25300-054 | |
| U-118MG | ATCC | ATCC HTB15 | Cell lines used for experiments |
| xCELLigence RTCA DP | Cell Analysis Division of Agilent Technologies, Inc | 380601050 | Instrument used for experiment |
Referenties
- Park, T., Koptyra, M., Curran, T. Fibroblast Growth Requires CT10 Regulator of Kinase (Crk) and Crk-like (CrkL). Journal of Biological Chemistry. 291 (51), 26273-26290 (2016).
- Hanahan, D., Weinberg, R. A. Hallmarks of cancer: the next generation. Cell. 144 (5), 646-674 (2011).
- Mudduluru, G., et al. Regulation of Axl receptor tyrosine kinase expression by miR-34a and miR-199a/b in solid cancer. Oncogene. 30 (25), 2888-2899 (2011).
- Mudduluru, G., Vajkoczy, P., Allgayer, H. Myeloid zinc finger 1 induces migration, invasion, and in vivo metastasis through Axl gene expression in solid cancer. Molecular Cancer Research. 8 (2), 159-169 (2010).
- Khalili, A. A., Ahmad, M. R. A Review of Cell Adhesion Studies for Biomedical and Biological Applications. International Journal of Molecular Sciences. 16 (8), 18149-18184 (2015).
- Katt, M. E., Placone, A. L., Wong, A. D., Xu, Z. S., Searson, P. C. In Vitro Tumor Models: Advantages, Disadvantages, Variables, and Selecting the Right Platform. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 4, 12(2016).
- Hamidi, H., Lilja, J., Ivaska, J. Using xCELLigence RTCA Instrument to Measure Cell Adhesion. Bio Protocols. 7 (24), 2646(2017).
- Scrace, S., O'Neill, E., Hammond, E. M., Pires, I. M. Use of the xCELLigence system for real-time analysis of changes in cellular motility and adhesion in physiological conditions. Methods in Molecular Biology. 1046, 295-306 (2013).
- Kumar, S., et al. Crk Tyrosine Phosphorylation Regulates PDGF-BB-inducible Src Activation and Breast Tumorigenicity and Metastasis. Molecular Cancer Research. 16 (1), 173-183 (2018).
- Giaever, I., Keese, C. R. Monitoring fibroblast behavior in tissue culture with an applied electric field. Proceeding of the National Academy of Science U. S. A. 81 (12), 3761-3764 (1984).
- Tiruppathi, C., Malik, A. B., Del Vecchio, P. J., Keese, C. R., Giaever, I. Electrical method for detection of endothelial cell shape change in real time: assessment of endothelial barrier function. Proceedings of the National Academy of Sci U.S.A. 89 (17), 7919-7923 (1992).
- Collins, T. N., et al. Crk proteins transduce FGF signaling to promote lens fiber cell elongation. Elife. 7, (2018).
- Fathers, K. E., et al. Crk adaptor proteins act as key signaling integrators for breast tumorigenesis. Breast Cancer Research. 14 (3), 74(2012).
- Koptyra, M., Park, T. J., Curran, T. Crk and CrkL are required for cell transformation by v-fos and v-ras. Molecular Carcinogenesis. 55 (1), 97-104 (2016).
- Lamorte, L., Royal, I., Naujokas, M., Park, M. Crk adapter proteins promote an epithelial-mesenchymal-like transition and are required for HGF-mediated cell spreading and breakdown of epithelial adherens junctions. Molecular Biology of the Cell. 13 (5), 1449-1461 (2002).
- Park, T. J., Curran, T. Essential roles of Crk and CrkL in fibroblast structure and motility. Oncogene. 33 (43), 5121-5132 (2014).
- Rodrigues, S. P., et al. CrkI and CrkII function as key signaling integrators for migration and invasion of cancer cells. Molecular Cancer Research. 3 (4), 183-194 (2005).
- Feller, S. M. Crk family adaptors-signalling complex formation and biological roles. Oncogene. 20 (44), 6348-6371 (2001).
- Park, T. J., Boyd, K., Curran, T. Cardiovascular and craniofacial defects in Crk-null mice. Molecular and Cellular Biology. 26 (16), 6272-6282 (2006).
- Park, T. J., Curran, T. Crk and Crk-like play essential overlapping roles downstream of disabled-1 in the Reelin pathway. Journal of Neuroscience. 28 (50), 13551-13562 (2008).
- Hallock, P. T., et al. Dok-7 regulates neuromuscular synapse formation by recruiting Crk and Crk-L. Genes & Development. 24 (21), 2451-2461 (2010).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
