Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Een 3D Spheroid Model voor Glioblastoom

17.9K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/60998

⸱

9 april 2020

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1University Bordeaux, LAMC, 2INSERM U1029, University Bordeaux, 3Department of Biomedicine, University of Bergen, 4CNRS, IBGC UMR5095, 5LP2N, CNRS UMR 5298, IOA, 6Institut d'Optique Graduate School, IOA

In dit artikel

Samenvatting

Hier beschrijven we een gebruiksvriendelijke invasietest voor glioblastoom. Deze test is geschikt voor glioblastoom stamcellen-achtige cellen. Een Fiji macro voor eenvoudige kwantificering van invasie, migratie en proliferatie wordt ook beschreven.

Samenvatting

Tweedimensionale (2D) celculturen bootsen in vivo tumorgroei niet naar tevredenheid na. Daarom werden driedimensionale (3D) cultuursferoïde modellen ontwikkeld. Deze modellen kunnen bijzonder belangrijk zijn op het gebied van neuro-oncologie. Inderdaad, hersentumoren hebben de neiging om de gezonde hersenomgeving binnen te dringen. We beschrijven hierin een ideale 3D glioblastoom sferoïde-gebaseerde test die we ontwikkelden om tumorinvasie te bestuderen. Wij bieden alle technische details en analytische tools om deze test succesvol uit te voeren.

Inleiding

In de meeste studies met behulp van primaire of commercieel beschikbare cellijnen, tests worden uitgevoerd op cellen geteeld op plastic oppervlakken als monolayer culturen. Het beheren van celcultuur in 2D betekent nadelen, omdat het geen in vivo 3D-celomgeving nabootst. In 2D-culturen is het hele celoppervlak direct in contact met het medium, waardoor de celgroei verandert en de beschikbaarheid van geneesmiddelen wordt gewijzigd. Bovendien activeert het niet-fysiologische kunststofoppervlak celdifferentiatie1. Driedimensionale cultuurmodellen zijn ontwikkeld om deze moeilijkheden te overwinnen. Ze hebben het voordeel van het nabootsen van de meercellige architectuur en heterogeniteit van tumoren2, en dus kan worden beschouwd als een meer relevant model voor vaste tumoren3. De complexe morfologie van sferoïden draagt bij aan een betere evaluatie van medicijnpenetrantie en resistentie4. De tumor heterogeniteit in de sferoïde beïnvloedt de verspreiding van zuurstof en voedingsstoffen, en de reactie op farmacologische middelen (Figuur 1A). Verspreiding van zuurstof wordt gewijzigd wanneer de sferoïde grootte 300 μm bereikt, wat leidt tot een hypoxische omgeving in het midden van de sferoïde (Figuur 1A, C). Metabolieten zijn ook minder penetrerendoor de cellagen en compenserende metabole reacties vinden plaats5. Wanneer de diameter van de sferoïde toeneemt, kunnen necrotische kernen worden waargenomen, waardoor verdere nabootsing van kenmerken die bij veel vaste vormen van kanker worden gevonden, waaronder het agressieve hersenkankerglioblastoom (GBM)6.

Verschillende 2D of 3D invasie testen voor glioblastoom zijn gemeld in de literatuur7,8. Tweedimensionale testen zijn voornamelijk voor het bestuderen van invasie in een horizontaal vlak op een dunne matrixlaag of in een Boyden kamer test9. Driedimensionale tests zijn beschreven met 3D sferoïde culturen met behulp van klassieke glioblastoom cellijnen10. Meer complexe varianten worden vertegenwoordigd door invasie van hersenorganoïden door tumorsferoïden in confrontatieculturen11. Het is echter nog steeds belangrijk om een gebruiksvriendelijke en reproduceerbare test te ontwikkelen die voor elk laboratorium beschikbaar is. We hebben een protocol ontwikkeld om glioblastoom stamcellen-achtige cellen te genereren uit patiëntmonsters. De kwantificering van deze tests is gemakkelijk beheersbaar en vereist alleen open-access online software. Kortom, tumorstukjes worden in kleine stukjes gesneden en enzymatisch verteerd. Enkele cellen afkomstig van de spijsvertering worden gekweekt in neurobasaal medium. Na 4-7 dagen vormen sferoïde structuren zich spontaan. Bij intracraniale implantatie in muizenmodellen vormen ze tumoren die een necrotische kern vertonen die wordt omringd door pseudo-palisadecellen12. Dit lijkt sterk op de kenmerken van GBM-patiënten.

In dit artikel beschrijven we ons protocol om sferoïden te produceren uit een bepaald aantal cellen om reproduceerbaarheid te garanderen. Hiervoor kunnen twee complementaire matrices worden gebruikt: Matrigel en collageen type I. Matrigel is verrijkt met groeifactoren en bootst het basale basale membraan van zoogdieren na dat nodig is voor celhechting en migratie. Aan de andere kant, collageen type I, een structureel element van stroma, is de meest voorkomende fibrillaire extracellulaire matrix en wordt gebruikt in cel invasie testen. Hierin illustreren we ons GBM sferoïde model door migratie- en proliferatietesten uit te voeren. Analyse werd niet alleen gedaan op vaste tijdpunten, maar ook door het monitoren van sferoïde expansie en celbeweging door live beeldvorming. Bovendien werd elektronenmicroscopie gedaan om morfologische details te visualiseren.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

Geïnformeerde schriftelijke toestemming werd verkregen van alle patiënten (van het Haukeland Ziekenhuis, Bergen, Noorwegen volgens de lokale ethische commissie regelgeving). Ons protocol volgt de richtlijnen van de ethische commissie voor onderzoek van onze instelling.

1. Generatie van uniforme grootte tumor sferoïden

OPMERKING: Stam-achtige cellen worden gekweekt in neurobasaal medium aangevuld met B27 supplement, heparine, FGF-2, penicilline, en streptomycine, zoals beschreven in eerdere artikelen12. Deze cellen vormen spontaan sferoïden in de cultuur.

  1. Was de tumorcellen met 5 mL fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) en incubeer de cellen met 0,5-1 mL dissociatieenzym (zie Tabel van materialen)gedurende 5 minuten bij 37 °C.
  2. Was met 4-4,5 mL PBS en voeg 10 mL van het volledige groeimedium toe (compleet neurobasaal medium, cNBM).
  3. Tel de cellen met behulp van een automatische teltechniek met trypan blauw en een cel tellen kamer dia.
  4. Voor het genereren van 100 sferoïden met 104 cellen per sferoïde (volgens de gewenste grootte), meng 106 cellen in 8 mL NBM met 2 mL van 2% methylcellulose.
  5. Breng de suspensie over in een steriele systeemcontainer en doseer 100 μL/well met een meerkanaals pipet in een 96-putronde bodemplaat.
  6. De plaat uitbroeden bij 37 °C, 5% CO2 en 95% luchtvochtigheid. Gelijke grootte sferoïden zal vormen en kan worden gebruikt na 3-4 dagen.

2. Driedimensionale experimenten

  1. Proliferatie
    1. Voorbereiding
      1. Hang remmers (bijvoorbeeld rotenone zoals in figuur 4A)en chemicaliën in 100 μL medium en voeg toe aan de 100 μL medium in elke put (dat wil zeggen, een sferoïde per put).
      2. Incubeer de plaat bij 37 °C, 5% CO2en 95% luchtvochtigheid.
    2. Beeldverwerving en -analyse
      1. Maak foto's met een videomicroscoop in brightfield om een reeks voorwaarden te creëren bij T0 en de volgende verwachte tijden.
      2. Gebruik Fiji om foto's handmatig of op een semigeautomatiseerde manier te analyseren. Om dit handmatig te doen, tekent u een cirkel rond de sferoïde kern met het keuzegereedschap uit de vrije hand en meet u het gebied van elke sferoïde. Als u de afbeeldingen op een semigeautomatiseerde manier wilt analyseren, gebruikt u de macro die wordt weergegeven in Aanvullend document 1 met alleen het kerngebied.
  2. Invasie
    1. Voorbereiding
      1. Bereid de collageenmatrix in een buis op ijs met collageen van type I bij 1 mg/mL eindconcentratie, 1x PBS, 0,023xVcollageen,1 M natriumhydroxide en steriele H2O. Incubeer de oplossing op ijs gedurende 30 min.
      2. Verzamel sferoïden van de ronde bodemputplaat in 500 μL buizen en was 2x met 200 μL 1x PBS.
      3. Pipetteer de sferoïden voorzichtig in 100 μL van de collageenmatrix en steek in het midden van een put in normale 96 putplaten.
      4. Incubeer de collageengel gedurende 30 min bij 37 °C en voeg vervolgens cNBM bovenop de gel toe. Remmers of activators (bijvoorbeeld waterstofchloride zoals aangegeven in figuur 4B, 4C)kunnen in deze stap aan het medium worden toegevoegd.
    2. Beeldverwerving en -analyse
      1. Neem foto's sequentieel met een videomicroscoop in brightfield-modus 24 uur na collageenopname.
      2. Gebruik Fiji om foto's handmatig of op een semigeautomatiseerde manier te analyseren. Om dit handmatig te doen, teken je rond de kern en het totale gebied van de sferoïde met het keuzegereedschap uit de vrije hand en meet je het invasieve gebied van elke sferoïde door het totale gebied met kerngebied af te trekken. Als u de beelden op een semigeautomatiseerde manier wilt analyseren, gebruikt u de macro zoals aangegeven in Aanvullend Document 1 om het invasieve gebied te bepalen.
  3. Migratie
    1. Voorbereiding
      1. Coat een 6 putplaat met Matrigel (0,2 mg/mL) in NBM gedurende 30 min bij 37 °C, verwijder vervolgens de Matrigel en voeg 2 mL cNBM toe.
      2. Breng sferoïden over in 50 μL cNBM van de ronde bodemputplaat naar de 6 putplaat.
      3. Incubeer de plaat bij 37 °C en wacht 30 min tot de sferoïden zich hechten.
      4. Na 24 uur incubatie, vlek met 10 ng/mL van Hoechst en 30 min incuberen bij 37 °C.
    2. Beeldverwerving en -analyse
      1. Verkrijgen van beelden met behulp van een video microscoop in brightfield. Een 405 nm laser wordt gebruikt voor visualisatie van Hoechst kleuring.
      2. Gebruik Fiji-software om foto's te analyseren en de macro uit te voeren zoals aangegeven in aanvullend document 1.
        LET OP: Het aanraken van de onderkant van de put of het volledig verwijderen van de supernatant beschadigt de sferoïden. Voor collageen type I gel behandeling, houd de gel op ijs om collageen polymerisatie te voorkomen, voeg geen zure component, omdat de verandering in de pH zal invloed hebben op de compactheid van de gel, en pipet cellen snel in het collageen om celdood en de afbraak van de gel te voorkomen.

3. Fiji Macro

OPMERKING: Fiji is een beeldanalyseprogramma ontwikkeld in het publieke domein waarmee de ontwikkeling van macro's de beeldanalyse kan versnellen. Handmatige analyse is ook mogelijk, maar dit is een langzaam proces en kan vooroordelen introduceren. Afbeeldingen kunnen worden geïmporteerd door drag-and-drop in de software en gekwantificeerd met de ROI Manager Tools-plug-in. De procedure die in deze studie wordt gebruikt, wordt hieronder beschreven:

  1. Het macrovenster openen: Plug-ins | Macro's | Interactieve tolk.
  2. Kopieer en plak de volgende aangepaste paarse lus. Houd de paarse zinnen en voeg de groene zinnen van belang (Aanvullend Document 1).
  3. Als u de hele reeks wilt analyseren, past u de parameters in het rood aan voor een specifieke kwantificering en voert u de macro uit met macro's | Voer Macro uit of druk op Ctrl+R.
  4. Controleer en pas indien nodig handmatig de regio van belang (ROI) aan.

4. Elektronenmicroscopie van sferoïden

LET OP: De meeste van de volgende stappen moeten worden gedaan in een chemische kap.

  1. Fixatiestap
    1. Verzamel de sferoïde met een gesneden pipettip, doe het in een buis van 1,5 mL en was 1x met 0,1 M fosfaatbuffer (PB).
    2. Fix the sferoid overnight at 4 °C in 2% glutaraldehyde/2% paraformaldehyde (PFA) in 0.1 M PB.
    3. Vervang de fixatieoplossing door een oplossing van 1% PFA in 0,1 M PB, gevolgd door monstervoorbereiding.
  2. Bereiding van het monster
    1. Breng de sferoïden in een zeef en leg ze in een glazen beker om sferoïde schade te voorkomen.
    2. Zorgvuldig 3x wassen met 0.1 M PB.
    3. Incubeer met osmium voor 2 uur in het donker. Verdun osmium tot 4% in 1% 0,1 M PB buffer.
    4. Zorgvuldig 3x wassen met 0.1 M PB.
      1. Dehydrateer als volgt: weken in 50% ethanol gedurende 10 min, 70% ethanol voor 10 min, 2x 90% ethanol voor 15 min, 2x 100% ethanol voor 20 min, en 2x aceton voor 30 min.
    5. Incubeer de monsters in een 50/50 mengsel van aceton/hars gedurende 2 uur. Bereid tijdens deze stap de EPON-hars voor (Embed-812: 11,25 g; DDSA: 9 g; NMA: 4,5 g).
    6. Gooi het aceton/harsmengsel weg, vervang de vers bereide hars en incubeer 's nachts.
    7. Vervang de hars door een nieuwe en incubeer tussen 2-6 uur.
    8. Voeg de sferoïden in hars in een mal bij 60 °C voor 48-72 uur.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Sferoïden werden voorbereid zoals beschreven in de protocollen sectie en waarnemingen werden gedaan met betrekking tot migratie, invasie, proliferatie, en microscopie. Om hypoxie in verschillende gebieden van de bolvormige structuur te meten, werd carboxische anhydrase IX-kleuring gebruikt voor het bepalen van hypoxische activiteit(figuur 1A-C). Meer CAIX-positieve cellen werden waargenomen in het sferoïde centrum (Figuur...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Tumor sferoïde testen zijn goed aangepast aan tumor kenmerken met inbegrip van proliferatie, invasie, en migratie, evenals celdood en drug reactie te bestuderen. Kankercellen dringen de 3D-matrix de vorming van een invasieve microtumor, zoals te zien in figuur 4B, C. Tijdens het invasieve proces kunnen matrix metalloproteinasen (MMP) matrices rondom tumorcellen13verteren , en MMP-remmers (bijvoorbeeld GM6001 of Rebimastat) de celinvasie schaden, maar ...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs verklaren dat zij geen concurrerende financiële belangen hebben.

Dankbetuigingen

Dit werk werd ondersteund door Transcan 2017, ARC 2017, Ligue Contre le Cancer (Comité de la Gironde et de la Charente-Maritime). Joris Guyon is een ontvanger van de beurs van het Toulouse University Hospital (CHU Toulouse).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
96 well round-bottom plateFalcon08-772-212
AccutaseGibcoA11105-01Opgeslagen bij 4 °C, sfeer dissociatie enzym
B27Gibco12587Opgeslagen bij -20 °C, ontdooi voor gebruik
Basic Fibroblast Growth FactorPeprotech100-18BOpgeslagen bij -20 °C, ontdooi voor gebruik
Countess Cell Counting Chamber SlidesInvitrogenC10283
DPBS 10XPan BiotechP04-53-500Opgeslagen bij 4 °C
Fiji softwareImageJGebruikt om foto's te analyseren
Flask 75 cm2Falcon10497302
MatrigelCorning354230Opgeslagen bij -20 °C, verdund tot een eindconcentratie van 0,2 mg/mL in koud NBM
MethylcelluloseSigmaM0512Verdund in NBM voor een eindconcentratie van 2%
NBMGibco21103-049Opgeslagen bij 4 °C
Neurobasal mediumGibco21103049Opgeslagen bij 4 °C
Penicillin - StreptomycinGibco15140-122Opgeslagen bij 4 °C
Trypan blue 0,4%ThermoFisherT10282Gebruikt voor celtelling
Type I CollagenCorning354236Opgeslagen bij 4 °C

Referenties

  1. Pelissier, F. A., et al. Age-related dysfunction in mechanotransduction impairs differentiation of human mammary epithelial progenitors. Cell Reports. 7, 1926-1939 (2014).
  2. Ishiguro, T., et al. Tumor-derived spheroids: Relevance to cancer stem cells and clinical applications. Cancer Science. 108, 283-289 (2017).
  3. Sutherland, R. M. Cell and environment interactions in tumor microregions: the multicell spheroid model. Science. 240, 177-184 (1988).
  4. Desoize, B., Jardillier, J. Multicellular resistance: a paradigm for clinical resistance? Critical Reviews in Oncology/Hematology. 36, 193-207 (2000).
  5. Corbet, C., Feron, O. Tumour acidosis: from the passenger to the driver's seat. Nature Reviews Cancer. 17, 577-593 (2017).
  6. Hirschhaeuser, F., et al. Multicellular tumor spheroids: an underestimated tool is catching up again. Journal of Biotechnology. 148, 3-15 (2010).
  7. Berens, E. B., Holy, J. M., Riegel, A. T., Wellstein, A. A Cancer Cell Spheroid Assay to Assess Invasion in a 3D Setting. Journal of Visualized Experiments. (105), e53409(2015).
  8. Cavaco, A. C. M., Eble, J. A. A 3D Spheroid Model as a More Physiological System for Cancer-Associated Fibroblasts Differentiation and Invasion In Vitro Studies. Journal of Visualized Experiments. (150), e60122(2019).
  9. Boye, K., et al. The role of CXCR3/LRP1 cross-talk in the invasion of primary brain tumors. Nature Communications. 8, 1571(2017).
  10. Dejeans, N., et al. Autocrine control of glioma cells adhesion and migration through IRE1alpha-mediated cleavage of SPARC mRNA. Journal of Cell Science. 125, 4278-4287 (2012).
  11. Golembieski, W. A., Ge, S., Nelson, K., Mikkelsen, T., Rempel, S. A. Increased SPARC expression promotes U87 glioblastoma invasion in vitro. International Journal of Developmental Neuroscience. 17, 463-472 (1999).
  12. Daubon, T., et al. Deciphering the complex role of thrombospondin-1 in glioblastoma development. Nature Communications. 10, 1146(2019).
  13. Friedl, P., Wolf, K. Tube travel: the role of proteases in individual and collective cancer cell invasion. Cancer Research. 68, 7247-7249 (2008).
  14. Das, A., Monteiro, M., Barai, A., Kumar, S., Sen, S. MMP proteolytic activity regulates cancer invasiveness by modulating integrins. Scientific Reports. 7, 14219(2017).
  15. Schaeffer, D., Somarelli, J. A., Hanna, G., Palmer, G. M., Garcia-Blanco, M. A. Cellular migration and invasion uncoupled: increased migration is not an inexorable consequence of epithelial-to-mesenchymal transition. Molecular and Cellular Biology. 34, 3486-3499 (2014).
  16. de Gooijer, M. C., Guillen Navarro, M., Bernards, R., Wurdinger, T., van Tellingen, O. An Experimenter's Guide to Glioblastoma Invasion Pathways. Trends in Molecular Medicine. 24, 763-780 (2018).
  17. Daubon, T., et al. The invasive proteome of glioblastoma revealed by laser-capture microdissection. Neuro-Oncology Advances. 1 (1), vdz029(2019).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Trefwoorden

3D sfero demodelglioblastoom invasieassaytumor sfero devormingcollageenmatrix invasiebrightfield confocale microscopieFiji beeldanalysecarbonic anhydrase IX kleuringmitochondriale ademhalingsketenhypoxische celproliferatieexpressie van de extracellulaire matrix
Een 3D Spheroid Model voor Glioblastoom
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleid

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.