Screening op fyto-oestrogenen met behulp van een celgebaseerde oestrogeenreceptor β Reporter Assay

Samenvatting

We hebben geoptimaliseerd een commercieel beschikbare oestrogeen receptor β reporter test voor het screenen van menselijk en niet-menselijk primaat voedsel voor oestrogene activiteit. We valideerden deze test door aan te tonen dat de bekende oestrogene soja voor menselijke voeding hoog registreert, terwijl andere voedingsmiddelen geen activiteit vertonen.

Samenvatting

Planten zijn een bron van voedsel voor veel dieren en ze kunnen duizenden chemicaliën produceren. Sommige van deze verbindingen beïnvloeden fysiologische processen in de gewervelde dieren die ze consumeren, zoals endocriene functie. Fyto-oestrogenen, de meest bestudeerde endocriene actieve fytochemicaliën, interageren direct met de hypothalamo-hypofyse gonadale as van het gewervelde endocriene systeem. Hier presenteren we het nieuwe gebruik van een celgebaseerde test om plantenextracten te screenen op de aanwezigheid van verbindingen die oestrogene biologische activiteit hebben. Deze test maakt gebruik van zoogdiercellen die zijn ontworpen om oestrogeenreceptor bèta (ERβ) sterk uit te drukken en die zijn getransfecteerd met een luciferase-gen. Blootstelling aan verbindingen met oestrogene activiteit resulteert in de cellen die licht produceren. Deze test is een betrouwbare en eenvoudige manier om te testen op biologische oestrogene activiteit. Het heeft verschillende verbeteringen ten opzichte van voorbijgaande transfectietests, met name het gebruiksgemak, de stabiliteit van de cellen en de gevoeligheid van de test.

Inleiding

Planten zijn een noodzakelijke bron van voedsel voor veel dieren en leveren calorieën en voedingsstoffen die van cruciaal belang zijn voor overleving, voortplanting, groei, ontwikkeling en gedrag¹. Planten produceren duizenden chemicaliën, veel als aanpassingen voor hun eigen groei, stomatisch onderhoud en reproductie. Andere verbindingen, beschouwd als secundaire metabolieten (PSM's) van planten, hebben functies die minder duidelijk zijn, hoewel sommige giftig zijn en waarschijnlijk worden gebruikt als verdediging tegen herbivoren en parasitisme (bijv. alkaloïden, tannines)^2,3. Sommige van deze chemische stoffen hebben het vermogen om fysiologische processen op lange termijn bij dieren te beïnvloeden, zoals endocriene werking, hoewel waarom deze endocriene actieve fytochemicaliën interageren met het gewervelde endocriene systeem nog steeds onduidelijk is^2,4.

Fyto-oestrogenen, de meest bestudeerde endocriene actieve fytochemicaliën, zijn polyfenolische PSM's die structureel en functioneel oestrogenen nabootsen, direct interagerend met de hypothalomo-hypofyse gonadale as van het gewervelde endocriene systeem⁵. Inname van fyto-oestrogenen in het menselijke dieet wordt geassocieerd met bescherming tegen sommige kankers, hartaandoeningen en menopauzesymptomen, hoewel andere effecten vruchtbaarheidsproblemen omvatten. In feite werden de fysiologische effecten van deze verbindingen ontdekt in de jaren 1940 toen onvruchtbaarheid bij schapen werd toegeschreven aan hun begrazing op fyto-oestrogeenrijke klaver (Trifolium subterrareum)⁶. Bij inname kunnen fyto-oestrogenen in cellen overgaan en de effecten van oestrogeen nabootsen. Hoewel fyto-oestrogenen negatieve effecten hadden op de vruchtbaarheid van schapen, is de relatie tussen fyto-oestrogenen en fysiologie niet eenvoudig. Net als schapen vertonen zuidelijke witte neushoorns gevoeligheid voor oestrogene verbindingen in voer afkomstig van grote hoeveelheden soja en luzerne. Dochters van vrouwen die dit dieet tijdens de zwangerschap krijgen, hebben minder kans om zich voort te planten⁷. Andere studies hebben echter aangetoond dat fyto-oestrogenen ook positieve effecten kunnen hebben, waaronder rijping van eierstokfollikels bij oudere muizen⁸, preventie van bepaalde kankers, antioxiderende activiteit en antiproliferatieve effecten⁹.

De breedte van de effecten van fyto-oestrogenen is niet verrassend, aangezien oestrogenen een breed scala aan biologische functies beïnvloeden, waaronder groei, ontwikkeling en regulering van het voortplantings- en centrale zenuwstelsel¹⁰. Hoewel er veel werkingsmechanismen zijn, hebben fyto-oestrogenen vaak het vermogen om oestrogeensignalering te wijzigen, te verbeteren of te verstoren door hun vermogen om te fungeren als liganden voor de intranucleaire oestrogeenreceptoren alfa en bèta (ERα en ERβ). Veel fyto-oestrogenen hebben een fenolische ringstructuur vergelijkbaar met oestrogenen waarmee ze oestrogeenreceptoren kunnen binden. Degenen met agonistische oestrogene activiteit functioneren zoals oestrogeen en vormen een geactiveerd ER-ligandcomplex dat kan dimmen en binden aan een oestrogeenresponselement (ERE) en gentranscriptie kan activeren¹¹. Zo reguleren oestrogenen en fyto-oestrogenen celactiviteit en systeemfuncties door hun acties als transcriptiefactoren.

Hier presenteren we het nieuwe gebruik van een celgebaseerde test om plantenextracten te screenen op de aanwezigheid van verbindingen die oestrogene biologische activiteit hebben. Deze test maakt gebruik van Chinese hamster eierstok CHO cellen ontworpen om zeer express ERβ, die zijn getransfecteerd met de vuurvlieg (Photinus pyralis) luciferase gen gekoppeld aan een ERE promotor¹². Wanneer oestrogene verbindingen aanwezig zijn, binden ze zich aan de ER, dimmen ze en binden ze zich aan de ERE, wat leidt tot transcriptie van het luciferase-gen. Bij toevoeging van een substraatoplossing katalyseert de luciferase een reactie die leidt tot fotonuitstoot. Daarom produceren positieve monsters lichte en negatieve monsters niet.

Deze commercieel beschikbare test elimineert de noodzaak voor laboratoria om de zoogdiercellen te transfecteren met het reporter-gen en oestrogeenreceptor^13,14, die onstabiel en variabel was in werkzaamheid. De test biedt een stabiel transfectieplatform waarmee snel en eenvoudig kan worden bepaald of een plant oestrogene activiteit heeft via receptorbinding.

We testen de hypothese dat sojabonen een hogere oestrogene activiteit hebben dan alle andere voedingsmiddelen gezien hun bekende concentraties oestrogene isoflavonen¹⁵ met behulp van menselijk voedsel van lokale kruideniers.

Protocol

1. Bereiding van plantaardige materialen

1. Vries droge plantitems in die vers zijn verzameld met behulp van een lyofiel.
   1. Om monsters te beschermen tegen licht, dek kamers af met aluminiumfolie tijdens het droogproces.
   2. Om ervoor te zorgen dat monsters volledig droog zijn, lyophiliseer totdat kamers niet langer koud aanvoelen om aan te raken en plantaardige materialen geen massa meer verliezen wanneer ze worden gewogen.
   3. Bewaar gedroogde planten in steriele zakken met weinig residu bij afwezigheid van licht tot het malen.
2. Slijp monsters fijn met behulp van een slijpmolen met 0,85 mm gaasscherm.
   1. Bewaar de grondmonsters in de zakken bij afwezigheid van licht tot de extractie.

2. Extractie van secundaire metabolieten van planten

1. Om de secundaire plantmetabolieten te extraheren, gebruikt u een verhouding van 1 g gedroogd monster tot 10 ml HPLC-kwaliteit methanol.
   1. Weeg het monster af op een analytische balans en voeg het toe aan een erlenmeyer van de juiste grootte (125 – 250 ml). Voeg vervolgens de juiste hoeveelheid methanol toe. Noteer de massa van het geëxtraheerde monster.
   2. Bedek de plant-methanoloplossing met aluminiumfolie en draai vervolgens gedurende 3 dagen met 100 tpm snelheid bij kamertemperatuur (RT) op een orbitale shaker, waardoor de potentieel oestrogene verbindingen in het methanol kunnen oplossen.
   3. Decanteer het supernatant met filterpapier (125 mm) in een druppelfiltratiesysteem.
   4. Droog met behulp van een roterende verdamper het plantenextract totdat het monster is verdikt, maar gietbaar, in een kolf met ronde bodem van 300 ml. Giet het monster in een kolf met ronde bodem van 50 ml en spoel de grote kolf af met een kleine hoeveelheid methanol. Blijf het monster in de kleine kolf drogen totdat de methanol volledig is verdampt.
   5. Weeg het monsterresidu af met behulp van een analytische balans. Residumassa registreren.
   6. Los het plantenextract op in dimethylsulfoxide (DMSO) bij een concentratie van 0,1 g extract tot 2 ml DMSO. Vortex tot het gehomogeniseerd is.
   7. Bewaar de plantextract-DMSO-oplossing bij 4 °C in amberkleurige glazen flacons tot de test.

LET OP: Planten kunnen onbekende biologisch actieve chemicaliën produceren en DMSO is een voertuig dat ze over celmembranen kan transporteren. Gebruik de juiste persoonlijke beschermingsmiddelen en zorg bij het hanteren van deze monsters.

3. Menselijke oestrogeenreceptor β transfectietest¹²

OPMERKING: Voor dag 1 van het testprotocol is een aseptische techniek en een laminaire stroomkap vereist.

1. Bereid verdunningen van 17β-Estradiol voor op de standaardcurve.
   1. Breng het Cell Recovery Medium and Compound Screening Medium (CSM) over uit de vriesopslag en ontdooi in een waterbad van 37 °C.
   2. Label microcentrifuge buizen Intermediate 1 en 2 (INT1, INT2) en 1-8.
   3. Vul INT1 met 995 μL CSM, INT2 met 615 μL CSM, buis 1 met 900 μL CSM en buizen 2-8 met 600 μL CSM. Zet buis 8 opzij.
   4. Breng 5 μL van 100 μM 17β-Estradiol Stock over in INT1. Gooi de punt weg. Vortex.
   5. Spoel voor elke overdracht pipet 3 keer en breng vervolgens 10 μL over van INT1 naar INT2. Gooi de punt weg.
   6. Spoel pipet 3 keer en breng vervolgens 100 μL van INT2 over in buis 1. Gooi de tip weg. Breng 300 μL van buis 1 over in buis 2. Herhaal dit voor de buizen 3 tot en met 7. Gooi 300 μL uit buis 7 weg in de afvalcontainer. Buis 8 is een Nul en ontvangt geen estradiol. De uiteindelijke concentraties van geplateerde normen zijn: 400, 133,3, 44,44, 14,815, 4,938, 1,646, 0,5487 en 0 pM estradiol.
2. Bereid monsterverbindingen voor.
   1. Vortex monsters.
   2. Neem 4 μL van elk plantenmonster in DMSO en voeg toe aan 496 μL CSM om een 0,8% DMSO-oplossing op te leveren.
3. Ontdooi snel Reporter Cells.
   1. Haal de buis van Cell Recovery Medium uit het waterbad van 37 °C. Desinfecteer het buitenoppervlak met 70% ethanol.
   2. Haal Reporter Cells op uit -80 °C opslag en dooi door 10 ml van de voorverwarmde CRM over te brengen in de buis van bevroren cellen.
   3. Sluit de buis van Reporter Cells en breng over naar een waterbad van 37 °C gedurende 5-10 minuten.
   4. Haal de tube Reporter Cell Suspension uit het waterbad. Keer de buis van cellen meerdere keren voorzichtig om om aggregaten van cellen te breken en een homogene suspensie te produceren. Reinig het oppervlak van de buis met 70% ethanol.
4. Assay plating
   1. Doseer 100 μL van de Reporter Cell Suspension in elke put met behulp van een multichannel pipet.
   2. Doseer 100 μL monsters in drievoud in geschikte testputten.
   3. Breng de plaat gedurende 22-24 uur over in een 37 °C, bevochtigde_5% CO 2 incubator.
5. Ontdooi detectiesubstraat en detectiebuffer 's nachts in een donkere koelkast ter voorbereiding op dag 2.
6. Verwijder vlak voor het einde van de plaatincubering het detectiesubstraat en de detectiebuffer uit de koelkast en plaats deze in een gebied met weinig licht totdat u in evenwicht bent met RT. Eenmaal bij RT, draai elke buis voorzichtig meerdere keren om om oplossingen grondig te mengen.
   1. Vlak voordat de incubatie is voltooid, giet de volledige inhoud van de detectiebuffer in de buis van detectiesubstraat om Luciferase Detection Reagent te maken. Meng voorzichtig om geen schuim te produceren.
   2. Zodra de incubatie is voltooid, draait u de plaat om om inhoud in een geschikte afvalcontainer te gooien. Tik voorzichtig op de plaat op een schone absorberende keukenpapier om de laatste druppels uit de putten te verwijderen.
   3. Voeg 100 μL van het Luciferase Detection Reagens toe aan elke put. Laat de testplaat 15 minuten rusten bij RT. Schud de plaat niet.
7. Kwantificeer luminescentie met behulp van een 96-put plaat-lezen luminometer.

Resultaten

Tweeëntwintig extracten van groenten en fruit die vaak in menselijke diëten worden gevonden, werden gescreend op de aanwezigheid van oestrogene verbindingen. Een verscheidenheid aan voedingsmiddelen werd onderzocht, waaronder peulvruchten, zoals sojabonen, peultjes en snaperwten, omdat de erwtenfamilie een bekende bron is van fyto-oestrogenen¹⁶, evenals vijgen, dadels, maïs, wortels, appels, bananen, aardbeien, tomaat, boerenkool en kool. Hormoonontregelende verbindingen worden aangetroffen in gem...

Discussie

De ERβ-reportertest die is ontwikkeld om farmaceutische agentia individueel te screenen, is ook geschikt voor het screenen van plantaardig voedsel op fyto-oestrogenen die biologisch actief zijn via de ERβ. Belangrijke overwegingen in het protocol zijn onder meer het voorzichtig behandelen van de plantenmonsters: vers plantmateriaal moet snel worden gedroogd om schimmelvorming of andere biologische afbraak te voorkomen, en het moet uit de buurt van licht worden gehouden om fotolyse van de verbindingen te voorkomen

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
1000 µL pipette
20 µL pipette
200 µL pipette
37 ° waterbad
37 °, bevochtigde 5% CO2 incubator
70% ethanol
analyseweegschaal
laminaire werkbank met celkweekcertificering
dimethylsulfoxide
steriele wegwerpmediabak
druppelfiltratiesysteem
Erlenmeyer kolven			125 mL en 250 mL
HPLC-kwaliteit methanol
Human ERβ Reporter Assay System, 1 x 96-well format assays	Indigo Biosciences	IB00411	Assay kit - analyseert 24 monsters plus standaardcurve
vriesdroger
multi-kanaals pipette
orbitale shaker
plaat-leesluminometer			ex. Bioteck Synergy HTX
rotorverdamper
kolven met ronde bodem			50 mL en 300 mL
steriele microcentrifugebuizen of steriele multi-kanaals mediabakjes
steriele pipetten			200 µL en 1000 µL
Whatman grade 1 papier
whirl-pak tassen			steriele polyethyleen tassen