Methodenartikel

Flow Cytometrie Analyse van immune cell subsets binnen de Murine Milt, Beenmerg, lymfeklieren en synoviale weefsel in een artrose model

DOI:

10.3791/61008

⸱

24 april 2020

 ,  ,  ,  ,  , 
1Raymond Purves Bone and Joint Research Laboratory, Institute of Bone and Joint Research, Kolling Institute, Royal North Shore Hospital, University of Sydney, 2HTRG - Heidelberg Trauma Research Group, Center for Orthopedics, Trauma Surgery and Spinal Cord Injury, Trauma and Reconstructive Surgery, Heidelberg University Hospital, 3Department of Large Animal Clinical Sciences, College of Veterinary Medicine, Michigan State University

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hier beschrijven we een gedetailleerd en reproduceerbaar stroomcytometrieprotocol om monocyten/macrofaag en T-celsubsets te identificeren met behulp van zowel extra- als intracellulaire kleuringstesten in de murine milt, beenmerg, lymfeklieren en synovaal weefsel, gebruikmakend van een gevestigd chirurgisch model van murineartrose.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Artrose (OA) is een van de meest voorkomende aandoeningen van het bewegingsapparaat, die patiënten die lijden aan pijn en lichamelijke beperkingen. Recent bewijs wijst op een potentiële ontstekingscomponent van de ziekte, met zowel T-cellen als monocyten/macrofagen die mogelijk geassocieerd kunnen worden met de pathogenese van OA. Verdere studies postuleerden een belangrijke rol voor subsets van beide inflammatoire cellijnen, zoals Th1, Th2, Th17 en T-regulerende lymfocyten, en M1, M2 en synovium-weefsel-resident macrofagen. De interactie tussen de lokale synoviale en systemische ontstekingscellulaire respons en de structurele veranderingen in het gewricht is echter onbekend. Om volledig te begrijpen hoe T-cellen en monocyten/macrofagen bijdragen aan OA, is het belangrijk om deze cellen en hun subsets gelijktijdig te kunnen identificeren in synoviale weefsel, secundaire lymfeorganen en systemisch (de milt en het beenmerg). Tegenwoordig kunnen de verschillende inflammatoire celsubsets worden geïdentificeerd door een combinatie van celoppervlaktemarkers die multi-color flow cytometrie maken tot een krachtige techniek bij het onderzoeken van deze cellulaire processen. In dit protocol beschrijven we gedetailleerde stappen met betrekking tot de oogst van synoviale weefsel en secundaire lymfeorganen en het genereren van eencellige suspensies. Verder presenteren we zowel een extracellulaire kleurtest om monocyten / macrofagen en hun subsets te identificeren, als een extra- en intracellulaire kleurtest om T-cellen en hun subsets te identificeren in de murine milt, beenmerg, lymfeklieren en synoviale weefsel. Elke stap van dit protocol werd geoptimaliseerd en getest, wat resulteert in een zeer reproduceerbare test die kan worden gebruikt voor andere chirurgische en niet-chirurgische OA-muismodellen.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Artrose (OA) is een slopende en pijnlijke ziekte waarbij verschillende pathologieën van alle weefsels geassocieerd met het gewricht1. Het beïnvloeden van ongeveer 3,8% van de wereldbevolking2, OA is een van de meest voorkomende spier- en skeletaandoeningen en het is om de4e belangrijkste oorzaak van invaliditeit wereldwijd in 20203. Posttraumatische OA treedt op na een gewrichtsletsel en is goed voor ten minste 12% van alle OA en tot 25% van OA in gevoelige gewrichten zoals de knie4,5. Bovendien verhoogt gewrichtsletsel het levensrisico van OA met meer dan vijf keer6. Niet alle verwondingen met schijnbaar vergelijkbare instabiliteit zal gaan om OA te ontwikkelen, en dus het definiëren van factoren die rijden de lange termijn OA-risico blijft een uitdaging. Het is van cruciaal belang om effectieve behandelingen te ontwikkelen om posttraumatische OA te voorkomen en/of te behandelen, om de letselspecifieke pathologie, oorzaken en mechanismen die vatbaar zijn voor OA1te onderzoeken en beter te definiëren.

OA en de bepalende vernietiging van kraakbeen werden voorheen volledig toegeschreven aan mechanische stress en dus werd OA beschouwd als een niet-inflammatoire ziekte2. Recentere studies hebben echter een ontstekingsinfiltratie van synoviale membranen en een toename van ontstekingscellen in het synoviale weefsel bij patiënten met OA aangetoond in vergelijking met gezonde controles2, licht werpen op een ontstekingscomponent als een potentiële drijvende kracht in OA. Verdere studies wezen uit dat afwijkingen in zowel het CD4+ als cd8+ T-celprofiel en monocyten/macrofagen van het aangeboren immuunsysteem kunnen bijdragen tot de pathogenese van OA2,7. Gedetailleerde onderzoeken naar deze afwijkingen toonden relevante rollen aan voor verschillende T-celsubsets2, zoals1 8th2 ,Th2 9, Th178 en T regulatory (Treg) populaties10,11. Ondanks dit overtuigende bewijs is het oorzakelijk verband tussen de wijziging van T-celreacties en de ontwikkeling en progressie van OA nog onbekend2.

Naast specifieke T-cellen die een rol spelen in OA, suggereren recente studies dat gedifferentieerd/geactiveerde macrofagen geassocieerd kunnen worden met pathogenese van OA12. In het bijzonder accumuleren macrofagen afkomstig van bloedmonocyten in het synovium en polariseren in klassiek geactiveerde macrofagen (M1) of als alternatief geactiveerde macrofagen (M2) tijdens de OA-ontwikkeling, wat een correlatie impliceert tussen monocyt afgeleide macrofagen en OA13. In tegenstelling, sommige subsets van macrofagen bevolken organen vroeg tijdens de ontwikkeling en zelf-ondersteunen hun nummers in een monocyten onafhankelijke materie14. Onlangs werd een gewrichtsbeschermende functie getoond die werd bemiddeld door een strakke barrière voor deze synoviale weefsel-ingezetene macrofagen (STRMs)14. Deze bevindingen wijzen erop dat afwijkingen in met name subsets van macrofagen een cruciale rol kunnen spelen bij de ontwikkeling van OA. De interacties tussen deze ontstekingscellulaire respons en de structurele veranderingen in het gewricht na trauma zijn echter onbekend.

Historisch gezien was de analyse van immuuncellen in het synoviale weefsel beperkt tot immunohistochemie (IHC) of mRNA-expressie door reverse-transcriptie polymerase kettingreactie (RT-PCR) benaderingen15,16. Zowel IHC als RT-PCR missen echter de mogelijkheid om meerdere verschillende celtypen en hun subsets tegelijkertijd te identificeren, waardoor de toepasbaarheid van deze methoden wordt beperkt. Bovendien is IHC beperkt tot analyse van kleine monsters van weefsel en kan focale ontstekingscelophopingen missen. In de afgelopen jaren zijn een groot aantal oppervlaktemarkers voor verschillende celtypen ontwikkeld, en subsets van immuuncellen kunnen nu betrouwbaar worden geïdentificeerd door verschillende combinaties van deze markers. Als gevolg van gestage technische vooruitgang, stroom cytometers zijn nu in staat het identificeren van een veelheid van verschillende fluorchromen tegelijkertijd waardoor de analyse van grote veelkleurige antilichaam panelen.

Flow cytometrie biedt onderzoekers een krachtige techniek die gelijktijdige identificatie en kwantificering van een veelheid van immuuncellen en hun subsets op het niveau van eencellige mogelijk maakt. We hebben zowel een extracellulaire kleurtest ontwikkeld en geoptimaliseerd om monocyten/macrofagen en hun subsets te identificeren, evenals een extra/intracellulaire kleuringstest om T-cellen en hun subsets te identificeren in murine milt, beenmerg, lymfeklieren en synovial weefsel. Elke stap van dit protocol werd geoptimaliseerd en getest wat resulteert in een zeer reproduceerbare test die kan worden gebruikt voor andere chirurgische en niet-chirurgische OA muismodellen17.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Northern Sydney Local Health District Animal Ethics Committee heeft alle procedures goedgekeurd die in dit protocol worden genoemd. Muizen worden gehuisvest en verzorgd in overeenstemming met de Guide for the Care and Use of Laboratory Animals (National Health and Medical Research Council of Australia Revised 2010). Voor alle experimenten 10-12 weken-oude, mannelijke C57BL/6 muizen werden gebruikt.

LET OP: Om posttraumatische OA te induceren, werd chirurgische destabilisatie van de mediale meniscus (DMM) in het rechter verstikkende gewricht uitgevoerd. Gedetailleerde informatie over dit diermodel werd gepubliceerd door Glasson et al.18. Kortom, algemene anesthesie wordt geïnduceerd in een inductiekamer met behulp van isofluraan en daarna onderhouden met behulp van een neuskegel. Het chirurgische been wordt geschoren met een scheermesje en de chirurgische site wordt gewassen en uitgewassen met ethanol om besmetting te minimaliseren. Het dier wordt vervolgens verplaatst naar de operatiemicroscoop en geplaatst op een steriele handdoek en het been gedrapeerd met steriel papier gordijn om de chirurgische site te isoleren en besmetting te minimaliseren. Met behulp van de microscoop wordt een 0,5 cm mediale para-patella arthrotomie gemaakt, de patella lateraal luxated, en de infra-patella vetpad verhoogd om de mediale menisco-tibial ligament bloot, die wordt doorsneden met ontleden tangen. Het gewricht wordt gespoeld met steriele zoutoplossing om bloed te verwijderen en de wond wordt gesloten in drie lagen – gezamenlijke capsule, onderhuids weefsel (met behulp van hechtingsmateriaal) en de huid (met behulp van chirurgische weefsellijm). Methoden die in dit protocol worden beschreven, kunnen echter worden toegepast op andere modellen en methoden voor het induceren van OA. OA kan worden geïnduceerd in beide zijden van het dier, en bij het oogsten van weefsels, is het belangrijk om de ipsilaterale (drainerende) lymfeklieren te oogsten.

1. Isolatie van de milt, contralaterale beenmerg, ipsilaterale lymfeklieren die de verstikkende en synoviale weefsel draineren

  1. Euthanaserië de muis door cervicale dislocatie. Plaats de muis in een supine positie onder een ontledenmicroscoop en veeg de borst, buik en benen met 70% ethanol. Open voorzichtig de huid op de middellijn voor de lengte van de buik met behulp van rechte schaar verlaten van de buikholte intact.
  2. Trek voorzichtig de huid aan de rechterkant van het dier uit de buurt van de onderliggende spier waardoor het onderhuidse vetweefsel aan de huid wordt bevestigd. Normaal gesproken, zachte tractie alleen zal scheiden van de huid en onderliggende vetweefsel van de spier. Sporadische hechtingen moeten worden doorgesneden met een fijne schaar om de spanning die nodig is om weefsels tot een minimum te beperken en de kans op beschadiging van de lymfeklieren te verminderen. Identificeer een kruising van drie vaten door het vetweefsel dat zich aan de dij bevindt voorzichtig uit te plagen met behulp van twee gebogen fijne tangen. De inguinale lymfeklier bevindt zich bij de kruising en kan worden geïdentificeerd door zijn eivormige vorm en iets donkerdere kleur.
  3. Verwijder de inguinale lymfeklier met behulp van fijne ontleden tangen. Wees voorzichtig om de capsule niet te scheuren. Verwijder het resterende vet op het oppervlak van de lymfeklier met de tangen.
  4. Open de buikholte en identificeer de milt. Knip de milt met een fijne schaar. Trek voorzichtig de darmen opzij om de aorta bloot te leggen en de splitsing ervan is voorzichtig om ze niet te beschadigen, om het risico op besmetting te minimaliseren. De iliacale lymfeklier bevindt zich in het terminale segment van de abdominale aorta en de oorsprong van de gemeenschappelijke iliacale slagader. Verwijder de rechter iliacale lymfeklier en ga verder zoals beschreven in 1.3.
  5. Verwijder voorzichtig de huid van beide achterpoten. Ontleden het linkerdijbeen door het te reinigen van spierweefsel met behulp van het mes en fijne schaar. Los zowel de verstikkende als het heupgewricht voorzichtig los en laat het hele bot intact en verwijder het dijbeen.
  6. Identificeer de patellapees van het rechter verstikkende gewricht en verwijder vervolgens het aangrenzende spierweefsel proximaal aan dit met behulp van fijne schaar tot ongeveer 5 mm quadriceps pees proximale aan de knieschijf wordt blootgesteld. Snijd daarna door de quadriceps pees ongeveer 3-4mm proximale naar de knieschijf om een handvat te vormen en met behulp van fijne tangen trek het voorzichtig uit de buurt van het gewricht. Dit zal de randen van de gezamenlijke capsule gehechtheid aan dijbeen zichtbaar, en met behulp van een scalpel mes zorgvuldig gesneden langs de randen van de gezamenlijke capsule aan beide zijden, te beginnen bij het dijbeen naar het scheenbeen, om de hoeveelheid synoviale membraan dat wordt geoogst te maximaliseren. Tijdens het snijden is het belangrijk om een zachte tractie op de quadriceps pees te behouden en te pauzeren wanneer het synoviale weefselblok alleen aan het scheenbeen is bevestigd. In dit stadium is het intraarticulaire vetpad nu duidelijk zichtbaar distaal aan de knieschijf en kan voorzichtig worden losgemaakt van het gewricht en het voorste aspect van de menisci met behulp van het blad. Snijd daarna langs het resterende deel van de gewrichtscapsule (scheengedeelte) om het synoviale weefselblok te verwijderen.
    LET OP: Deze stap moet zeer nauwkeurig worden gedaan om betrouwbare resultaten mogelijk te maken. Na het voltooien van de dissectie moet het "synoviale weefselblok" bestaan uit de patella, patellapees, infrapatellar fat pad, supra- en infrapatellar recesse synoviale voering en bijbehorende gezamenlijke capsule voorste aan de collaterale ligamenten. Houd alle weefsels vochtig tijdens de dissectie met behulp van 0,9% zoutoplossing.
    OPMERKING: Plaats elk synoviale weefselblokmonster in een aparte put van een gelabelde plaat met 24 put met 1,5 ml RPMI 1640-medium. Combineer zowel de iliacale als de inguinale lymfeklier in één put en pool weefsels van twee muizen.

2. Generatie van eencellige suspensies van elk weefsel

OPMERKING: Om voldoende celnummers te garanderen voor stroomanalyse moeten synoviale weefsels van twee muizen worden samengevoegd. In het huidige protocol, pool alle weefsels van dezelfde twee muizen om analogie te handhaven. Bovendien werden iliacale en inguinale lymfeklieren voor elk dier gecombineerd, wat resulteert in een totaal van 4 lymfeklieren voor elk monster. In het algemeen volstaan celnummers in milt, beenmerg en lymfeklieren van één dier om stromingsanalyse uit te voeren en kan het protocol worden toegepast. Echter, bij het gebruik van weefsels van slechts een dier lysing tijden kan moeten worden aangepast.

  1. De milt
    1. Plaats de twee gepoolde milt op een 70 μm celzeef bovenop een buis van 15 mL. Macerate de milten voorzichtig door het mesh filter met behulp van een steriele 3 mL spuit zuiger. Spoel de zeef vaak door met een totaal van 6 mL RPMI 1640 medium aangevuld met 10% FBS.
    2. Draai de cellen (500 x g, 5 min, RT) en resuspend de pellet in 5 mL van rode bloedcellen (RBC) lyse buffer. Incubeer gedurende 5 minuten bij RT en stop de reactie door de lysebuffer te verdunnen met 10 mL PBS. Draai de cellen (500 x g,5 min, RT) en herhaal deze stap een keer of totdat er geen RBC meer in de pellet zit.
      LET OP: De suspensie opnieuw filteren met behulp van een 30 μm celzeef in een nieuwe 15 mL buis tussen de twee rondes van lysing om gestolde cellen te verwijderen.
    3. Na lysing is voltooid, draai de cellen (500 x g, 5 min, RT), gooi supernatant en resuspend pellet in 1 mL PBS. Tel het aantal levende cellen op een hemocytometer met trypan blauwe uitsluiting.
  2. De lymfeklieren
    1. Plaats de vier gepoolde lymfeklieren op een 70 μm celzeef bovenop een buis van 15 mL. Plaag de lymfeklieren voorzichtig uit elkaar in een enkele celsuspensie door met een steriele 3 mL spuitzuiger te drukken. Spoel de zeef regelmatig door met een totaal van 6 mL RPMI met 10% FBS.
    2. Draai de cellen (500 x g,5 min, RT), gooi supernatant weg en verleg de pellet opnieuw in 500 μL PBS. De suspensie opnieuw filteren met behulp van een 30 μm celzeef in een nieuwe 15 mL buis om gestolde cellen te verwijderen. Tel het aantal levende cellen op een hemocytometer met trypan blauwe uitsluiting.
  3. Het beenmerg
    1. Zorgvuldig grijpen het intacte dijbeen met behulp van een weefsel duim forceert zonder breken. Snijd het uiteinde van het proximale dijbeen af met een scherpe schaar om het spoelen van het bot te vergemakkelijken. Draai het dijbeen om en plaats een 23 G naald in het midden van de intercondylar inkeping van het dijbeen. Terwijl het toepassen van zachte druk draai de naald tussen duim en wijsvinger om een gat in de intercondylar inkeping te boren om de beenholte in te gaan.
      OPMERKING: Soms kunnen deeltjes van het bot de naald belemmeren na het boren van het gat, om onnodige hoge druk te voorkomen tijdens het spoelen van een naaldwissel voordat blozen wordt aanbevolen.
    2. Spoel het bot met 6 mL RPMI met 10% FBS (of totdat de flush wit wordt) met behulp van een 10 mL spuit met een 23 G naald op een 70 μm cel strainer die is geplaatst op een 15 mL buis. Druk het beenmerg voorzichtig door de celzeef met een zuiger van een spuit van 3 mL en spoel de zeef af met nog eens 3 mL RPMI.
      LET OP: De botten moeten wit lijken zodra al het merg volledig is weggespoeld.
    3. Draai de cellen (500 x g,5 min, RT) en resuspend de pellet in 5 mL rbc lyse buffer. Incubeer gedurende 5 minuten bij RT en stop de reactie door de lysebuffer te verdunnen met 10 mL PBS.
    4. Draai de cellen (500 x g,5 min, RT), gooi supernatant weg en verleg de pellet in 1 mL PBS. De suspensie opnieuw filteren met behulp van een 30 μm celzeef in een nieuwe 15 mL buis om gestolde cellen te verwijderen. Tel het aantal levende cellen op een hemocytometer met trypan blauwe uitsluiting.
  4. Het synoviale weefsel
    1. Snijd de twee synoviale weefselblokken in kleine stukjes met een fijne chirurgische schaar. Breng de monsters met medium over in een buis van 15 mL. Spoel de oude put met extra 0,5 mL RPMI om resterende cellen en synoviale weefsels te krijgen, breng over naar falcon tube (eindvolume 2 mL).
      TIP: Gebruik een transfer pipet en snede van de tip waar de diameter verbreedt in deze stap.
    2. Reconstruerenzym en aliquot volgens de instructies van de fabrikant (bijvoorbeeld Liberase). Voeg voldoende enzym toe om te resulteren in een uiteindelijke concentratie van 1 eenheid/mL (in totaal 2 eenheden per monster). Verteren bij 37 °C gedurende 2 uur met behulp van een MACS rotator.
    3. Stop de spijsvertering door 8 mL RPMI met 10% FBS toe te voegen en celsuspensie te filteren via een 70 μm celzeef in een nieuwe 15 mL buis. Spoel de oude 15 mL buis met nog eens 5 mL RPMI met 10% FCS medium en filter cel vering door dezelfde cel zeef in de nieuwe buis (15 mL eindvolume).
    4. Draai de cellen (500 x g, 10 min, RT), gooi supernatant weg en verleg de pellet in 500 μL PBS. Tel het aantal levende cellen op een hemocytometer met trypan blauwe uitsluiting.

3. Toewijzing van cellen

  1. Label twee 96-well platen (U-bottom vorm) met het type weefsel, dier-ID, en de aangewezen antilichaam paneel. In dit protocol worden in totaal twee antilichaampanelen gebruikt: Monocyte subset panel (extracellulaire kleuring) en T-cel subset paneel (extra- en intracellulaire kleuring).
  2. Zorg voor 5 x 105 cellen per put met behulp van de respectieve eencellige suspensies.
    OPMERKING: Bij het opzetten van het experiment moet u het absolute aantal cellen beoordelen dat per groep en weefseltype wordt verwacht (behandelde dieren hebben een hoger celaantal in weefsels dan controledieren). Wanneer u de celpellet opnieuw oplaadt tijdens de laatste stap van het genereren van eencellige suspensies, kiest u een geschikte hoeveelheid PBS om te eindigen met een concentratie van 5 x 105 per 200 μL. De hier gebruikte 96-putplaat kan maximaal 300 μL bevatten en meestal is 200 μL ideaal om het risico op kruisbesmetting als gevolg van morsen te minimaliseren.
  3. Verdeel voor elk paneel- en weefseltype ten minste 5 x 105 cellen als niet-bevlekte besturingselementen in putten die duidelijk zijn gemarkeerd.

4. Monocyte Subset Panel

  1. Voer levensvatbaarheidsvlekken uit: Spincellen (500 x g, 5 min, 4 °C) met behulp van een plaatspinner en was de cellen eenmaal met 200 μL van 1x PBS. Bereid een voorraad oplossing van cel-ondoordringbare amine-reactieve kleurstof (levensvatbaarheid vlek) verdund 1:50 in 1x PBS. Daarna worden de celpellets opnieuw opgetrokken met 100 μL van deze voorraadoplossing, wat resulteert in een absoluut volume van 2 μL levensvatbaarheidsvlek per put. Incubeer gedurende 15 minuten bij 4 °C beschermd tegen licht.
    OPMERKING: De optimale hoeveelheid levensvatbaarheidsvlek die nodig is, moet worden bepaald door een dosistitratiecurve uit te voeren. Bovendien moet de verdunde oplossing voor de vlekvoorraad in één dag worden gebruikt en niet worden opgeslagen. Raadpleeg de instructies van de fabrikant voor meer informatie over het reconstrueren, verdunnen en opslaan van de levensvatbaarheidsvlek.
  2. Bereid tijdens de incubatie de cocktail van antilichamen in een passend volume FACS-buffer (Ca2+ en Mg+ gratis PBS met 0,1%BSA en 0,02% natriumazaide). Was de cellen twee maal met 200 μL FACS-buffer, centrifuge (500 x g, 5 min, 4 °C) en resuspend elke pellet met 100 μL van het antilichaammengsel of het juiste controlemengsel. Incubeer gedurende 30 minuten bij 4 °C beschermd tegen licht.
    LET OP: Houd er rekening mee dat natriumaedide giftig is voor cellen. In het huidige protocol is de concentratie natriumaed in de stroombuffer zeer laag (0,02%) en monsters worden onmiddellijk na het bevlekken uitgevoerd, waardoor er geen probleem ontstaat. Als downstream functionele testen van gesorteerde cellen worden gepland, kan het nuttig zijn om elke dag van experimenten een nieuwe FACS-buffer te vormen en geen natriumadeide te gebruiken. Bij het gebruik van een veelheid van antilichamen, wordt geadviseerd om een passende hoeveelheid "Brilliant Stain Buffer" toe te voegen aan de cocktail van antilichamen om de resultaten te verbeteren.
  3. Was de cellen twee maal met 200 μL FACS-buffer en resuspend de cellen in 250 μL FACS + EDTA buffer (FACS buffer met 1 mM EDTA). Breng monsters over in gelabelde FACS-buizen. Bewaar monsters op 4 °C en beschermd tegen licht tot de aanschaf.
    OPMERKING: Immuuncellen hebben de neiging om plakkerig te zijn. Om zowel het risico op verstopping als het aantal doubletten te minimaliseren, wordt aanbevolen om 1 mM EDTA toe te voegen aan de uiteindelijke stroombuffer.

5. Subset-paneel T-cel

  1. Voer levensvatbaarheidsvlekken uit: Spincellen (500 x g, 5 min, 4 °C) met behulp van een plaatspinner en was de cellen eenmaal met 200 μL van 1x PBS. Bereid een voorraad oplossing van cel-ondoordringbare amine-reactieve kleurstof (levensvatbaarheid vlek) verdund 1:50 in 1x PBS. Daarna worden de celpellets opnieuw opgetrokken met 100 μL van deze voorraadoplossing, wat resulteert in een absoluut volume van 2 μL levensvatbaarheidsvlek per put. Incubeer gedurende 15 minuten bij 4 °C beschermd tegen licht.
  2. Bereid tijdens het uitbroeden van de monsters de extracellulaire antilichaamcocktail in een passend volume van 1x FACS-buffer. Was de cellen twee maal met een 200 μL 1x FACS-buffer, draai ze naar beneden (500 x g,5 min, 4 °C) en maak elke pellet opnieuw op met 100 μL van het antilichaammengsel of het juiste controlemengsel. Incubeer gedurende 30 minuten bij 4 °C beschermd tegen licht.
  3. Voer de intracellulaire kleuring uit met een fixatie- en permeabilisatiekit volgens de instructies van de fabrikant. Was de cellen twee maal met 200 μL 1x FACS buffer en resuspend in 200 μL fixatiebuffer. Incubeer gedurende 40 minuten bij 4 °C beschermd tegen licht.
  4. Bereid tijdens de incubatie de cocktail van antilichamen (intracellulaire kleuring) in een passend volume van 1x permeabilisatie en wasbuffer. Verzamel cellen door te spinnen (750 x g, 5 min, 4 °C) en was cellen twee maal met 200 μL van 1x perm/wasbuffer.
    OPMERKING: Fixatie en permeabilisatie resulteert in cellen die de neiging hebben om een beetje moeilijker om goed pellet. Om celverlies tijdens de daaropvolgende wasstappen te minimaliseren, verhoogt u de centrifugale kracht tot 750 x g. Als alternatief kan ook een langere spincyclus worden toegepast. Dit zou echter resulteren in een aanzienlijk langere tijd die nodig is om de cellen voor te bereiden.
  5. Spincellen (750 x g,5 min, 4 °C) en resuspend elke pellet met 100 μL van het antilichaammengsel of het juiste controlemengsel. Incubeer gedurende 40 minuten bij 4 °C beschermd tegen licht.
  6. Was de cellen twee maal met 200 μL 1x perm/wasbuffer en resuspend de cellen in 250 μL FACS + EDTA buffer. Breng monsters over in gelabelde FACS-buizen. Bewaar monsters op 4 °C en beschermd tegen licht tot de aanschaf.
    OPMERKING: Voor elk antilichaam moet de optimale concentratie worden bepaald door het uitvoeren van een dosis titratiecurve. Concentratie tussen antilichamen kan drastisch verschillen: CD3 en CD80 werd gebruikt met een verdunningsfactor van 1:1, terwijl CD11b en CD4 werd gebruikt met een verdunningsfactor van 1:6400. Bij het titreren van de antilichaamconcentratie gebruik hetzelfde aantal cellen dat tijdens de experimenten zal worden gebruikt.

6. Compensatie, passende controles en gating

  1. Het experiment instellen
    1. Zodra de optimale concentratie van antilichamen is vastgesteld, worden er niet-bevlekte en enkel gekleurde controles uitgevoerd voor compensatie om zich aan te passen aan spectrale overlappingen.
      OPMERKING: Voer alle compensatiebesturingselementen uit met zowel cellen als compensatiekralen. Gebruik wat de helderste resultaten (hoogste MFI van positieve gebeurtenissen) genereert voor compensatie. MFI staat voor gemiddelde fluorescentieintensiteit en wordt vaak gebruikt om de gemiddelde intensiteit van het gegenereerde signaal en dus het niveau van de antilichaamexpressie te beschrijven en te definiëren.
    2. Voer fluorescentie minus één (FMO) besturingselementen en isotypebesturingselementen uit bij het starten van een nieuw multicolor-experiment. Verdere details met betrekking tot FMO zijn eerder gepubliceerd19.
    3. Bepaal de optimale Forward Scatter Area (FSC-A) spanning en Side Scatter Area (SSC-A) spanning om de leukocytenpopulatie te detecteren in niet-bevlekte controles van elk weefseltype.
      OPMERKING: Het fixatie- en permeabilisatieproces verandert de afmetingen van de cel. Zo verschillen de FSC-A- en SSC-A-spanningen voor het Monocyte Subset Panel en het T-celubsetpaneel aanzienlijk. Gebruik cellen die met CD3- en achterpoort zijn voorzien van één puntje naar de leukocytenpopulaties en past de FSC-A- en SSC-A-waarden aan.
  2. Gating-strategie
    1. Zodra de optimale FSC-A en SSC-A spanning is bepaald, zet een primaire poort op de leukocyte populatie.
      OPMERKING: Voorafgaand aan elk experiment kalibreer de cytometer met behulp van kalibratiekralen volgens de instructies van de fabrikant en draaien onverbevlekte kralen. Leukocytenpopulaties van verschillende tijdstippen moeten vergelijkbare FSC- en SSC-eigenschappen hebben (er worden kleine verschillen tussen weefseltypen en normaal verwacht). Als FSC en SSC varieert aanzienlijke moeite schieten de cytometer en monster generatie.
    2. Dubbels uitsluiten: Plot FSC-A (y-as) en FSC-H (x-as). Singlets verschijnen als een diagonaal van dit perceel. Poort op singlets.
    3. Dode cel uitsluiten: Plot FVS510 (viability stain) (x-as) en FSC-A (y-as). Dode cellen zullen verschijnen als positieve gebeurtenissen, dus poort op levende cellen.
      OPMERKING: Echte negatieve cellen zijn zichtbaar in niet-bevlekte besturingselementen. Dus, pas deze poort voor elke set van monsters bij het uitvoeren van de onbevlekte controles voorafgaand aan gekleurde monsters. Verdere gating is afhankelijk van het antilichaam paneel en het celtype dat wordt onderzocht. Gating-strategieën voor elk paneel dat in dit protocol wordt gebruikt, zijn te vinden in respectievelijk figuur 1 en figuur 4.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Representatieve resultaten van zowel het subsetpaneel monocyte als het subsetpaneel van T-cel worden hieronder beschreven.

Figuur 1 illustreert de hiërarchische gatingstrategie voor het monocyten subset panel op immuuncellen verzameld uit beenmerg van DMM behandelde dieren. Dezelfde strategie werd gebruikt en geverifieerd in alle andere weefselsoorten. Bij het opzetten van het experiment werd voor elk weefseltype het Forward Scatter Area (FSC-A) en Side Scatter Ar...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De methoden beschreven in dit protocol zijn ontworpen en getest om betrouwbaar te identificeren verschillende subsets van zowel monocyten / macrofagen en T-cellen binnen de murine milt, beenmerg, lymfeklieren, en synoviale weefsel in een murine model van artrose (OA). Het huidige protocol kan eenvoudig worden gewijzigd om verschillende weefseltypen, of andere celtypen te onderzoeken door antilichamen uit te wisselen, en kan worden gebruikt voor alternatieve murinemodellen van OA. Bij het testen van andere weefseltypen is...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

We willen Andrew Lim, Ph.D. en Giles Best, Ph.D. bedanken voor hun hulp bij het opzetten van de flow cytometer. Dit project werd ondersteund door de Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) (DFG-HA 8481/1-1) toegekend aan PH.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
APC anti-mouse CD194 (CCR4)BioLegend131212T-Cell Panel
Brilliant Stain Buffer Plus 1000TstBD566385Buffers
Fixable Viability Stain 510, 100 µgBD564406T-Cell Panel
Fixable Viability Stain 510, 100 µgBD564406Monocyte Panel
Liberase, Research GradeRoche5401127001Enzyme voor synoviaal weefsel
Ms CD11b APC-R700 M1/70, 100 µgBD564985Monocyte Panel
Ms CD11C PE-CF594 HL3, 100 µgBD562454Monocyte Panel
Ms CD183 BB700 CXCR3-173, 50 µgBD742274T-Cell Panel
Ms CD206 Alexa 647 MR5D3, 25 µgBD565250Monocyte Panel
Ms CD25 BV605 PC61, 50 µgBD563061T-Cell Panel
Ms CD3e APC-Cy7 145-2C11, 100 µgBD557596T-Cell Panel
Ms CD4 PE-Cy7 RM4-5, 100 µgBD552775T-Cell Panel
Ms CD44 APC-R700 IM7, 50 µgBD565480T-Cell Panel
Ms CD62L BB515 MEL-14, 100 µgBD565261T-Cell Panel
Ms CD69 BV711 H1.2F3, 50 µgBD740664T-Cell Panel
Ms CD80 BV650 16-10A1, 50 µgBD563687Monocyte Panel
Ms CD8a BV786 53-6.7, 50 µgBD563332T-Cell Panel
Ms F4/80 BV421 T45-2342, 50 µgBD565411Monocyte Panel
Ms Foxp3 PE MF23, 100 µgBD560408T-Cell Panel
Ms I-A I-E BV711 M5/114.15.2, 50 µgBD563414Monocyte Panel
Ms Ly-6C PE-Cy7 AL-21, 50 µgBD560593Monocyte Panel
Ms Ly-6G APC-Cy7 1A8, 50 µgBD560600Monocyte Panel
Ms NK1.1 BV650 PK136, 50 µgBD564143T-Cell Panel
Ms ROR Gamma T BV421 Q31-378, 50 µgBD562894T-Cell Panel
Red Blood Cell Lysing BufferN/AN/ABuffers
Transcription Factor Buffer Set 100TstBD562574Buffers

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Blaker, C. L., Clarke, E. C., Little, C. B. Using mouse models to investigate the pathophysiology, treatment, and prevention of post-traumatic osteoarthritis. Journal of Orthopaedic Research. 35 (3), 424-439 (2016).
  2. Li, Y. S., Luo, W., Zhu, S. A., Lei, G. H. T Cells in Osteoarthritis: Alterations and Beyond. Frontiers in Immunology. 8, 356(2017).
  3. Woolf, A. D., Pfleger, B. Burden of major musculoskeletal conditions. Bull World Health Organ. 81 (9), 646-656 (2003).
  4. Little, C. B., Hunter, D. J. Post-traumatic osteoarthritis: from mouse models to clinical trials. Nature Reviews Rheumatology. 9 (8), 485-497 (2013).
  5. Riordan, E. A., Little, C., Hunter, D. Pathogenesis of post-traumatic OA with a view to intervention. Best Practice & Research: Clinical Rheumatology. 28 (1), 17-30 (2014).
  6. Muthuri, S. G., McWilliams, D. F., Doherty, M., Zhang, W. History of knee injuries and knee osteoarthritis: a meta-analysis of observational studies. Osteoarthritis and Cartilage. 19 (11), 1286-1293 (2011).
  7. Leheita, O., Abed Elrazek, N. Y., Younes, S., Mahmoud, A. Z. Lymphocytes subsets in osteoarthritis versus rheumatoid arthritis. Egyptian Journal of Immunology. 12 (2), 113-124 (2005).
  8. Yamada, H., et al. Preferential accumulation of activated Th1 cells not only in rheumatoid arthritis but also in osteoarthritis joints. Journal of Rheumatology. 38 (8), 1569-1575 (2011).
  9. Sakkas, L. I., et al. T cells and T-cell cytokine transcripts in the synovial membrane in patients with osteoarthritis. Clinics and Diagnostics Laboratory Immunology. 5 (4), 430-437 (1998).
  10. Guo, S. Y., et al. Correlation of CD(4)(+) CD(2)(5)(+) Foxp(3)(+) Treg with the recovery of joint function after total knee replacement in rats with osteoarthritis. Genetics and Molecular Research. 14 (4), 7290-7296 (2015).
  11. Moradi, B., et al. CD4(+)CD25(+)/highCD127low/(-) regulatory T cells are enriched in rheumatoid arthritis and osteoarthritis joints--analysis of frequency and phenotype in synovial membrane, synovial fluid and peripheral blood. Arthritis Research & Therapy. 16 (2), 97(2014).
  12. Saito, I., Koshino, T., Nakashima, K., Uesugi, M., Saito, T. Increased cellular infiltrate in inflammatory synovia of osteoarthritic knees. Osteoarthritis and Cartilage. 10 (2), 156-162 (2002).
  13. Zhang, H., et al. Synovial macrophage M1 polarisation exacerbates experimental osteoarthritis partially through R-spondin-2. Annals of the Rheumatic Diseases. 77 (10), 1524-1534 (2018).
  14. Culemann, S., et al. Locally renewing resident synovial macrophages provide a protective barrier for the joint. Nature. 572, 670-675 (2019).
  15. Mocellin, S., et al. Use of quantitative real-time PCR to determine immune cell density and cytokine gene profile in the tumor microenvironment. Journal of Immunological Methods. 280 (1-2), 1-11 (2003).
  16. Ward, J. M., et al. Immunohistochemical markers for the rodent immune system. Toxicologic Pathology. 34 (5), 616-630 (2006).
  17. Blaker, C. L., Clarke, E. C., Little, C. B. Using mouse models to investigate the pathophysiology, treatment, and prevention of post-traumatic osteoarthritis. Journal of Orthopaedic Research. 35 (3), 424-439 (2017).
  18. Glasson, S. S., Blanchet, T. J., Morris, E. A. The surgical destabilization of the medial meniscus (DMM) model of osteoarthritis in the 129/SvEv mouse. Osteoarthritis and Cartilage. 15 (9), 1061-1069 (2007).
  19. Laroumanie, F., Dale, B. L., Saleh, M. A., Madhur, M. S. Intracellular Staining and Flow Cytometry to Identify Lymphocyte Subsets within Murine Aorta, Kidney and Lymph Nodes in a Model of Hypertension. Journal of Visualized Experiments. (119), e55266(2017).
  20. Yu, Y. R., et al. A Protocol for the Comprehensive Flow Cytometric Analysis of Immune Cells in Normal and Inflamed Murine Non-Lymphoid Tissues. PLoS One. 11 (3), 0150606(2016).
  21. Lorenz, J., Grassel, S. Experimental osteoarthritis models in mice. Methods in Molecular Biology. 1194, 401-419 (2014).
  22. Christiansen, B. A., et al. Non-invasive mouse models of post-traumatic osteoarthritis. Osteoarthritis and Cartilage. 23 (10), 1627-1638 (2015).
  23. Shi, J., et al. Distribution and alteration of lymphatic vessels in knee joints of normal and osteoarthritic mice. Arthritis & Rheumatology. 66 (3), 657-666 (2014).
  24. Harrell, M. I., Iritani, B. M., Ruddell, A. Lymph node mapping in the mouse. Journal of Immunological Methods. 332 (1-2), 170-174 (2008).
  25. Zhao, J., et al. A protocol for the culture and isolation of murine synovial fibroblasts. Biomedical Reports. 5 (2), 171-175 (2016).
  26. Belluzzi, E., et al. Contribution of Infrapatellar Fat Pad and Synovial Membrane to Knee Osteoarthritis Pain. BioMed Research International. 2019, 18(2019).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Enkelcel suspensieextracellulaire kleuringintracellulaire kleuring

Gerelateerde artikelen