Methodenartikel

Hoge doorvoer Gist Stam Federtyping met Droplet-Based RNA Sequencing

6.8K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/61014

⸱

21 mei 2020

 ,  ,  ,  , 
1Department of Bioengineering and Therapeutic Sciences, University of California San Francisco, 2University of California Berkeley-UCSF Graduate Program in Bioengineering, University of California San Francisco, 3Department of Pharmaceutical Chemistry, University of California San Francisco, 4California Institute for Quantitative Biosciences, University of California San Francisco, 5Chan Zuckerberg Biohub

In dit artikel

Samenvatting

Een knelpunt in de 'design-build-test' cyclus van microbiële engineering is de snelheid waarmee we functionele schermen van stammen kunnen uitvoeren. We beschrijven een high-throughput methode voor stam screening toegepast op honderden tot duizenden gistcellen per experiment dat droplet-gebaseerde RNA sequencing gebruikt.

Samenvatting

De krachtige tools die beschikbaar zijn om gistgenomen te bewerken hebben van deze microbe een waardevol platform voor engineering gemaakt. Hoewel het nu mogelijk is om bibliotheken van miljoenen genetisch verschillende stammen te bouwen, blijft screening op een gewenst fenotype een belangrijk obstakel. Met bestaande screeningtechnieken is er een afweging tussen informatie-output en doorvoer, waarbij screening met een hoge doorvoer doorgaans wordt uitgevoerd op één product dat van belang is. Daarom presenteren we een aanpak om stamscreening te versnellen door eencellige RNA-sequencing aan te passen aan isogene picoliterkolonies van genetisch gemanipuleerde giststammen. Om de unieke uitdagingen van het uitvoeren van RNA-sequencing op gistcellen aan te pakken, kweken we isogene gistkolonies binnen hydrogels en sferoplast voorafgaand aan het uitvoeren van RNA-sequencing. De RNA sequencing gegevens kunnen worden gebruikt om gist fenotypes af te leiden en sorteren engineered trajecten. De schaalbaarheid van onze methode pakt een kritieke obstructie in microbiële engineering aan.

Inleiding

Een primair doel van microbiële engineering is om microben te wijzigen om ze te bewegen om waardevolle verbindingen te produceren1,2. S. cerevisiae is het primaire organisme voor microbiële engineering vanwege het gemak van de cultuur en de breedte van de instrumenten die beschikbaar zijn voor de engineering van zijn genoom3,4,5. Er blijft echter een hindernis over bij het uitvoeren van functionele schermen op de gemodificeerde gist: screening doorvoer blijft achter bij genoom engineering door ordes van grootte. Screening omvat meestal het isoleren van stammen in microwell platen en fenotypering ze door het meten van de productie van een specifieke verbinding6,7. De doorvoer van dit proces wordt beperkt door de grote hoeveelheden reagens die nodig zijn voor het toezien van individuele stammen in honderd microliter reacties. Druppelmicrofluidics biedt een aantrekkelijke oplossing om de doorvoer van gistscreening te verhogen door ordes van grootte door reacties die normaal gesproken in goed uitgevoerde platen worden uitgevoerd8te downscalingen. Echter, net als bij goed plaatschermen, druppelschermen meestal detecteren enkel product verbindingen, die beperkte informatie in de globale functie van de engineered traject9,10,11biedt .

RNA sequencing (RNA-seq) kan een uitgebreidere karakterisering van de trajectbewerking mogelijk maken doordat expressieniveaus van alle relevante genen gelijktijdig kunnen worden beoordeeld12,13. Bovendien kunnen druppelmethoden duizenden cellen per experiment profileren, waardoor de doorvoer die nodig is voor het scherm bibliotheken van de ontwikkelde varianten14,15. Echter, RNA-seq methoden zijn geoptimaliseerd voor zoogdiercellen; gist, ter vergelijking, hebben minder mRNA per cel en een celwand die moeilijk is te verwijderen16,het uitsluiten van hun volgorde door de bestaande methoden. Als een high-throughput druppel methode zou kunnen worden bedacht om gist RNA-seq mogelijk te maken, zou het een schaalbaar, kosteneffectief en informatierijk fenotyping platform voor gist engineering.

We presenteren een gedetailleerd protocol van onze recent ontwikkelde methode voor het rangschikken van gistcellen met behulp van high-throughput droplet microfluidics17. Om de uitdaging van beperkt RNA te overwinnen, kapselen en kweken we enkele gistcellen in picoliter hydrogelbollen. Cultuur dupliceert de cellen, waardoor honderden exemplaren delen dezelfde ontworpen route; dit vermindert variatie als gevolg van eencellige genexpressie, terwijl de hoeveelheid RNA die beschikbaar is voor sequencing aanzienlijk toeneemt. Na cultuurgebaseerde versterking sferen we de cellen, het verwijderen van de celwand via bulk enzymatische spijsvertering. Celmembranen blijven intact, zodat elke isogene kolonie en de bijbehorende mRNA ingekapseld blijven in hun hydrogelbollen. Dit stelt ons in staat om de afzonderlijke kolonies te koppelen met mRNA capture reagents en lysis buffer, en het mRNA te worden gevangen, barcoded, en gesequenced na de Drop-Seq workflow14. Onze methode maakt transcriptoom-brede screening van duizenden isogene gistkolonies per experiment mogelijk.

Protocol

1. Fabricage van microfluïdische apparaten

  1. SU-8 meesterfabricage
    1. Ontwerp het negatieve masker voor de microfluïdische kanalen voor apparaat A en B (Aanvullend Bestand 1 en 2) met behulp van computerondersteunde ontwerpsoftware en laat ze afdrukken op printplaatfolie met een resolutie van ten minste 10 μm.
    2. Leg een schone 75 mm siliconen wafer op een spin coater en giet ongeveer 1 mL van SU-8 op het midden. Zet het vacuüm aan om de wafer aan de klem vast te zetten.
    3. Voor apparaat A, spin coat SU-8 2150 bij 500 rpm voor 30 s, gevolgd door 30 s bij 2.750 rpm. Voor apparaat B, spin-coat SU-8 2100 bij 500 rpm voor 30 s, gevolgd door 30 s bij 2.500 rpm. Dit levert respectievelijk SU-8 lagen dikte 200 μm en 120 μm op.
    4. Haal de wafer uit de spincoater en leg op een kookplaat op 95 °C gedurende 60 min tot zacht bakken.
    5. Haal de wafer van de kookplaat en laat afkoelen tot kamertemperatuur. Plaats het masker op de top van de wafer, en bloot onder een collimator 190 mW, 365 nm UV LED voor 2 min.
    6. Plaats de wafer op een kookplaat die op 95 °C is geplaatst gedurende 5 min voor bakken na blootstelling.
    7. Verwijder de wafer en laat afkoelen tot kamertemperatuur. Plaats de wafer gedurende 20 min in een bad van propyleenglycolmonomethyletheracetaat (PGMEA).
    8. Spoel de wafer met PGMEA gevolgd door isopropanol. Als er tijdens dit proces ondoorzichtige resten zichtbaar zijn, herhaalt u de spoeling met PGMEA en isopropanol. Lucht droog de wafer.
    9. Leg de wafer gedurende 3 min op een kookplaat op 95 °C.
    10. Verwijder en plaats de wafer in een petrischaal met een diameter van 90 mm.
  2. Polydimethylsiloxane (PDMS) gieten op SU-8 master
    1. Meng een 10:1 massaverhouding van siliconenbasis tot uithardingsmiddel. Ontgas de PDMS na het mengen voor ongeveer 30 min.
    2. Giet ontgastPDMS op de top van de SU-8 master tot ten minste een 5 mm dikke laag wordt gevormd op de top van de wafer.
    3. Ontgas de PDMS op de top van de wafer voor ongeveer 30 min.
    4. Plaats de wafer in een 65 °C oven gedurende ten minste 80 min om de PDMS te genezen.
    5. Knip de uitgeharde PDMS-plaat uit de wafer.
    6. Plaats de PDMS-plaat met de microfluïdische eigenschappen naar boven gericht, en punch inlaat en uitlaat gaten met een 0,75 mm biopsie punch.
    7. Maak een glasplaat van 50 mm x 75 mm schoon met isopropanol en verwijder alle stof van de microfluïdische kenmerken van de PDMS-plaat met tape.
    8. Stel de gereinigde glazen schuif en de PDMS-plaat bloot met de microfluïdische eigenschappen tot 100 Pa (1 mbar O2)plasma gedurende 1 min.
    9. Plaats de PDMS-plaat met de functies met de gefacettering naar beneden op de glazen plaat om hechting mogelijk te maken. Plaats de schuif in een 65 °C oven gedurende ten minste 30 min om de hechting te voltooien.
    10. Behandel alle microfluïdische kanalen door te spoelen met een gefluoreerde oppervlaktebehandelingsvloeistof. Bak het apparaat in een 65 °C-oven gedurende ten minste 10 min om de vloeistof te verdampen.

2. Gistinkapseling in hydrogels met behulp van apparaat A

  1. Neem gist teelt in een schorsing cultuur en rekenen op een hemocytometer.
  2. De cellen in fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) opnieuw opschorten tot een concentratie van ongeveer 750 k/mL. Dit zorgt ervoor dat 30% van de hydrogels één gistcel in zich heeft. Slechts ongeveer de helft van de gistcellen groeien uit tot kolonies, wat leidt tot ~ 15% van hydrogels met gistkolonies.
  3. Meng ultralage smeltpunt agarose op 2% w/v in PBS en verwarm op 90 °C tot gesmolten. Dit duurt ~10 min.
  4. Laad de agarosemix in een spuit met een bevestigd 0,22 μm filter in een spuitpomp voor de kachel ingesteld op 80 °C.
  5. Laad een spuit gevuld met de gistsuspensie en een spuit met gefluoreerde olie met 2% w/v ionische fluorosurfactant18 in spuitpompen.
  6. Neem de coflow drop splitter apparaat gemaakt in punt 1 en sluit de slang van de spuiten in het apparaat. Leid de slang van de uitlaat in een conische buis van 15 mL in een ijsemmer voor drop-collectie.
  7. Stroom in de drie oplossingen in het apparaat met de volgende stroomsnelheden:
    1. Laat de gistsuspensie met de stroomsnelheid van 3 mL/h stromen.
    2. Laat het agarosemengsel stromen met de stroomsnelheid van 3 mL/h.
    3. Laat de gefluoreerde olie met een stroomsnelheid van 15 mL/h stromen.
  8. Verzamel ongeveer 1 mL emulsie. Wacht nog eens 5 min om de agarose volledig in te stellen.

3. Breken en wassen gel voor cultuur

  1. Voeg een gelijk volume van 20% perfluoroctanol (PFO) in gefluoreerde olie toe aan de emulsie. Draai de conische buis een paar keer om om te mengen.
  2. Draai de gebroken emulsie op 2.000 x g gedurende 2 min. De gels zullen pellet boven de olie en PFO fasen.
  3. Verwijder de oliefase en voeg 2 mL TE-TW buffer (10 mM Tris pH = 8,0, 1 mM EDTA, 0,01% Tween-20) toe om de gels opnieuw op te schorten. Breng de suspensie over in een nieuwe conische buis van 15 mL.
  4. Pellet vaststelling van de gels als in stap 3.2 en was nog een keer in TE-TW voor een totaal van twee wasbeurten.
  5. Verwijder supernatant en resuspend gels in 2 mL van de media. Transfer naar een 5 mL kweekbuis.
  6. Incubeer bij 30 °C 's nachts onder schudden.
    LET OP: Na de nachtelijke incubatie kunnen gisthydrogels enkele dagen op 4 °C worden gehouden.

4. Gistkolonielyse

  1. Breng gels over naar een conische buis van 15 mL en pellethydrogels op 2.000 x g gedurende 2 min.
  2. Was hydrogels in PBS 2x.
  3. Was in 1x sferoplasting buffer 1x.
  4. Voer een 2-50x verdunning van sferoplasting enzym in sferoplasting buffer uit en voeg 1 mL toe aan de hydrogels.
  5. Incubeer bij 37 °C gedurende 1 uur. De behandelde gist ziet er transparanter uit(figuur 3A).
  6. Neem de onderste 0,8 mL hydrogelsuspensie en breng over in een niet-afgetopte spuit van 1 mL.
  7. Plaats de spuit in de 3D-geprinte spuithouder(Aanvullend dossier 3)en draai op 2.000 x g voor 2 min. Dit zal ertoe leiden dat de hydrogels te sluiten verpakking in de spuit kop.

5. mRNA-vangst uit gelyseerde gistkolonies met behulp van apparaat B

  1. Neem 240.000 Drop-Seq kralen en breng in een conische buis van 15 mL.
  2. Pellet Drop-Seq kralen door te draaien naar beneden op 1.000 x g voor 1 min.
  3. Verwijder de supernatant en resuspend kralen in 2 mL van 0,9x gist lysis buffer met 500 mM natriumchloride voor een kraal schorsing concentratie van 120.000 kralen / mL.
  4. Breng de kraalvering over op een 3 mL spuit met een roerstaaf ingebracht.
  5. Bereid een spuit met meerdere milliliters 2% w/v perfluoropolyether-polyethyleenglycol (PFPE-PEG) oppervlakteactieve stof in gefluoreerde olie.
  6. Evacueer al het waterige hoofd van de spuit met dichtverpakte hydrogels en kap de spuit.
  7. Steek de hydrogel, kraalsingsuspensie en oliespuiten in spuitpompen en sluit via buizen aan op de inkapselingsinrichting van punt 1.
  8. Sluit vanaf de uitlaatslang aan op een kegelbuis van 50 mL op ijs.
  9. Stroom in de drie oplossingen in het apparaat met de volgende stroomsnelheden:
    1. Laat de hydrogels op 0,4 mL/h stromen.
    2. Laat de kraalvering op 0,4 mL/h stromen.
    3. Laat de gefluoreerde olie met 1,6 mL/h stromen.
  10. Verzamel ~ 1 mL emulsie of voer het apparaat uit totdat er geen hydrogels meer over zijn.

6. cDNA-generatie, sequencing bibliotheekvoorbereiding en sequencing

  1. Voeg 30 mL 6x SSC buffer en 1 mL PFO toe aan de verzamelde emulsie zoals vermeld in het Drop-Seq protocol14.
  2. Blijf het Drop-Seq-protocol volgen om cDNA te genereren uit mRNA dat is vastgelegd op kralen, de voorbereiding van de bibliotheek en het rangschikken van gegevensanalyse.

Resultaten

We hebben de eerder gepubliceerde Drop-Seq workflow14 voor isogene kolonie sequencing (ICO-seq) aangepast om genexpressieprofilering van isogene gistkolonies uit te voeren. We hebben enkele gistcellen geïsoleerd en ingekapseld in agarose microgels (Figuur 1A). Na nachtelijke incubatie van microgels groeiden deze ingekapselde gistcellen uit tot isogene kolonies. Voordat we gels in een tweede microfluïdisch apparaat voor mRNA-opname laden, verteerden we de gistcelwand om het mRNA toegankelijker te maken (Figuur 1B, links). We hebben deze microgels dichtgepakt en de mRNA-opvangkralen en lysisbuffer samengevoegd. Sommige druppels bevatten precies een kraal in combinatie met een lysed gist kolonie. Alle kralen in de emulsie werden verzameld en de cDNA gesynthetiseerd en gesequenced volgens het Drop-Seq protocol.

We genereerden isogene gistkolonies door middel van enkele gistcelinkapseling binnen agarose microgels met behulp van een coencapulation microfluidic apparaat met een acht druppel splitter bevestigd (Figuur 2A). We verdunden de input gist suspensie tot een concentratie van ~ 750.000/mL, zodat ~ 30% van microgels hebben precies een gist in hen. Voordat we de ultralage smelttemperatuur agarose in het apparaat inbrengen, losten we het op een verhoogde temperatuur op en hielden we de spuit op deze temperatuur om vroegtijdige gelatie te voorkomen. Bij de drop-generation junction (Figuur 2B), gistcellen werden aanvankelijk ingekapseld in 160 μm druppels. Na de drop-generation junction verdeelde een achtvoudige splitter deze druppels in acht druppeltjes van 80 μm (Figuur 2C). Een spuitfilter werd bevestigd aan de gesmolten agarose om te voorkomen dat klompen zich binnen de kanalen vormen, wat tijdens de valsplitsing zo smal kan zijn als 37 μm. We verzamelden de emulsie op ijs, die onmiddellijk begon de agarose gelatie proces. We berekenden de polydispersie van een typische emulsie te worden ~ 6% (Supplemental Figuur 1), hoewel polydispersie waarden tot 10% aanvaardbaar zijn. Zodra de agarose gels ingesteld, braken we de emulsie en verwijderde de oliefase. De gels werden gewassen in waterige buffer voor onderdompeling in groeimedia. Nachtelijke incubatie van de microgels resulteerde in isogene kolonies groeien binnen een aantal van de microgels (Figuur 2D). Het percentage hydrogels dat kolonies van ten minste 20 cellen bevat, was afhankelijk van de kweekomstandigheden, waaronder incubatietijd en mediasamenstelling. In onze demonstratie met C. albicanshebben we vastgesteld dat ongeveer 15% van de hydrogels een kolonie bevatte na 20 uur schorsingscultuur.

Een tweede coencapsulation apparaat haalde het mRNA uit isogene kolonies (Figuur 3A). Voorafgaand aan het laden van de gist microgels in de microfluidic apparaat, we gewassen en ondergedompeld de gels in een oplossing voor de gist cel wanden verteren. De juiste vertering van de gistcellen werd geverifieerd door microscopie, met behandelde gist met een meer reflecterende morfologie (Figuur 3B). We sluiten de microgels in een spuit en stemden de gel input flow rate zodanig dat een gel was in elke druppel. Een stroom van mRNA vangen kralen in lysis buffer gemengd met de close-packed gel stroom voorafgaand aan de drop-making junction (Figuur 3C). We verzamelden een resulterende emulsie van 160 μm druppels, en kolonies begonnen te lyse en hun cellulaire inhoud vrij te geven. We laadden kralen bij een beperkende verdunning om het aantal druppels met meerdere kralen te minimaliseren, maar close-packing van de gels tijdens het druppelen resulteerde in ongeveer 10% van de verzamelde druppels met een kraal met een gelyseerde kolonie (Figuur 3D).

We analyseerden genexpressie van C. albicans, een soort gist aanwezig in de menselijke darm microbioom, met behulp van de ICO-seq workflow. C. albicans staat bekend om zijn vermogen om te schakelen tussen twee verschillende celstaten, wit en ondoorzichtig19genoemd. We gebruiken een engineered C albicans stam, stam RZY122, die een kopie van het WH11-gen vervangt, alleen actief in witte cellen met YFP20. We verkregen een set van genexpressie profielen met behulp van de workflow en gebruikt en ze gebruikt voor de analyse van kolonies uitdrukken van ten minste 300 unieke genen. Als referentiegegevensset gebruikten we C. Albicans-expressiegegevens verkregen uit een eerder gepubliceerde studie17 en filterden kolonies uit die minder dan 600 unieke genen uitdrukken. Na het uitvoeren van de belangrijkste component (PC) analyse en een t-stochastische neighbor embedding (tSNE) dimensionaliteit reductie21, vonden we algemene overeenstemming tussen onze steekproef dataset en de referentie (Figuur 4A). PC-analyse bleek dat YFP en WH11 aanzienlijk bijgedragen aan de eerste twee PC's. Bovendien bracht de tSNE-analyse drie clusters(figuur 4B)aan het licht. Hoewel cluster 2 voornamelijk bestond uit cellen uit de monstergegevensset, bestonden clusters 0 en 1 uit cellen uit beide monsters. Door WH11-expressie op de tSNE (Figuur 4C, bovenste paneel) te overleggen, hebben we vastgesteld dat cluster 1 waarschijnlijk witte kolonies bevatte. We vonden ook dat STF2 expressie steeg in cluster 1 (Figuur 4C, lager paneel), in overeenstemming met eerder verkregen gegevens17. In clusters 0 en 2 werden WH11 en STF2 aanzienlijk gedereguleerd vergeleken met cluster 1 (figuur 4D). Genen die betrokken zijn bij fermentatie, zoals ADH1,werden upregulated in cluster 0, in overeenstemming met eerdere studies van ondoorzichtige cellen22. We ontdekten dat kolonies in cluster 2 ribosomal RNA hadden verminderd in vergelijking met kolonies in clusters 0 en 1. Hoewel de monster- en referentiedatasets werden verkregen met dezelfde voorraad cellen, suggereert dit resultaat dat zelfs subtiele verschillen in experimentele behandeling de genexpressie kunnen beïnvloeden.

figure-results-1
Figuur 1: Overzicht van de ICO-seq-workflow. (A) Gist groeien in een schorsing cultuur werden verdund in buffer en co-ingekapseld met gesmolten agarose in een flow-focusing druppel generator apparaat om de Poisson laden van agarose microgels met enkele gistcellen mogelijk te maken. De gels ingesteld wanneer de agarose afgekoeld, de olie / water suspensie was gebroken, en de olie werd verwijderd, waardoor een suspensie van gel kralen in water. Na de 's nachts kweek, gistcellen groeide uit tot isogene kolonies binnen de microgels. (B) Kolonies werden onderworpen aan een celwand degradatie buffer, waarna ze werden dicht verpakt en samen ingekapseld met mRNA vangen kralen in een tweede microfluïdische apparaat. De dichte verpakking van microgels zorgde ervoor dat elke druppel één gel had, terwijl poisson-belasting van de kralen de kans op meerdere kralen binnen één druppel verminderde. De verzamelde dalingen werden verwerkt voor cDNA synthese en generatie van een sequencing bibliotheek. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

figure-results-2
Figuur 2: Generatie isogene gistkolonies binnen agarose microgels met behulp van apparaat A. (A) Schema van microfluïdisch apparaat, met locaties van de drie ingangen en uitgangspoorten. De drop-making kruising is gemarkeerd in het rood. bB) Close-up van de valband tijdens het normale gebruik van de inrichting. (C) Micrograaf van verzamelde druppels, met een close-up van een druppel met een ingekapselde cel (begin). (D) Micrograaf van isogene gistkolonies in agarose microgels na een 24-uurs incubatie, met een close-up van twee kolonies (begin). Alle schaalbalken = 100 μm. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

figure-results-3
Figuur 3: Lysis en mRNA vangen uit isogene kolonies met behulp van apparaat B. (A) Schema van microfluïdisch apparaat, met locaties van de drie ingangen en uitgangspoorten. De drop-making kruising is gemarkeerd in het rood. (B) Micrograaf van gistkolonies na celwandvering, met een close-up van één kolonie (begin). (C) Close-up van de drop-making kruising tijdens de normale werking van het apparaat. (D) Micrograaf van verzamelde emulsies na microgel en kraal koppeling, met een close-up met een daling met een kraal en een lysed kolonie (inset). Alle schaalbalken = 100 μm. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

figure-results-4
Figuur 4: Analyse van wit-ondoorzichtige schakelrespons in C. albicans. aA) tSNE-plot van een monstergegevensset in combinatie met een referentiegegevensset van Liu17. (B) Clustering van transcriptomen onthult drie clusters gevisualiseerd op een tSNE perceel. (C) De belangrijkste genen die betrokken zijn bij de wit-ondoorzichtige schakelrespons droegen bij aan de variatie zoals bepaald door middel van de belangrijkste componentanalyse. dD) vioolpercelen van genormaliseerde expressieniveaus van YFP en WH11 door clusters die op tSNE-waarnemingspunten zijn gemarkeerd. **geeft p <<< 0.05 en * geeft p << 0.05 aan. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Aanvullende cijfers 1 en 2. Klik hier om deze filgures te downloaden.

Aanvullende bestanden 1-3. Klik hier om deze bestanden te downloaden.

Discussie

Onze methode voor isogene gistkolonie RNA sequencing (ICO-seq) past een gepubliceerd single cell RNA sequencing platform aan, Drop-Seq, voor high-throughput screening van gemanipuleerde giststammen. Gistcellen bevatten minder dan 10% van de kopieën van mRNA van een typische zoogdiercel en hebben een celwand die moet worden afgebroken voordat mRNA capture16. Deze twee factoren vormen een beletsel voor de directe toepassing van gist op Drop-Seq of andere op druppelen gebaseerde scRNA-seq-platforms. Om deze problemen aan te pakken, kapselen we enkele cellen in hydrogels en laten we ze uitgroeien tot kolonies om voldoende inputmateriaal te leveren voor RNA-sequencing en verteren we de gistcelwand om sferoplasten te genereren voorafgaand aan lyse en mRNA-opname. Deze wijzigingen voegen extra complexiteit toe in de ICO-seq-workflow in vergelijking met de oorspronkelijke Drop-Seq-workflow en zijn kritieke stappen die gebruikers moeten garanderen dat ze soepel verlopen.

Een goede werking van apparaat A is noodzakelijk voor het inkapselen van enkele gistcellen in agarose hydrogels. Een goede telling van de inputgistsuspensie moet worden gevolgd om het aantal hydrogels met meer dan één gistcel te minimaliseren, terwijl er voldoende hydrogels een enkele cel bevatten om een redelijke celopname-efficiëntie tijdens het vastleggen van mRNA te garanderen. Tijdens de werking van het microfluïdische apparaat moet het agarosegelmengsel goed worden opgelost en door een spuitfilter worden doorgegeven om de kans op verstopping van het apparaat te minimaliseren. De agarose gel mengsel is stroperig en de regio waarin een enkel kanaal splitst in acht is vooral gevoelig voor verstopping. Door een high-speed camera te centreren om de werking van het apparaat in die regio van het apparaat te visualiseren, kunnen gebruikers de uniformiteit van druppels die uit elk van de acht kanalen komen controleren en snel reageren als de uniformiteit verandert als gevolg van klompen in een van de kanalen. Inspectie van een kleine hoeveelheid verzamelde emulsie onder de microscoop biedt een secundaire methode voor het bevestigen van een hoogwaardige emulsie.

Na de groei van gistkolonies binnen hydrogels zijn verschillende voorzorgsmaatregelen nodig om de kwaliteit van mRNA-extractie op het niveau van één kolonie te waarborgen. Het is belangrijk om de tijd gist te optimaliseren zijn in hydrogel cultuur, want als de gist worden achtergelaten in de cultuur te lang, velen zullen ontsnappen aan de grenzen van de hydrogels, wat leidt tot een hoger achtergrondsignaal tijdens RNA sequencing en lagere gevoeligheid bij het onderscheiden tussen celtypes. De juiste generatie van sferoplasten met zymolyase zorgt ervoor dat mRNA zal worden vrijgegeven na celblootstelling aan lysis buffer. Visuele inspectie van gistkolonies na Zymolyase moet shiniergistcellen opleveren. Onjuiste celwandvertering zal leiden tot een lagere RNA-opname-efficiëntie. Ten slotte moeten de hydrogels dicht verpakt zijn als ze in apparaat B worden geïnjecteerd. Het monitoren van de hydrogel-ingang met een hogesnelheidscamera zal het mogelijk maken om de emulsie-verzameling te beëindigen zodra de hydrogels niet meer dicht bij invoer in het apparaat zijn verpakt, anders wordt de opname-efficiëntie beïnvloed.

Een potentiële zorg met onze methode is dat microgel cultuur van gist kan aanzienlijk veranderen genexpressie. Eerder onderzoek gist gen expressie in microgels en op agar tonen verschillen in genexpressie gemiddelden, maar over het algemeen een positieve correlatie17, hoewel verder onderzoek van deze claim op een verscheidenheid van gist stammen is voorzichtig. De methode heeft ook beperkte cel capture efficiëntie als gevolg van stochastische laden van mRNA capture kralen na Poisson statistieken14. Momenteel bevat ongeveer 10% van de druppels een kraal en een kolonie, en het percentage dubbele inkapselingen zal naar verwachting minder dan 1% bedragen. Dubbele inkapselingen leiden tot verwarrende elementen tijdens RNA-seq data-analyse en hun filtering blijft uitdagend23; een afvangsnelheid van 25% zou leiden tot een overeenkomstige toename van dubbele inkapselingen tot 5%(aanvullend figuur 2). Hoewel we ICO-seq demonstreren met behulp van het Drop-Seq-platform, zijn er andere druppel-RNA-seq-platforms die mRNA-capture beads deterministisch introduceren in plaats van statistisch, zoals het commercieel beschikbare 10x Genomics Chromium-platform15,24. De integratie van deze platforms met ICO-seq zou de efficiëntie van de vangst kunnen verhogen die verder gaat dan wat Poisson-statistieken toestaan. Ten slotte is een fundamentele beperking van druppelRNA-seq het onvermogen om cellen van belang na sequencing te herstellen. Met deze beperking moet rekening worden gehouden bij het overwegen van de soorten gistbibliotheken om deze methode te analyseren.

Cell-to-cell heterogeniteit is aangetoond op het kloonniveau voor microben zoals E. coli25 en S. cerevisiae26 onthullen nieuwe cel stelt dat een bulk-niveau analyse anders zou maskeren. Bulk RNA-seq-analyses uitgevoerd op C. albicans hebben de neiging om ofwel te kijken naar populatie-brede transcriptome veranderingen, of witte en ondoorzichtige cellen als twee afzonderlijke populaties27,28. De toepassing van ICO-seq zou kunnen leiden tot de ontdekking van extra substaten en een analytisch kader bieden voor het ontdekken van nieuwe celstaten binnen andere gistsoorten. De groei van cellen in hydrogels is echter niet beperkt tot gist: andere celtypen, zoals zoogdier,bacteriële en andere schimmelcellen kunnen ook worden gekweekt in hydrogels29,30. De sequencing van isogene kolonies versus enkele cellen leidt tot het gemiddeld uit biologische ruis als gevolg van cel-naar-cel variatie, het verbeteren van discriminatie tussen celtypes. Dit kan helpen bij het analyseren van cellen waar genetische diversiteit centra op specifieke synthese trajecten. De uitgebreide mogelijkheden van celtype input voor ICO-seq en de mogelijke integratie met commercieel beschikbare droplet RNA-seq platforms positioneert ICO-seq als een veelbelovend platform voor het ontleden van cellulaire heterogeniteit op genetisch niveau.

Openbaarmakingen

De auteurs verklaren geen belangenconflicten.

Dankbetuigingen

Dit project werd ondersteund door National Science Foundation Career Award DBI-1253293, National Institutes of Health New Innovator Award DP2AR068129 en verlenen R01HG008978, de National Science Foundation Technology Center verlenen DBI-1548297, en de UCSF Center for Cellular Construction. ARA en ZJG zijn Chan-Zuckerberg Biohub Onderzoekers.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
0.22 um spuitfilterMilipore SigmaSLGP033RS
0.5M EDTA, pH 8.0Thermo-Fisher15575020Wordt gebruikt om TE-TW-buffer te maken
0.75 mm biopsie punchWorld Precision Instruments504529
1 mL spuitenBD309628
1H,1H,2H-Perfluoro-1-Octanol (PFO)Sigma-Aldrich370533
1M Tris-HCI, pH 8.0Thermo-Fisher15568025Wordt gebruikt om TE-TW-buffer te maken
27 gauge naaldenBD305109
3 mL spuitenBD309657
3" siliconen wafers, P type, maagdelijk testkwaliteitUniversity Wafers447
3D-geprinte centrifugeer spuithouder(op maat)(op maat)Zie Aanvullende Bestanden voor 3D printbestand
Agarose, lage geltemperatuurSigma-Aldricha9414
Aquapel (hydrofobe glasbehandeling)Pittsburgh Glass Works47100
Drop-Seq BeadsChemGenesMACOSKO-2011-10
Glazen microscoopglazen (75 mm x 50 mm)Corning294775X50
Ionische Krytox oppervlakteactieve stofSynthese-instructies in ref 14. Kan worden vervangen door PEG-PFPE oppervlakteactieve stof.
IsopropanolSigma-Aldrich109827
NaClSigma-AldrichS9888
Novec 75003M98-0212-2928-5Veelgebruikte bekend als HFE 7500
PBSFisher ScientificBP243820
PE-2 polyethyleen buisScientific CommoditiesB31695-PE/2
PEG-PFPE oppervlakteactieve stofRan Biotechnologies008-FluoroSurfactant
PGMEA developerSigma-Aldrich484431
FotomaskersCadArt Servcies(op maat)Zie Aanvullende Bestanden voor maskerontwerpen
Spin coaterSpecialty Coating SystemsG3P-8
SSC BufferSigma-AldrichS6639
SU-8 2100MicroChemY111075
SU-8 2150MicroChemY111077
Sylgard 184 siliconen elastomeerkitKrayden4019862
Tween-20Sigma-AldrichP1379Wordt gebruikt om TE-TW-buffer te maken
YR Digestie bufferZymo ResearchR1001-1Spheroplasting buffer
YR Lysis BufferZymo ResearchR1001-2
ZymolyaseZymo ResearchE1005Spheroplasting enzymmengsel

Referenties

  1. Peralta-Yahya, P. P., Zhang, F., Del Cardayre, S. B., Keasling, J. D. Microbial engineering for the production of advanced biofuels. Nature. 488 (7411), 320-328 (2012).
  2. Curran, K. A., Alper, H. S. Expanding the chemical palate of cells by combining systems biology and metabolic engineering. Metabolic Engineering. 14 (4), 289-297 (2012).
  3. Botstein, D., Chervitz, S. A., Cherry, J. M. Yeast as a model organism. Science. 277 (5330), 1259-1260 (1997).
  4. Mager, W. H., Winderickx, J. Yeast as a model for medical and medicinal research. Trends in Pharmacological Sciences. 26 (5), 265-273 (2005).
  5. Krivoruchko, A., Siewers, V., Nielsen, J. Opportunities for yeast metabolic engineering: Lessons from synthetic biology. Biotechnology Journal. 6 (3), 262-276 (2011).
  6. Vanella, R., et al. Yeast-based assays for screening 11β-HSD1 inhibitors. Microbial Cell Factories. 15 (1), (2016).
  7. Zhuang, X., Chappell, J. Building terpene production platforms in yeast. Biotechnology and Bioengineering. 112 (9), 1854-1864 (2015).
  8. Agresti, J. J., et al. Ultrahigh-throughput screening in drop-based microfluidics for directed evolution. Proceedings of the National Academy of Sciences. 107 (9), 4004-4009 (2010).
  9. Wang, G., et al. RNAi expression tuning, microfluidic screening, and genome recombineering for improved protein production in Saccharomyces cerevisiae. Proceedings of the National Academy of Sciences. 116 (19), 9324-9332 (2019).
  10. Beneyton, T., et al. Droplet-based microfluidic high-throughput screening of heterologous enzymes secreted by the yeast Yarrowia lipolytica. Microbial Cell Factories. 16 (1), 18(2017).
  11. Sjostrom, S. L., et al. High-throughput screening for industrial enzyme production hosts by droplet microfluidics. Lab on a Chip. 14 (4), 806-813 (2014).
  12. Nadal-Ribelles, M., et al. Sensitive high-throughput single-cell RNA-seq reveals within-clonal transcript correlations in yeast populations. Nature Microbiology. 4 (4), 683-692 (2019).
  13. Gasch, A. P., et al. Single-cell RNA sequencing reveals intrinsic and extrinsic regulatory heterogeneity in yeast responding to stress. PLoS Biology. 15 (12), 2004050(2017).
  14. Macosko, E. Z., et al. Highly parallel genome-wide expression profiling of individual cells using nanoliter droplets. Cell. 161 (5), 1202-1214 (2015).
  15. Klein, A. M., et al. Droplet barcoding for single-cell transcriptomics applied to embryonic stem cells. Cell. 161 (5), 1187-1201 (2015).
  16. von der Haar, T. A quantitative estimation of the global translational activity in logarithmically growing yeast cells. BMC Systems Biology. 2, 87(2008).
  17. Liu, L., Dalal, C. K., Heineike, B. M., Abate, A. R. High throughput gene expression profiling of yeast colonies with microgel-culture Drop-seq. Lab on a Chip. 19 (10), 1838-1849 (2019).
  18. Fallah-Araghi, A., Baret, J. C., Ryckelynck, M., Griffiths, A. D. A completely in vitro ultrahigh-throughput droplet-based microfluidic screening system for protein engineering and directed evolution. Lab on a Chip. 12 (5), 882-891 (2012).
  19. Berman, J., Sudbery, P. E. Candida albicans: A molecular revolution built on lessons from budding yeast. Nature Reviews Genetics. 3 (12), 918-930 (2002).
  20. Srikantha, T., Soll, D. R. A white-specific gene in the white-opaque switching system of Candida albicans. Gene. 131 (1), 53-60 (1993).
  21. van der Maaten, L., Hinton, G. Visualizing data using t-SNE. Journal of Machine Learning Research. 9, 2579-2605 (2008).
  22. Sun, Y., et al. Deletion of a yci1 domain protein of Candida albicans allows homothallic mating in MTL heterozygous cells. mBio. 7 (2), 00465-00516 (2016).
  23. McGinnis, C. S., Murrow, L. M., Gartner, Z. J. DoubletFinder: Doublet Detection in Single-Cell RNA Sequencing Data Using Artificial Nearest Neighbors. Cell Systems. 8 (4), 329-337 (2019).
  24. Baran-Gale, J., Chandra, T., Kirschner, K. Experimental design for single-cell RNA sequencing. Briefings in Functional Genomics. 17 (4), 233-239 (2018).
  25. Silander, O. K., et al. A Genome-Wide Analysis of Promoter-Mediated Phenotypic Noise in Escherichia coli. PLoS Genetics. 8 (1), 1002443(2012).
  26. Newman, J. R. S., et al. Single-cell proteomic analysis of S. cerevisiae reveals the architecture of biological noise. Nature. 441 (7095), 840-846 (2006).
  27. Tuch, B. B., et al. The Transcriptomes of Two Heritable Cell Types Illuminate the Circuit Governing Their Differentiation. PLoS Genetics. 6 (8), 1001070(2010).
  28. Romo, J. A., et al. Global Transcriptomic Analysis of the Candida albicans Response to Treatment with a Novel Inhibitor of Filamentation. mSphere. 4 (5), 00620(2019).
  29. Huang, H., et al. Generation and manipulation of hydrogel microcapsules by droplet-based microfluidics for mammalian cell culture. Lab on a Chip. 17 (11), 1913-1932 (2017).
  30. Lin, X., Nishio, K., Konno, T., Ishihara, K. The effect of the encapsulation of bacteria in redox phospholipid polymer hydrogels on electron transfer efficiency in living cell-based devices. Biomaterials. 33 (33), 8221-8227 (2012).

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Droplet RNA sequencinghigh throughput screeninghydrogel inkapselingspheroplastie van gistmicroflu disch apparaatDrop seq protocolcDNA syntheseprincipale componentenanalysetSNE dimensionaliteitsreductie

Gerelateerde artikelen