Methodenartikel

Meten RAN Peptide Toxiciteit in C. elegans

DOI:

10.3791/61024

⸱

30 april 2020

 ,  ,  , 
1Graduate Program in Cell Biology and Molecular Physiology, University of Pittsburgh, 2Department of Pediatrics, University of Pittsburgh School of Medicine

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Herhaal-geassocieerde niet-ATG-afhankelijke translationele producten zijn opkomende pathogene kenmerken van verschillende herhaalde expansie-gebaseerde ziekten. Het doel van het beschreven protocol is om toxiciteit veroorzaakt door deze peptiden te evalueren met behulp van gedrags-en cellulaire testen in het modelsysteem C. elegans.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

C. elegans wordt vaak gebruikt voor het modelleren van leeftijdsgebonden neurodegeneratieve ziekten veroorzaakt door herhaalde expansiemutaties, zoals Amyotrofische Laterale Sclerose (ALS) en de ziekte van Huntington. Onlangs werd aangetoond dat herhaald expansiebevattend RNA het substraat is voor een nieuw type eiwitvertaling dat herhaal-geassocieerde niet-AUG-afhankelijke (RAN)-vertaling wordt genoemd. In tegenstelling tot canonieke vertaling vereist RAN-vertaling geen startcodon en treedt alleen op wanneer herhalingen een drempellengte overschrijden. Omdat er geen begincodon is om het leeskader te bepalen, vindt RAN-vertaling plaats in alle leesframes van zowel sense- als antisense RNA-sjablonen die een herhalingsuitbreidingsreeks bevatten. Daarom breidt RAN-vertaling het aantal mogelijke ziektegerelateerde toxische peptiden uit van één naar zes. Tot nu toe is ran vertaling gedocumenteerd in acht verschillende repeat expansion-based neurodegeneratieve en neuromusculaire ziekten. In elk geval is het ontcijferen van welke RAN-producten giftig zijn, evenals hun mechanismen van toxiciteit, een cruciale stap in de richting van inzicht in hoe deze peptiden bijdragen aan de pathofysiologie van de ziekte. In dit artikel presenteren we strategieën om de toxiciteit van RAN peptiden in het modelsysteem C. elegans te meten. Ten eerste beschrijven we procedures voor het meten van RAN peptide toxiciteit op de groei en beweeglijkheid van het ontwikkelen van C. elegans. Ten tweede detaileren we een test voor het meten van postontwikkelings-, leeftijdsafhankelijke effecten van RAN peptiden op beweeglijkheid. Ten slotte beschrijven we een neurotoxiciteitstest voor het evalueren van de effecten van RAN-peptiden op neuron morfologie. Deze tests bieden een brede beoordeling van ran peptide toxiciteit en kan nuttig zijn voor het uitvoeren van grootschalige genetische of kleine molecuul schermen om ziekte mechanismen of therapieën te identificeren.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De ongepaste uitbreiding van DNA-herhalingssequenties is de genetische basis voor verschillende neurodegeneratieve ziekten zoals amyotrofische laterale sclerose (ALS), frontotemporale dementie (FTD) en de ziekte van Huntington (ZvH)1. Hoewel er gevestigde cellulaire en dierlijke modellen voor deze ziekten, mechanismen die ten grondslag liggen aan deze voorwaarden zijn niet goed gedefinieerd. De ZvH wordt bijvoorbeeld veroorzaakt door de uitbreidingen van een CAG herhalingssequentie in de coderingssequentie voor het Huntingtine eiwit Htt2. Omdat CAG codeert het aminozuur glutamine, de CAG herhalen expansie resulteert in het inbrengen van een polyGlutamine, of polyQ, sequentie binnen Htt. Uitgebreide polyQ eiwitten vormen lengte- en leeftijdsafhankelijke eiwitaggregaten die worden geassocieerd met toxiciteit3,4. Verrassend genoeg suggereren twee recente studies dat de lengte van de polyQ-sequentie niet de belangrijkste drijfveer is voor het begin van de ZvH ziekte, wat suggereert dat polyQ-onafhankelijke factoren ook kunnen bijdragen aan de ziekte5,6.

Een mogelijk polyQ-onafhankelijk mechanisme betreft een nieuw ontdekt type eiwitvertaling dat Repeat Associated Non-AUG-dependent (RAN) vertaling7wordt genoemd. Zoals de naam al aangeeft, ran vertaling treedt alleen op wanneer een uitgebreide herhaling sein en vereist geen canonieke start codon. Daarom vindt RAN-vertaling plaats in alle drie de leesframes van de herhaling om drie verschillende polypeptiden te produceren. Bovendien, omdat veel genen ook een antisense transcript produceren dat de omgekeerde aanvulling van de uitgebreide herhalingssequentie bevat, komt RAN-vertaling ook voor in alle drie de leesframes van het antisense transcript. Samen breidt RAN-vertaling het aantal eiwitten uit dat wordt geproduceerd uit een uitgebreide herhalende DNA-sequentie van één peptide naar zes peptiden. Tot op heden is ran-vertaling waargenomen in ten minste acht verschillende herhalingsstoornissen8. RAN peptiden worden waargenomen in postmortem patiënt monsters en alleen in gevallen waarin de patiënt draagt een uitgebreide herhaling9,10. Hoewel deze peptiden duidelijk aanwezig zijn in patiëntencellen, is hun bijdrage aan de pathofysiologie van de ziekte onduidelijk.

Om de potentiële toxiciteit in verband met RAN peptiden beter te definiëren, hebben verschillende groepen elk peptide uitgedrukt in verschillende modelsystemen, zoals gist, vliegen, muizen en weefselkweekcellen11,12,,13,14,15,16. In plaats van gebruik te maken van de herhalingsvolgorde voor expressie, maken deze modellen gebruik van een codon-variatie benadering waarbij de herhalingssequentie wordt geëlimineerd, maar de aminozuursequentie behouden blijft. Vertaling initiatie vindt plaats via een canonieke ATG en het peptide is meestal gesmolten tot een fluorescerend eiwit op ofwel de N- of C-eindpunt, geen van beide lijkt te interfereren met RAN peptide toxiciteit. Daarom drukt elke constructie een enkel RAN-peptide uit. Het modelleren van de verschillende RAN-producten in een meercellig organisme met eenvoudige tests om ran peptide toxiciteit te meten is van vitaal belang om te begrijpen hoe de verschillende RAN-producten van elke ziekte-veroorzakende herhaalde expansie bijdragen aan cellulaire disfunctie en neurodegeneratie.

Net als andere modelsystemen biedt C. elegans een flexibel en efficiënt experimenteel platform dat studies van nieuwe ziektemechanismen mogelijk maakt, zoals RAN peptide toxiciteit. Wormen bieden verschillende unieke experimentele attributen die momenteel niet beschikbaar zijn in andere modellen van RAN peptide toxiciteit. Ten eerste, C. elegans zijn optisch transparant vanaf de geboorte tot de dood. Dit zorgt voor eenvoudige visualisatie van RAN peptide expressie en lokalisatie, evenals in vivo analyse van neurodegeneratie bij levende dieren. Ten tweede, transgene methoden voor het genereren van RAN peptide expressie modellen zijn goedkoop en snel. Gezien de korte driedaagse levenscyclus van C. elegans,kunnen stabiele transgene lijnen die een bepaald RAN-peptide op een celtypespecifieke manier uitdrukken, in minder dan een week worden geproduceerd. Ten derde kunnen eenvoudige fenotypische uitgangen worden gecombineerd met genetische screeningsmethoden, zoals chemische mutagenese of RNAi-screening, om snel genen te identificeren die essentieel zijn voor ran peptidetoxiciteit. Tot slot, de korte levensduur van C. elegans (~ 20 dagen) stelt onderzoekers in staat om te bepalen hoe veroudering, dat is de grootste risicofactor voor de meeste herhalen expansieziekten, ran peptide toxiciteit beïnvloedt. Samen is deze combinatie van experimentele kenmerken ongeëvenaard in elk ander modelsysteem en biedt een krachtig platform voor de studie van RAN peptide toxiciteit.

Hier beschrijven we verschillende tests die gebruik maken van de experimentele voordelen van C. elegans om de toxiciteit van RAN peptiden te meten en om genetische modifiers van deze toxiciteit te identificeren. De codon-gevarieerde ATG-geïnitieerde RAN peptiden zijn gelabeld met GFP en individueel uitgedrukt in ofwel spiercellen onder de myo-3 promotor of in GABAergic motorneuronen onder de unc-47 promotor. Voor expressie in spiercellen is het belangrijk dat giftige RAN peptiden worden gelabeld met groene fluorescerende eiwitten (GFP), of andere fluorescerende eiwit (FP) tag die kan worden gericht met een RNAi voedingsvector. Dit komt omdat giftige RAN peptide expressie meestal blokkeert de groei, waardoor dergelijke stammen niet levensvatbaar. Het gebruik van gfp(RNAi) activeert voorwaardelijk RAN peptide expressie en maakt stam onderhoud, genetische kruisen, enz. Voor tests worden deze dieren verwijderd uit gfp(RNAi),waardoor het RAN peptide en de resulterende fenotypes kunnen worden expressie. Naast de moleculaire strategie voor het ontwerpen van codon-gevarieerde RAN peptide expressie constructies, beschrijven we assays voor het meten van ontwikkelingstoxiciteit (larval beweeglijkheid en groei test), post-ontwikkelingsleeftijd-geassocieerde toxiciteit (verlamming assay), en neuron morfologische gebreken (commissure assay).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Het genereren van codon-gevarieerde RAN peptide expressie constructies

  1. Ontwerp de individuele RAN peptide codering sequentie met behulp van synoniem codons om de fundamentele repetitieve DNA / RNA-structuur te elimineren, maar het behoud van de bovenliggende aminozuur sequentie.
  2. Bestel de aangepaste codon sequenties commercieel op de herhalingslengtes die nodig zijn voor de studies (meestal 5-100 herhalingen). Neem een HindIII-beperkingssite op aan het einde van 5 en een BamHI-beperkingssite aan het einde van 3 om het klonen in C. elegans-expressievectoren te vergemakkelijken, zoals pPD95.79.
    OPMERKING: Als de synthese van grotere constructies moeilijk blijkt, kunnen kleinere bouwsteensequenties worden gesynthetiseerd en vervolgens in grotere herhalingen worden ingebouwd met behulp van een directionele ligatiestrategie17.
  3. Subclone de peptide sequentie in een C. elegans expressie vector met behulp van standaard T4 ligatie methoden.
  4. Subclone een cel type-specifieke promotor sequentie gegenereerd door PCR in de voorkant van de RAN peptide sequentie om weefsel-specifieke RAN peptide-GFP expressie rijden.
  5. Microinject de RAN peptide constructie in de gonad van wilde type C. elegans om transgene stammen met extrachromosomale arrays met behulp van standaard methoden18genereren. Voor een co-injectie marker, de spier-specifieke RFP verslaggever(myo-3p::RFP (pCFJ104)) werd gebruikt, hoewel andere markers kunnen ook worden gebruikt.
  6. Integreer een stabiel transgeen in het genoom met behulp van standaard C. elegans integratie screening methoden19.
  7. Als het RAN-peptide giftig is en transgene dieren niet overleven, voeden dieren gfp (RNAi) die bacteriën pre- en post-injectie uitdrukken om de expressie van het giftige eiwit het zwijgen op te leggen.
    OPMERKING: Het verwijderen van dieren uit gfp(RNAi) maakt ran peptide expressie voor fenotypische analyses met behulp van de onderstaande tests.

2. Het meten van de ontwikkelingstoxiciteit van RAN peptiden na RNAi-gebaseerde gen knockdown: Video snelheid analyse protocol

  1. Giet standaard nematode groeimedium (NGM) RNAi 24 putplaten met 1 mM isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) en 25 μg/mL carbenicillin.
  2. Streep RNAi-voedende klonen in HT115 bacteriën die moeten worden getest op Luria bouillon (LB) + carbenicillin (25 μg/mL) agar platen en kweek bacteriën bij 37 °C voor 24 uur. Neem lege vector (RNAi) op als de positieve controle voor toxiciteit en gfp(RNAi) als negatieve controle.
  3. Voor elke kloon, kies een enkele kolonie in 1 mL lb + carbenicillin vloeibare media en groeien bacteriën 's nachts gedurende 18 uur bij 37 °C tijdens het schudden bij 250 rotaties per minuut (RPM).
  4. Spot vier individuele putten van de NGM RNAI 24 putten met 20 μL van de volgende nachtelijke bacteriële culturen: kolom 1 putten = gfp(RNAi); kolom 2 putten = (EV)RNAi; kolommen 3-6 putten = RNAi tegen te testen genen. Laat RNAi-bacteriën 's nachts bij kamertemperatuur (RT) dsRNA-productie opwekken.
  5. Isoleer eieren vanaf dag één volwassen C. elegans uitdrukken van de geïntegreerde RAN peptide transgene met behulp van de standaard hypochloriet methode en zaad ~ 30 C. elegans eieren in elke put van de NGM RNAi 24 goed plaat.
  6. Incubeer de 24 putten bij 20 °C gedurende 7 dagen.
    OPMERKING: Deze incubatietijd is voor stammen die giftige C9orf72 RAN-dipeptiden uitdrukken, zoals PR50 of GR50. Andere stammen kunnen kortere incubatietijden vereisen om uitputting van de bacteriële voedselbron en de daaropvolgende honger te voorkomen.
  7. Verkrijg uitgezonden lichtvideo's met behulp van een Leica MZ16FA stereoontledenmicroscoop uitgerust met een DFC345FX monochrome camera die is aangesloten op een Windows-compatibele pc met Leica AF-video-acquisitiesoftware (versie 2.6.0.7266).
    1. Verkrijg twee video's van twee afzonderlijke putten voor elke RNAi-voorwaarde met behulp van consistente instellingen voor video-acquisitie tussen putten. Voor elke video, verwerven 10 seconden op 800 x 600 pixel resolutie en 13,16 frames per seconde (tijd voxel dimensie = 0,076 seconden) met behulp van 18,6 x vergroting (1,49 zoom instelling in AF software). Stel de belichtingstijd van de afbeelding in op 4 milliseconden. Label elke video onmiddellijk met de stam, RNAi conditie, en goed nummer.
  8. Rol de experimenter af op het genotype dat aan elk videobestand is gekoppeld door de volgorde van de video's te randomiseren en de naam van de video's in getallen te wijzigen. Sla deze groep video's op als een nieuw bestand. Maak de experimentator ontblind nadat de analyse is voltooid.
  9. Meet de 'afgelegde afstand' en de lengte van elk dier voor 20 verschillende dieren uit elke video, waarbij een totaal van ~ 40 wormen voor elke RNAi-aandoening wordt onderzocht.
    1. Selecteer in de software de knop annotatiegereedschappen en vervolgens het tekstgereedschap tekenen. Klik op een punt in het midden van de worm wordt gemeten in het eerste frame van de video en markeren als een getal. Ga de video naar het einde terwijl je het bewegingspad van de worm visueel volgt. Klik in het laatste frame op een punt in het midden van de worm dat wordt gemeten en markeer het volgende overeenkomstige getal. Teken vervolgens met het gereedschap Draw scalebar een lijn van het eerste getal naar het tweede getal om de afgelegde afstand op te nemen.
    2. 'Afgelegde afstand' is de afstand tussen de twee centroidpunten. Deze afstand wordt naast de meetlijn weergegeven. Neem deze meting op in een spreadsheet. Herhaal deze meting voor 19 andere wormen in de video met behoud van elke individuele meting in het analysevenster.
  10. Maak metingen van dieren die de meest robuuste beweging vertonen om te voorkomen dat dieren geen beweging vertonen en de gegevens in de richting van verlamming beïnvloeden. Zodra de metingen zijn voltooid, neemt u een momentopname van het uiteindelijke videoframe dat alle meetlijnen illustreert, zodat de gegevens kunnen worden herleid tot het dier waaruit het is ontstaan.
  11. Analyseer de gegevens met behulp van een spreadsheet met vier kolommen. Kolom één is de worm "identifier", kolom twee is de afgelegde afstand / tijd (snelheid).
    1. De tijd van elke video kan worden gevonden door met de rechtermuisknop op de video onder het experiment te klikken en naar de eigenschappen van de video te gaan.
  12. Normaliseer de snelheidsmeting door de lengte van elk dier te vinden door Kwantificeren te selecteren en vervolgens Statistieken over de software. Als u op het pictogram van het annotatiegereedschap op het videoscherm klikt, moet het gebruik van het gereedschap 'Polyline tekenen' mogelijk maken. Deze tool kan vervolgens worden gebruikt om de C. elegans vrij te traceren van de video van het puntje van het hoofd tot het puntje van de staart. De lengte van de lijn wordt geregistreerd in het kader van statistieken.
    1. Maak een momentopname van het uiteindelijke videoframe dat alle polyline's illustreert die worden gebruikt voor het dimensioneren van de C. elegans, zodat de gegevens kunnen worden herleid tot het dier waaruit ze afkomstig zijn.
  13. Analyseer de gegevens door twee extra kolommen aan de spreadsheet toe te voegen. Kolom drie is de "Dierlengte", en kolom vier is de "Genormaliseerde snelheid" (snelheid /dierlengte). Analyseer de genormaliseerde snelheidsgegevens met behulp van een One-way ANOVA met post-hoc testen versus lege vector (RNAi).

3. Het meten van ontwikkelingstoxiciteit van RAN peptide: Groeitest

  1. Pick ~30 gravid dieren in een 50 μL-spot van hypochlorietoplossing (10 mL bleekmiddel, 2,5 mL van 10 N NaOH, 37,5 mL dH2O) op een gfp(RNAi), (EV)RNAi, of (genspecifiek) 6 cm RNAi plaat.
  2. Na 24 uur zes transgene nakomelingen die uit de hypochlorietoplossingsplek zijn gekropen, verplaatsen naar een nieuwe RNAi-plaat van 6 cm die identiek is aan de RNAi-omstandigheden op de plaat waarop ze aan de behandeling van de hypochlorietoplossing zijn onderworpen. Zet deze nakomelingen (F1) op 20 °C om te groeien en te reproduceren.
  3. Na 24-48 uur, kies 10 transgene L4 dieren op 6 cm RNAi die overeenkomen met de RNAi-omstandigheden waarop de dieren hebben gegroeid. Laat de dieren 24 uur lang eieren leggen in een couveuse van 20 °C.
  4. Na 24 uur, verwijder de volwassen dieren en gooi ze weg. Tel het aantal eieren en L1 larven gelegd tijdens de periode van 24 uur met behulp van een mechanische handheld teller. Dit is de totale broodgrootte.
  5. Tel de komende 72 uur het aantal dieren dat de L4 of ouder bereikt. Als elk dier wordt geteld, verwijder het van de plaat.
  6. Kwantificeer de "Procentgroei" als het percentage dieren dat de L4 of ouder bereikt uit de totale broedgrootte.
  7. Voer een exacte test van 2 x 2 Fisher uit versus lege vector (RNAi) om te bepalen of de procentgroei statistisch significant is. De categorieën ter vergelijking zijn "Groei" (# van de dieren die de L4 of ouder stadium bereikt in 72 uur) en "Geen groei" (totale broedgrootte minus het aantal dieren bereiken L4 of ouder stadium in 72 uur).

4. Post-ontwikkelingsgerichte RAN peptide verlamming test

  1. Behoud geïntegreerde C. elegans transgene stammen die RAN peptide-GFP uitdrukken in de spier op gfp(RNAi) door 4-6 transgene L4's op een 6 cm gfp(RNAi) plaat te plaatsen en de wormen op 20 °C te laten groeien.
  2. Als het experiment RNAi gebruikt om te testen op genetische effecten op ran peptide toxiciteit, verplaats 10 transgene gravid volwassenen van een niet-uitgehongerde plaat naar elk van twee 6 cm lege vector(RNAi) (positieve controle op verlamming, negatieve controle voor genetische effecten), gfp(RNAi) (negatieve controle voor verlamming, positieve controle voor genetische effecten), genspecifieke(RNAi) (d.w.z. 10 gravid volwassenen per 6 cm).
  3. Als mutanten worden gebruikt om genetische effecten op ran peptide toxiciteit te analyseren, plaats 10 gravid WT of gemuteerde dieren uitdrukken van dezelfde RAN transgeen op elk van twee 6 cm lege vector(RNAi) of gfp (RNAi) platen. Laat de wormen 48 uur lang op 20 °C groeien.
  4. Kies 10 sets van 10 transgene L4's van de 6 cm RNAi platen en plaats elke set op een RNAi plaat van 3 cm (d.w.z. n = 100 dieren voor elk genotype). Zorg ervoor dat de L4's geselecteerd voor de test hebben allemaal oppervlakkig normale beweeglijkheid. Plaats de platen in een rits opbergzak om vocht vast te houden.
  5. Plaats de ingepakte platen met L4's in de couveuse van 25 °C.
  6. Verwijder de dieren 24 uur later uit de 25 °C-couveuse één stam tegelijk om de tijd dat ze bij RT zijn buiten te minimaliseren.
  7. Tik op de platen op de ontledende microscoop om te controleren op beweging. Als de dieren zich meer dan een lichaamslengte bewegen, tel het dier als mobiel en breng het over naar een nieuwe 3 cm RNAi plaat. Gebruik een platina pick om de resterende wormen op de kop of staart te tikken. Als het dier meer dan een lichaamslengte beweegt, tel het dier als mobiel en breng het over naar een nieuwe 3 cm RNAi plaat.
    LET OP: Niet meer dan 10 wormen per plaat bij het overbrengen. Wees voorzichtig om te voorkomen dat het verplaatsen van nakomelingen naar de nieuwe RNAi plaat, omdat de test is afhankelijk van het volgen van oude dieren alleen.
  8. Groepeer alle niet-bewegende wormen samen, zodat beweging van meer dan een lichaamslengte gemakkelijk kan worden gedetecteerd. Geef het dier ten minste één minuut om meer dan één lichaamslengte te verplaatsen. Als het nog steeds niet beweegt, is het verlamd, verpakt (dat wil zeggen, larven uitgebroed in moeder), of dood.
  9. Censureer dieren die zakken vertonen, uitdrogen aan de zijkanten van de plaat, vertonen geëxtrudeerde darmen, hol, verloren gaan, of sterven aan de test op het moment van detectie. Verlamde wormen worden geteld, achtergelaten op de oude RNAi plaat, en weggegooid.
  10. Scoor de dieren elke dag 5-7 dagen op verlamming, zoals beschreven in stappen 4.6–4.9.
  11. Analyseer verlammingsgegevens met een log-rank test die identiek is aan de test die wordt gebruikt om de levensduur te analyseren. In deze statistische analyse, bewegende wormen worden gescoord als "Alive", verlamde wormen worden gescoord als "Dood", en dood, zakken, darm geëxtrudeerd, uitgedroogd, gegraven, of anderszins verloren wormen worden gescoord als "Gecensureerd".
    OPMERKING: In deze analyse geeft het getal 'Procent levend' de dieren 'Procent bewegen' aan. Het omgekeerde vertegenwoordigt de "Procent Verlamd". Gebruik de online analysetool OASIS(https://sbi.postech.ac.kr/oasis2/)om de log-rank statistische analyses uit te voeren.

5. Het meten van neuron pathologie: Commissure test

  1. Genereren transgene C. elegans uitdrukken van de RAN peptide van belang in de GABAergic neuronen met behulp van de unc-47 promotor. Ook express unc-47p::GFP of unc-47p::RFP om de cellulaire morfologie van de GABA neuronen te onthullen.
  2. Pluk 50 transgene L4 dieren en leg ze 24 uur lang op een OP50-plaat van 6 cm bij 25 °C.
  3. Breng de 50 transgene dieren gedurende 24 uur op een nieuwe 6 cm OP50 plaat bij 25 °C.
  4. Maak agarose pads voor beeldvorming van de dieren onder widefield microscopie.
    1. Plaats twee stukken tape op twee microscoopdia's. Plaats een gereinigde dia zonder tape in het midden van de twee afgeplakte dia's.
    2. Afzien ~ 100 μL (1 druppel van een wegwerp plastic Pasteur pipet) van 3% gesmolten agarose op de middelste glijbaan met een wegwerp steriele overdracht pipet.
    3. Plaats onmiddellijk een tweede schone dia over de druppel gesmolten agarose, zodat deze op de afgeplakte dia's rust en een dunne en gelijkmatige laag agarose tussen de dia's creëert.
    4. Nadat de agarose is afgekoeld en gestold, verwijder voorzichtig de twee dia's met de laag van agarose ertussen, zonder ze te scheiden, en plaats ze in een plastic zak met een vochtig stuk papier eronder. Maak een dia per 10 wormen te onderzoeken, samen met drie extra dia's.
  5. Verwijder de transgene C. elegans uit de couveuse van 25 °C en pluk 10 transgene C. elegans in een 100 μL-druppel van 10 mM levamisole in een glazen depressiedia. Incubeer gedurende 10 minuten of totdat de dieren verlamd zijn.
  6. Verwijder een schuifpaar uit de plastic zak en scheid ze voorzichtig. Label de dia met de agarose met het genotype en voeg 2 μL van 10 mM levamisole toe aan het midden van de agarose. Verplaats de 10 dieren in de levamisole op het agarosepad. Bedek de dieren met een #1 dikte coverslip.
  7. Beeld dieren waarin de vulva is zo georiënteerd dat het aan de rechterkant van het dier. Als de vulva zich aan de linkerkant van het hoofd bevindt, zullen de commissures van de motorneuronen onder de dieren liggen en niet zo duidelijk zichtbaar, waardoor nauwkeurige kwantificering moeilijk wordt. Kwantificeren van deze dieren weg. In deze oriëntatie zijn de commissures van de motorneuronen het dichtst bij het uitglijder en zijn ze duidelijk zichtbaar op een omgekeerde breedveldfluorescentiemicroscoop. Visualiseer de neuron commissures uitdrukken GFP met een Leica DMI4000B omgekeerde widefield fluorescentie microscoop met een 63X 1.4X NA olie onderdompeling lens en een Leica L5 GFP filter set (Ex480/40nm; Em527/30nm). Als de neuron commissures Express RFP in plaats van GFP, gebruik maken van een Leica TX2 RFP filterset (Ex560/40nm; Em645/75nm).
    1. Visualiseer de neuron commissures uitdrukken GFP met een omgekeerde widefield fluorescentie microscoop met een 63x 1.4x NA olie onderdompeling lens en een GFP filter set (Ex480/40 nm; Em527/30 nm). Als het neuron RFP in plaats van GFP uitdrukt, gebruikt u een rode fluorescerende eiwitfilterset (Ex560/40 nm; Em 645/75 nm).
  8. Beeld de wormen binnen 45 min na het plaatsen van de coverslip op de wormen om toxiciteit van immobilisatie te minimaliseren.
  9. Tel voor elke worm het aantal zichtbare commissures. Er zijn 16 zichtbare commissures bij wilde dieren. Tel ook het aantal commissures dat grote kralen (dat wil zeggen, blebs) in de commissures evenals het aantal commissures die zijn gebroken. Om te bevestigen dat de commissure is verbroken, volgt u de commissure van het rugkoord naar het ventrale koord door het brandpuntsvlak aan te passen.
    OPMERKING: Commissures waarin de unc-47p::GFP fluorescentie vertoont een kloof worden beschouwd als gebroken. Een gebroken commissure heeft meestal een bleb aan weerszijden van de pauze, helpen laten zien dat de commissures is gebroken. Tel de hoeveelheid blebbing en pauzes voor 20 wormen.
  10. Bereken de fractie van commissures met blebs of pauzes over het totale aantal waargenomen commissures voor elk dier. Het absolute aantal commissures geteld per dier (inclusief wild type, blebbed, en gebroken gebeurtenissen) kan ook worden gemeten.
  11. Bereken voor elke categorie het gemiddelde ± SD en analyseer statistisch met een T-test van een student voor vergelijking tussen twee populaties, of een eenrichtings-ANOVA voor vergelijkingen tussen 3 of meer populaties.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

We gebruikten de hier beschreven tests om het effect van verschillende genremmingen op de toxiciteit van RAN-dipeptiden te evalueren die worden aangetroffen bij ALS-patiënten met een herhaalexpansie van G4C2. Met behulp van de groeitest om ontwikkelingstoxiciteit te meten, analyseerden we de effecten van verschillende genetische knock-out mutanten die werden geïdentificeerd in een genoombrede RNAi-schermsuppressors van pr50-GFP-toxiciteit met spieruitgedrukt. Terwijl de expressie van PR50-GFP alleen...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hier rapporteren we methoden die kunnen worden gebruikt om RAN peptide toxiciteit gemodelleerd in de spier of in de neuronen van C. elegansassay. Terwijl neurodegeneratieve eiwitten een leeftijd begin fenotype bij menselijke patiënten hebben, kunnen ze ook ontwikkelingstoxiciteit vertonen wanneer overuitgedrukt in modelsystemen. Overexpressie heeft aanzienlijke interpretatieve beperkingen, maar het biedt ook een krachtig uitgangspunt voor genetische of farmacologische schermen gericht op het identificeren van ge...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

NIH R21NS107797

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
35mm x 10mm Petri Dish, SterileCELLTREAT Scientific Products50-202-036Nematode groeiplaten en RNAi
AGAR GRANULATED 2KILOGRAMBD DIAGNOSTIC SYSTEMSDF0145070Nematode groeiplaten en RNAi
AGAROSE ULTRAPURELIFE TECHNOLOGIES16500500Micro-injectie om RAN-peptide transgene stammen te genereren
CARBENICILLIN 5GTHERMO SCI FAIRLAWN CHEMICALSBP26485Nematode groeiplaten en RNAi
COVER GLASSES NO 1 22MM 1OZ/PKTHERMO SCI ERIE12542BBeeldvorming voor commissure-assay
FEMOTIPS DISPSBL MICROINJ 20CSEPPENDORF NORTH AMERICA BIOTOOLSE5242952008Micro-injectie om RAN-peptide transgene stammen te genereren
FF COV GLASS NO1 40X22MM 1OZPKTHERMO SCI ERIE125485CMicro-injectie om RAN-peptide transgene stammen te genereren
Fisherbrand Superfrost Plus Microscope SlidesTHERMO SCI ERIE12-550-15Beeldvorming voor commissure-assay
Gibco Bacto Peptone Gibco DF0118-17-0Nematode groeiplaten en RNAi
HALOCARBON OIL 700SIGMA-ALDRICH INCH8898-50MLMicro-injectie om RAN-peptide transgene stammen te genereren
IPTG BIOTECH 10GTHERMO SCI FAIRLAWN CHEMICALSBP162010Nematode groeiplaten en RNAi
Leica Advanced Fluorescence imaging softwareLeica MicrosystemsLAS-AFBeeldverwervingssoftware voor video-snelheidsanalyse en commissure-assay
Leica Immersion type N (Oil)W NUHSBAUM INCNC9547002Beeldvorming voor commissure-assay
LEVAMISOLE HYDROCHLORIDE 10GRTHERMO SCI ACROS ORGANICSAC187870100Beeldvorming voor commissure-assay
MICROLOADER TIPS 2 X 96 PCSEPPENDORF NORTH AMERICA BIOTOOLSE5242956003Micro-injectie om RAN-peptide transgene stammen te genereren

PETRI DISH, 60X15MM,500/CS		CORNING LIFE SCIENCES PLASTICFB0875713ANematode groeiplaten en RNAi
TISSUE CULT PLATE 24WEL 50/CSCORNING LIFE SCIENCES DL87721Nematode groeiplaten en RNAi

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Cleary, J. D., Ranum, L. P. Repeat associated non-ATG (RAN) translation: new starts in microsatellite expansion disorders. Current Opinion in Genetics and Development. 26, 6-15 (2014).
  2. The Huntington's Disease Collaborative Research Group. A novel gene containing a trinucleotide repeat that is expanded and unstable on Huntington's disease chromosomes. Cell. 72 (6), 971-983 (1993).
  3. Scherzinger, E., et al. Huntingtin-encoded polyglutamine expansions form amyloid-like protein aggregates in vitro and in vivo. Cell. 90 (3), 549-558 (1997).
  4. Morley, J. F., Brignull, H. R., Weyers, J. J., Morimoto, R. I. The threshold for polyglutamine-expansion protein aggregation and cellular toxicity is dynamic and influenced by aging in Caenorhabditis elegans. Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 99 (16), 10417-10422 (2002).
  5. Genetic Modifiers of Huntington's Disease Consortium. Electronic address, g. h. m. h. e., Genetic Modifiers of Huntington's Disease, C. CAG Repeat Not Polyglutamine Length Determines Timing of Huntington's Disease Onset. Cell. 178 (4), 887-900 (2019).
  6. Wright, G. E. B., et al. Length of Uninterrupted CAG, Independent of Polyglutamine Size, Results in Increased Somatic Instability, Hastening Onset of Huntington Disease. American Journal of Human Genetics. 104 (6), 1116-1126 (2019).
  7. Cleary, J. D., Ranum, L. P. Repeat-associated non-ATG (RAN) translation in neurological disease. Human Molecular Genetics. 22 (1), 45-51 (2013).
  8. Banez-Coronel, M., Ranum, L. P. W. Repeat-associated non-AUG (RAN) translation: insights from pathology. Laboratory Investigation. 99 (7), 929-942 (2019).
  9. Banez-Coronel, M., et al. RAN Translation in Huntington Disease. Neuron. 88 (4), 667-677 (2015).
  10. Ash, P. E., et al. Unconventional translation of C9ORF72 GGGGCC expansion generates insoluble polypeptides specific to c9FTD/ALS. Neuron. 77 (4), 639-646 (2013).
  11. Kramer, N. J., et al. CRISPR-Cas9 screens in human cells and primary neurons identify modifiers of C9ORF72 dipeptide-repeat-protein toxicity. Nature Genetics. 50 (4), 603-612 (2018).
  12. Boeynaems, S., et al. Drosophila screen connects nuclear transport genes to DPR pathology in c9ALS/FTD. Scientific Reports. 6, 20877(2016).
  13. Jovicic, A., et al. Modifiers of C9orf72 dipeptide repeat toxicity connect nucleocytoplasmic transport defects to FTD/ALS. Nature Neuroscience. 18 (9), 1226-1229 (2015).
  14. Boeynaems, S., et al. Phase Separation of C9orf72 Dipeptide Repeats Perturbs Stress Granule Dynamics. Molecular Cell. 65 (6), 1044-1055 (2017).
  15. Lee, K. H., et al. C9orf72 Dipeptide Repeats Impair the Assembly, Dynamics, and Function of Membrane-Less Organelles. Cell. 167 (3), 717-788 (2016).
  16. Hao, Z., et al. Motor dysfunction and neurodegeneration in a C9orf72 mouse line expressing poly-PR. Nature Communications. 10 (1), 2906(2019).
  17. Scior, A., Preissler, S., Koch, M., Deuerling, E. Directed PCR-free engineering of highly repetitive DNA sequences. BMC Biotechnology. 11, 87(2011).
  18. Mello, C., Fire, A. DNA transformation. Methods in Cell Biology. 48, 451-482 (1995).
  19. Rudich, P., et al. Nuclear localized C9orf72-associated arginine-containing dipeptides exhibit age-dependent toxicity in C. elegans. Human Molecular Genetics. 26 (24), 4916-4928 (2017).
  20. Gidalevitz, T., Krupinski, T., Garcia, S., Morimoto, R. I. Destabilizing protein polymorphisms in the genetic background direct phenotypic expression of mutant SOD1 toxicity. PLoS Genetics. 5 (3), 1000399(2009).
  21. Nollen, E. A., et al. Genome-wide RNA interference screen identifies previously undescribed regulators of polyglutamine aggregation. Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 101 (17), 6403-6408 (2004).
  22. Satyal, S. H., et al. Polyglutamine aggregates alter protein folding homeostasis in Caenorhabditis elegans. Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 97 (11), 5750-5755 (2000).
  23. Boccitto, M., Lamitina, T., Kalb, R. G. Daf-2 signaling modifies mutant SOD1 toxicity in C. elegans. PLoS One. 7 (3), 33494(2012).
  24. Liu, Y., et al. C9orf72 BAC Mouse Model with Motor Deficits and Neurodegenerative Features of ALS/FTD. Neuron. 90 (3), 521-534 (2016).
  25. Peters, O. M., et al. Human C9ORF72 Hexanucleotide Expansion Reproduces RNA Foci and Dipeptide Repeat Proteins but Not Neurodegeneration in BAC Transgenic Mice. Neuron. 88 (5), 902-909 (2015).
  26. O'Rourke, J. G., et al. C9orf72 BAC Transgenic Mice Display Typical Pathologic Features of ALS/FTD. Neuron. 88 (5), 892-901 (2015).
  27. Mizielinska, S., et al. C9orf72 repeat expansions cause neurodegeneration in Drosophila through arginine-rich proteins. Science. 345 (6201), 1192-1194 (2014).
  28. Krajacic, P., Shen, X., Purohit, P. K., Arratia, P., Lamitina, T. Biomechanical profiling of Caenorhabditis elegans motility. Genetics. 191 (3), 1015-1021 (2012).
  29. Zhang, L., Ward, J. D., Cheng, Z., Dernburg, A. F. The auxin-inducible degradation (AID) system enables versatile conditional protein depletion in C. elegans. Development. 142 (24), 4374-4384 (2015).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

C elegans modelrepeat expansieziektenvideosnelheidsanalyseleeftijdsafhankelijke verlammingsanalyseneuronmorfologie analyseRNAi screeningproteasoomsubunit RPN7insuline IGF receptor DAF 2commissuuranalyse

Gerelateerde artikelen