Method Article

Meten RAN Peptide Toxiciteit in C. elegans

DOI:

10.3791/61024

⸱

April 30th, 2020

 ,  ,  , 
1Graduate Program in Cell Biology and Molecular Physiology, University of Pittsburgh, 2Department of Pediatrics, University of Pittsburgh School of Medicine

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Herhaal-geassocieerde niet-ATG-afhankelijke translationele producten zijn opkomende pathogene kenmerken van verschillende herhaalde expansie-gebaseerde ziekten. Het doel van het beschreven protocol is om toxiciteit veroorzaakt door deze peptiden te evalueren met behulp van gedrags-en cellulaire testen in het modelsysteem C. elegans.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

C. elegans wordt vaak gebruikt voor het modelleren van leeftijdsgebonden neurodegeneratieve ziekten veroorzaakt door herhaalde expansiemutaties, zoals Amyotrofische Laterale Sclerose (ALS) en de ziekte van Huntington. Onlangs werd aangetoond dat herhaald expansiebevattend RNA het substraat is voor een nieuw type eiwitvertaling dat herhaal-geassocieerde niet-AUG-afhankelijke (RAN)-vertaling wordt genoemd. In tegenstelling tot canonieke vertaling vereist RAN-vertaling geen startcodon en treedt alleen op wanneer herhalingen een drempellengte overschrijden. Omdat er geen begincodon is om het leeskader te bepalen, vindt RAN-vertaling plaats in alle leesframes van zowel sense- als antisense RNA-sjablonen die een herhalingsuitbreidingsreeks bevatten. Daarom breidt RAN-vertaling het aantal mogelijke ziektegerelateerde toxische peptiden uit van één naar zes. Tot nu toe is ran vertaling gedocumenteerd in acht verschillende repeat expansion-based neurodegeneratieve en neuromusculaire ziekten. In elk geval is het ontcijferen van welke RAN-producten giftig zijn, evenals hun mechanismen van toxiciteit, een cruciale stap in de richting van inzicht in hoe deze peptiden bijdragen aan de pathofysiologie van de ziekte. In dit artikel presenteren we strategieën om de toxiciteit van RAN peptiden in het modelsysteem C. elegans te meten. Ten eerste beschrijven we procedures voor het meten van RAN peptide toxiciteit op de groei en beweeglijkheid van het ontwikkelen van C. elegans. Ten tweede detaileren we een test voor het meten van postontwikkelings-, leeftijdsafhankelijke effecten van RAN peptiden op beweeglijkheid. Ten slotte beschrijven we een neurotoxiciteitstest voor het evalueren van de effecten van RAN-peptiden op neuron morfologie. Deze tests bieden een brede beoordeling van ran peptide toxiciteit en kan nuttig zijn voor het uitvoeren van grootschalige genetische of kleine molecuul schermen om ziekte mechanismen of therapieën te identificeren.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De ongepaste uitbreiding van DNA-herhalingssequenties is de genetische basis voor verschillende neurodegeneratieve ziekten zoals amyotrofische laterale sclerose (ALS), frontotemporale dementie (FTD) en de ziekte van Huntington (ZvH)1. Hoewel er gevestigde cellulaire en dierlijke modellen voor deze ziekten, mechanismen die ten grondslag liggen aan deze voorwaarden zijn niet goed gedefinieerd. De ZvH wordt bijvoorbeeld veroorzaakt door de uitbreidingen van een CAG herhalingssequentie in de coderingssequentie voor het Huntingtine eiwit Htt2. Omdat CAG codeert het aminozuur glutamine, de CAG herhalen expansie resulteert in h....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Het genereren van codon-gevarieerde RAN peptide expressie constructies

  1. Ontwerp de individuele RAN peptide codering sequentie met behulp van synoniem codons om de fundamentele repetitieve DNA / RNA-structuur te elimineren, maar het behoud van de bovenliggende aminozuur sequentie.
  2. Bestel de aangepaste codon sequenties commercieel op de herhalingslengtes die nodig zijn voor de studies (meestal 5-100 herhalingen). Neem een HindIII-beperkingssite op aan het einde van 5 en een BamHI-beperkingssite aan het einde van 3 om het klonen in C. elegans-expressievectoren te vergemakkelijken, zoals pPD95.79.
    OPMERKING: Als de synthese van grotere co....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

We gebruikten de hier beschreven tests om het effect van verschillende genremmingen op de toxiciteit van RAN-dipeptiden te evalueren die worden aangetroffen bij ALS-patiënten met een herhaalexpansie van G4C2. Met behulp van de groeitest om ontwikkelingstoxiciteit te meten, analyseerden we de effecten van verschillende genetische knock-out mutanten die werden geïdentificeerd in een genoombrede RNAi-schermsuppressors van pr50-GFP-toxiciteit met spieruitgedrukt. Terwijl de expressie van PR50-GFP alleen.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hier rapporteren we methoden die kunnen worden gebruikt om RAN peptide toxiciteit gemodelleerd in de spier of in de neuronen van C. elegansassay. Terwijl neurodegeneratieve eiwitten een leeftijd begin fenotype bij menselijke patiënten hebben, kunnen ze ook ontwikkelingstoxiciteit vertonen wanneer overuitgedrukt in modelsystemen. Overexpressie heeft aanzienlijke interpretatieve beperkingen, maar het biedt ook een krachtig uitgangspunt voor genetische of farmacologische schermen gericht op het identificeren van ge.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs hebben niets te onthullen.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

NIH R21NS107797

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
35mm x 10mm Petri Dish, SterileCELLTREAT Scientific Products50-202-036Nematode growth plates and RNAi
AGAR GRANULATED 2KILOGRAMBD DIAGNOSTIC SYSTEMSDF0145070Nematode growth plates and RNAi
AGAROSE ULTRAPURELIFE TECHNOLOGIES16500500Microinjection to generate RAN peptide transgenic strains
CARBENICILLIN 5GTHERMO SCI FAIRLAWN CHEMICALSBP26485Nematode growth plates and RNAi
COVER GLASSES NO 1 22MM 1OZ/PKTHERMO SCI ERIE12542BImaging for commissure assay
FEMOTIPS DISPSBL MICROINJ 20CSEPPENDORF NORTH AMERICA BIOTOOLSE5242952008Microinjection to generate RAN peptide transgenic strains
FF COV GLASS NO1 40X22MM 1OZPKTHERMO SCI ERIE125485CMicroinjection to generate RAN peptide transgenic strains
Fisherbrand Superfrost Plus Microscope SlidesTHERMO SCI ERIE12-550-15Imaging for commissure assay
Gibco Bacto Peptone Gibco DF0118-17-0Nematode growth plates and RNAi
HALOCARBON OIL 700SIGMA-ALDRICH INCH8898-50MLMicroinjection to generate RAN peptide transgenic strains
IPTG BIOTECH 10GTHERMO SCI FAIRLAWN CHEMICALSBP162010Nematode growth plates and RNAi
Leica Advanced Fluorescence imaging softwareLeica MicrosystemsLAS-AFImage acquisition software for video speed analysis and commissure assay
Leica Immersion type N (Oil)W NUHSBAUM INCNC9547002Imaging for commissure assay
LEVAMISOLE HYDROCHLORIDE 10GRTHERMO SCI ACROS ORGANICSAC187870100Imaging for commissure assay
MICROLOADER TIPS 2 X 96 PCSEPPENDORF NORTH AMERICA BIOTOOLSE5242956003Microinjection to generate RAN peptide transgenic strains

PETRI DISH, 60X15MM,500/CS		CORNING LIFE SCIENCES PLASTICFB0875713ANematode growth plates and RNAi
TISSUE CULT PLATE 24WEL 50/CSCORNING LIFE SCIENCES DL87721Nematode growth plates and RNAi

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Cleary, J. D., Ranum, L. P. Repeat associated non-ATG (RAN) translation: new starts in microsatellite expansion disorders. Current Opinion in Genetics and Development. 26, 6-15 (2014).
  2. The Huntington's Disease Collaborative Research Group.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

RAN Peptide ToxicityC elegans ModelRepeat Expansion DisordersVideo Speed AnalysisAge Dependent Paralysis AssayNeuron Morphology AssayRNAi ScreeningProteasome Subunit RPN7Insulin IGF Receptor DAF 2Commissure Assay

Related Articles