Methodenartikel

Productie en karakterisering van menselijke macrofagen uit pluripotente stamcellen

DOI:

10.3791/61038

⸱

16 april 2020

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Centre for Regenerative Medicine, Scottish Centre for Regenerative Medicine, University of Edinburgh, 2Centre for Reproductive Health, The Queen's Medical Research Institute, University of Edinburgh

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit protocol beschrijft de robuuste generatie van macrofagen uit door de mens geïnduceerde pluripotente stamcellen, en methoden voor hun latere karakterisering. Celoppervlaktemarkerexpressie, genexpressie en functionele tests worden gebruikt om het fenotype en de functie van deze iPSC-afgeleide macrofagen te beoordelen.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Macrofagen zijn aanwezig in de meeste gewervelde weefsels en bestaan uit wijd verspreide en heterogene celpopulaties met verschillende functies. Ze zijn belangrijke spelers in gezondheid en ziekte, die als fagocyten tijdens immuunverdediging en bemiddelende trofische, onderhoud, en reparatie functies. Hoewel het mogelijk is geweest om een aantal moleculaire processen die betrokken zijn bij de menselijke macrofaagfunctie te bestuderen, is het moeilijk gebleken om genetische technieken toe te passen op primaire menselijke macrofagen. Dit heeft ons vermogen om de complexe genetische trajecten die betrokken zijn bij macrofaagbiologie te ondervragen aanzienlijk belemmerd en modellen voor specifieke ziektetoestanden te genereren. Een kant-en-klare bron van menselijke macrofagen die vatbaar is voor het enorme arsenaal aan genetische manipulatietechnieken zou daarom een waardevol instrument op dit gebied zijn. We presenteren een geoptimaliseerd protocol dat het mogelijk maakt voor het genereren van macrofagen uit menselijke geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSCs) in vitro. Deze iPSC-afgeleide macrofagen (iPSC-DM's) uitdrukken menselijke macrofaagceloppervlakmarkers, waaronder CD45, 25F9, CD163 en CD169, en onze functionele test voor live-celbeeldvorming toont aan dat ze robuuste fagocytische activiteit vertonen. Gekweekte iPSC-DM's kunnen worden geactiveerd voor verschillende macrofaagtoestanden die veranderde genexpressie en fagocytische activiteit weergeven door de toevoeging van LPS en IFNg, IL4 of IL10. Zo biedt dit systeem een platform om menselijke macrofagen te genereren die genetische veranderingen dragen die specifieke menselijke ziekten modelleren en een bron van cellen voor medicijnscreening of celtherapie om deze ziekten te behandelen.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Embryonale stamcellen (SER's) en geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSCs) vertegenwoordigen een zelfvernieuwende celbron die kan worden gedifferentieerd om cellen van alle drie de kiemlaaglijnen te produceren. Technologieën die het mogelijk maken om menselijke pluripotente stamcellen (PSC's) genetisch te manipuleren, zoals Zinkvinger Nuclease, TALENS en CRISPR-Cas9, hebben een revolutie teweeggebracht in medisch onderzoek1,2,3,4. Genetische manipulatie van menselijke PSC's is een bijzonder aantrekkelijke strategie wanneer de primaire cel van belang moeilijk uit te breiden en/of in vitro te handhaven is, of moeilijk genetisch te manipuleren is, zoals het geval is voor macrofagen5,6,7,8,9. Aangezien menselijke iPSC's kunnen worden afgeleid uit elke somatische cel, omzeilen ze de ethische beperkingen in verband met SPC's en bieden ze een strategie voor het leveren van gepersonaliseerde geneeskunde. Dit omvat patiëntspecifieke ziektemodellering, medicijntesten en autologe celtherapie met een verminderd risico op immuunafstoting en infectie6,8,10,11.

Protocollen die de generatie macrofagen van iPSC's beschrijven, bestaan uit een proces in drie stappen dat: 1) Generatie embryoïnde lichamen omvat; 2) Opkomst van hematopoietische cellen in suspensie; 3) Terminale macrofaagrijping.

De vorming van driedimensionale aggregaten, bekend als embryoid lichamen (EBs) initieert differentiatie van iPSCs. Bot morfogenetisch eiwit (BMP4), stamcelfactor (SCF), en vasculaire endotheliale groeifactor (VEGF) worden toegevoegd om mesoderm specificatie rijden en ondersteuning van opkomende hematopoietische cellen7,8,9,11,12. De differentiërende cellen binnen de EB's starten ook met de activering van endogene signaleringstrajecten zoals Wnt en Activin. Sommige differentiatieprotocollen gaan niet door het stadium van EB-vorming. In deze gevallen worden Wnt- en Activin-signaalregelaars, zoals recombinante menselijke Activin A en/of Chiron, toegevoegd aan de differentiserende iPSC's in een monolayer formaat13,14,15. Hier richten we ons op een protocol dat gebruik maakt van EB-vorming. Voor de tweede stap van differentiatie worden DEB's op een aanhangend oppervlak verguld. Deze bijgevoegde cellen worden vervolgens blootgesteld aan cytokines die de opkomst van suspensiecellen bevorderen die hematopoietische en myeloïde voorlopers bevatten. In deze in vitro kweekomstandigheden ondersteunt interleukine-3 (IL3) waarschijnlijk hematopoietische stam-voorlopercelvorming en proliferatie16,17, evenals myeloïde precursoren proliferatie en differentiatie18. Macrofaagkolonie stimulerende factor (CSF1) ondersteunt de productie van myeloïde cellen en hun differentiatie naar macrofagen19,20. Tijdens de derde fase van differentiatie worden deze suspensiecellen gekweekt in aanwezigheid van CSF1 ter ondersteuning van terminale macrofaagrijping.

De differentiatie van menselijke iPSC's in macrofagen in vitro bootst de vroege golf van macrofaagproductie tijdens ontwikkeling na. Weefsel-ingezeten macrofagen worden vastgesteld tijdens de embryogenese en hebben een duidelijke ontwikkelingsafstamming van volwassen monocyten. Verschillende studies hebben aangetoond dat iPSC-DM's een gensignatuur hebben die meer vergelijkbaar is met foetale lever-afgeleide macrofagen dan bloed-afgeleide monocyten, wat suggereert dat iPSC-DM's zijn meer verwant aan weefsel-resident macrofagen. iPSC-DM's geven hogere niveaus van genen weer die coderen voor de afscheiding van eiwitten die betrokken zijn bij weefselremodellering en angiogenese en drukken lagere niveaus van genen uit die coderen voor pro-inflammatoire cytokineafscheiding en antigeenpresentatieactiviteiten21,22. Bovendien hebben iPSC-DM's een analoge transcriptiefactor die moet worden gesteld aan die van weefsel-resident macrofagen23,24. Met behulp van knock-out iPSC cellijnen die tekort schieten in de transcriptie factoren RUNX1, SPI1 (PU.1), en MYB, Buchrieser et al. bleek dat de generatie van iPSC-DMs is SPI1 en RUNX1 afhankelijk, maar MYB onafhankelijk. Dit geeft aan dat ze transcriptiegelijk zijn aan dooier-zak afgeleide macrofagen die worden gegenereerd tijdens de eerste golf van hematopoiese tijdens ontwikkeling23. Daarom wordt algemeen aanvaard dat iPSC-DM's een meer geschikt celmodel vertegenwoordigen om weefsel-resident macrofagen zoals microglia14,,25 en Kupffer cellen11te bestuderen, en een meer wenselijke bron van cellen die mogelijk kunnen worden gebruikt in therapieën om weefsels te herstellen. Zo is bijvoorbeeld aangetoond dat macrofagen die in vitro werden geproduceerd uit muis-SPC's effectief waren bij het verbeteren van fibrose in een CCl4-geïnduceerd leverletselmodel in vivo11. Bovendien waren deze door ESC afgeleide macrofagen efficiënter dan beenmerg-afgeleide macrofagen bij het herbevolken van Kupffer-celcompartimenten die zijn uitgeput van macrofagen met behulp van liposomale clodronaat11 bij muizen.

Hier beschrijven we serum- en feedervrije protocollen voor het onderhoud, het bevriezen en ontdooien van menselijke iPSC's, en voor de differentiatie van deze iPSC's in functionele macrofagen. Dit protocol is zeer vergelijkbaar met dat beschreven door Van Wilgenburg et al.12, met kleine wijzigingen waaronder: 1) iPSC-onderhoudsmedia; 2) ROCK-remmer wordt niet gebruikt in het EB-formatiestadium; 3) Een mechanische benadering in plaats van een enzymatische benadering wordt gebruikt om uniforme EB's uit iPSC-kolonies te genereren; 4) De methode voor EB oogst en beplating naar beneden is anders; 5) Suspensiecellen worden 2x per week geoogst, in plaats van wekelijks; en 6) Geoogste suspensiecellen worden gekweekt onder CSF1 voor macrofaagrijping gedurende 9 dagen in plaats van 7 dagen. We beschrijven ook protocollen die worden gebruikt om iPSC-afgeleid macrofaagfetype en -functie te karakteriseren, waaronder analyses voor genexpressie (qRT-PCR), celoppervlaktemarkerexpressie (stroomcytometrie) en functionele tests om phagocytose en polarisatie te beoordelen.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

LET OP: Alle reagentia en apparatuur die in dit protocol worden gebruikt, zijn opgenomen in de materiaaltafel. Media moeten op 37 °C voor celcultuur. Media en reagentia die in het differentiatieprotocol worden gebruikt, moeten steriel zijn.

1. Menselijke iPSC-lijn ontdooien en onderhoud

  1. Bereid het celonderhoudsmedium, groeifactoren en andere reagentia voor.
    1. Bereid hESC-serum vrije media (hESC-SFM; zie Materiaaltafel)door dulbecco's gemodificeerde Eagle medium-F12 (DMEM/F12) aan te vullen met hESC-supplement, 1,8% w/v runderserumalbumine (BSA) en 0,1 mM 2-mercapto-ethanol.
    2. Bereid menselijke basisfibroblast groeifactor (bFGF) voorraad oplossing (10 μg/mL) door het oplossen van bFGF in een steriele 0,1% menselijk serum albumine (HSA)-fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS). Verdeel de voorraadoplossing als 200 μL aliquots in cryotubes. Voorraadoplossingen kunnen tot 1 jaar bij -20 °C worden opgeslagen. Na ontdooiing kan voorraad bFGF 7 dagen bij 4 °C worden bewaard.
    3. Bereid Rho kinase remmer (ROCK Inhibitor)-Y27632 voorraad oplossing (1 mg/mL) door het op te lossen in steriel water. Verdeel de voorraadoplossing als 50 μL aliquots in cryotubes. Voorraadoplossingen kunnen tot 1 jaar bij -20 °C worden opgeslagen. Na ontdooiing kan de STOCK ROCK Inhibitor 7 dagen bij 4 °C worden bewaard.
  2. Verdund stamcelsubstraat (zie Tabel der Materialen)1:50 in Dulbecco's fosfaatgebufferde zoutoplossing met calcium en magnesium.
  3. Plaats de verdunde stamcelsubstraatoplossing op kweekplaten zodat het uiteindelijke volume per oppervlakte 78 μL/cm2is. Om de put van een 6-putplaat te coaten, voegt u 750 μL oplossing toe.
  4. De gecoate plaat gedurende 1 uur uitbroeden in een gepoederde atmosfeer bij 37 °C en 5% CO2.
  5. Zuig de stamcelsubstraatcoating aan en voeg 1 mL hESC toe aangevuld met 20 ng/mL bFGF en 10 μM ROCK Inhibitor.
  6. Om een flesje bevroren menselijke iPSC-cellen te ontdooien, de flacon bij 37 °C in te broeden tot ontdooid en de cellen over te brengen in 5 mL hESC-SFM-media.
  7. Centrifugeercellen op 100 x g voor 3 min.
  8. Resuspend in 0.5 mL hESC-SFM aangevuld met 20 ng/mL bFGF en 10 μM ROCK Inhibitor. Breng cellen naar de gecoate goed.
  9. Kweekcellen voor 24 uur.
  10. Verander media naar hESC-SFM aangevuld met 20 ng/mL bFGF, maar zonder ROCK-remmer.
  11. Om de cellen te behouden, verander het medium elke dag totdat de cellen 80% samenvloeiing bereiken. Ongedifferentieerde iPSCs meestal 3-4 dagen duren om 80% samenvloeiing te bereiken.
  12. Zodra de cellen hebben bereikt 80% samenvloeiing, passage cellen.
    1. Vervang besteed kweekmedium door 1,5 mL verse hESC-SFM aangevuld met 20 ng/mL bFGF (zonder ROCK-remmer).
    2. Houd het kweekvat in één hand en rol een wegwerpcelpassagingsgereedschap (zie Tabel van materialen)in één richting over de plaat (d.w.z. van links naar rechts). Alle messen in de rol moeten de plaat raken. Houd een uniforme druk tijdens het rollen.
    3. Herhaal het rollen in dezelfde richting totdat de hele put is afgedekt.
    4. Draai kweekvat 90° en herhaal het rollen zoals beschreven in stappen 1.12.2 en 1.12.3.
    5. Gooi na gebruik passagingsgereedschap weg.
    6. Met een steriele pipet, gebruik media in de put te verjagen gesneden kolonies.
    7. Breng cellen met een 1:4 verhouding op voorgecoate stamcelsubstraatputten (stappen 1.2–1.5) over naar een eindmediavolume (hESC -SFM aangevuld met 20 ng/mL bFGF) van 1,5 mL per put.

2. Bevriezing van de menselijke iPSC-lijn

  1. Om iPSC-cellen te bevriezen, vervangt u media van een 70%-80% confluentgoed van een 6-putplaat met hESC-SFM aangevuld met 20 ng/mL bFGF en 10 μM ROCK Inhibitor.
  2. Goed uitbroeden bij 37 °C en 5% CO2 gedurende 1 uur.
  3. Snijd kolonies met de cel passaging tool en plaats verdreven kolonies in een centrifuge buis.
  4. Centrifugeercellen op 100 x g voor 3 min.
  5. De media aanzuigen en de cellen opnieuw opschorten in 1 mL van celcryopreservatiemedia (zie Tabel van materialen).
  6. Verdeel de cellen gelijkmatig in twee cryovials en plaats ze in een voorgekoelde cel cryopreservatie container op 4 °C.
  7. Bewaar cellen op -80 °C gedurende 24-48 uur.
  8. Breng flacons over naar een vriezer van -135 °C of naar een vloeibare stikstoftank.

3. Menselijke iPSC-differentiatie naar macrofagen

LET OP: Een schematische samenvatting van het macrofaagdifferentiatieprotocol wordt afgebeeld in figuur 1.

  1. Voorbereiding van celdifferentiatiegroeifactoren en andere reagentia
    1. Bereid hESC-SFM media voor (zie vorige sectie).
    2. Bereid 0,1% w/v oplossing van varkensgelatine door het oplossen van de gelatine in steriel water. Gelatineoplossing kan tot 2 jaar bij 4 °C worden bewaard.
    3. Bereid menselijke BMP4-voorraadoplossing (25 μg/mL) voor door BMP4 op te lossen tot een 4 mM waterstofchloride (HCl)-0,2% BSA PBS-oplossing. Verdeel de voorraadoplossing als 50 μL aliquots in cryotubes. Voorraadoplossingen kunnen tot 1 jaar bij -20 °C worden opgeslagen. Na ontdooiing kan voorraad BMP4 5 dagen bij 4 °C worden bewaard.
    4. Bereid de menselijke VEGF-voorraadoplossing (100 μg/mL) voor door VEGF op te lossen tot een BSA PBS-oplossing van 0,2%. Verdeel de voorraadoplossing als 10 μL aliquots in cryotubes. Voorraadoplossingen kunnen tot 1 jaar bij -20 °C worden opgeslagen. Na ontdooiing kan de voorraad VEGF 7 dagen bij 4 °C worden bewaard.
    5. Bereid menselijke SCF-voorraadoplossing (100 μg/mL) voor door SCF op te lossen tot een BSA PBS-oplossing van 0,2%. Verdeel de voorraadoplossing als 5 μL aliquots in cryotubes. Voorraadoplossingen kunnen tot 1 jaar bij -20 °C worden opgeslagen. Na ontdooiing kan voorraad SCF gedurende 10 dagen bij 4 °C worden bewaard.
    6. Bereid de menselijke IL3-voorraadoplossing (10 μg/mL) voor door IL3 op te lossen tot een BSA PBS-oplossing van 0,2%. Verdeel de voorraadoplossing als 500 μL aliquots in cryotubes. Voorraadoplossingen kunnen tot 2 jaar bij -20 °C worden opgeslagen. Na ontdooiing kan voorraad SCF gedurende 15 dagen bij 4 °C worden bewaard.
    7. Bereid menselijke CSF1-voorraadoplossing (10 μg/mL) voor door CSF1 op te lossen tot een BSA PBS-oplossing van 0,2%. Verdeel de voorraadoplossing als 1 mL aliquots in cryotubes. Voorraadoplossingen kunnen tot 2 jaar bij -20 °C worden opgeslagen. Na ontdooiing kan voorraad SCF gedurende 15 dagen bij 4 °C worden bewaard.
    8. Bereid afzonderlijke 10 μg/mL-voorraadoplossingen van interferon-gamma (IFNg), interleukine 4 (IL4) en interleukine 10 (IL10) voor door op te lossen in 0,2% BSA PBS-oplossingen. Bereid lipopolysaccharide (LPS) voor op een voorraadoplossing van (100 U/mL) door op te lossen in een BSA PBS-oplossing van 0,2%. Verdeel elke voorraadoplossing als 35 μL aliquots. Bewaar tot 2 jaar op -80 °C. Na ontdooiing kunnen de voorraden 7 dagen lang bij 4 °C worden opgeslagen.
  2. Fase 1: Generatie embryoïnde lichamen (dag 0-dag 3)
    1. Voeg op dag 0 2,25 mL van Stage 1 media (hESC-SFM aangevuld met 50 ng/mL BMP4, 50 ng/mL VEGF en 20 ng/mL SCF) toe aan twee putten van een ultralage bevestiging 6 putplaat.
    2. Vervang onderhoudsmedia van één 80% confluent goed van iPSC's in een 6-putplaat met 1,5 mL van Stage 1-media.
    3. Snijd kolonies met behulp van de cel passaging tool en overdracht gesneden kolonies met een pipet in de twee putten van een ultralage bevestiging 6 goed plaat (zie Tabel van materialen).
    4. Breng op dag 2 cytokines naar een eindconcentratie van 50 ng/mL BMP4, 50 ng/mL VEGF en 20 ng/mL SCF met behulp van 0,5 mL hESC-SFM media.
      LET OP: IPSC-kolonies worden EB's (figuur 2A).
  3. Fase 2: Opkomst van hematopoietische cellen in suspensie
    1. Op dag 4, laag 4 putten van een 6 goed weefsel kweekplaat met 0,1% w / v gelatine en incuberen voor ten minste 10 min.
    2. Verwijder gelatine en voeg 2,5 mL stage 2-media toe (X-VIVO15 aangevuld met 100 ng/mL CSF1, 25 ng/mL IL-3, 2 mM glutamax, 1% penicilline-streptomycine en 0,055 mM 2-mercaptoethanol).
    3. Verzamel gevormde EB's in een centrifugebuis van 50 mL en laat ze zich door de zwaartekracht onderaan de buis nestelen. Voorzichtig de media aantezuigen.
    4. Resuspend EBs in 2 mL van Stage 2 media.
    5. Breng 10-15 GB (niet meer dan 15) over naar een met gelatine bedekte put met 2,5 mL van fase 2-media.
    6. EB's uitbroeden bij 37 °C en 5% CO2-lucht.
    7. Verander de media op vergulde EB's elke 3-4 dagen gedurende 2-3 weken.
    8. Na 2-3 weken beginnen de EU-cellen met het vrijgeven van niet-hangende hematopoïetische cellen in suspensie.
      LET OP: Deze periode van suspensie cel release kan variëren en is cellijn afhankelijk. Cellen in deze suspensie kunnen worden geoogst en gerijpt tot macrofagen (zie fase 3) (figuur 2A).
  4. Fase 3: Terminale macrofaagrijping
    1. Verzamel vering hematopoietische cellen en vul media (Fase 2 media) op EB plaat.
    2. Centrifugeercellen op 200 x g voor 3 min.
    3. Schorsingscellen opnieuw opschorten in fase 3-media (X-VIVO15 aangevuld met 100 ng/mL CSF1, 2 mM glutamax en 1% penicilline-streptomycine).
    4. Plaat verzameld en gesponnen cellen op onbehandeld plastic 10 cm bacteriologische-grade platen (10 mL) of ongecoat 6 goed weefsel cultuur platen (3 mL) bij een dichtheid van 0,2 x 106 cellen /mL.
    5. Bewaar cellen in fase 3-media gedurende 9-11 dagen en verander elke 5 dagen van media.
      LET OP: Stappen 3.4.1–3.4.5 van fase 3 kunnen elke 3-4 dagen worden herhaald en suspensiecellen die gedurende maximaal 3 maanden van de originele EB-plaat worden geoogst.
  5. Macrofaagpolarisatie
    1. Om macrofagen te activeren tot een M(LPS + IFNg) fenotype, stimuleert u de cellen met LPS (eindconcentratie: 100 ng/mL) en IFNg (eindconcentratie: 10 U/mL) gedurende 48 uur. Om cellen te activeren tot een M(IL4) fenotype, stimuleert u cellen met IL4 (eindconcentratie: 20 ng/mL). Om te activeren tot een M(IL10) fenotype, stimuleer macrofagen met IL10 (eindconcentratie: 5 ng/mL).

4. IPSC-afgeleide macrofagen kwaliteitscontrole Controle

  1. Bepaal het aantal hematopoietische suspensiecellen geproduceerd per 6 putplaat van B's door ze te tellen met een hematocytometer.
  2. Macrofaagmorfologie zoals eerder beschreven (bijvoorbeeld commerciële kitkleuring)8,9.
  3. Detecteer de expressie van macrofaagspecifieke markers en polarisatiemarkers met behulp van genexpressieanalyses en stroomcytometrie zoals eerder beschreven8,9.
    1. Voor stroomcytometrie experimenten op een put van een 6 goed plaat van macrofagen, oogst cellen door aspirating hun rijping media, wassen met 2 mL van PBS, en incubeeren ze met 2 mL van enzym vrije cel dissociatie buffer voor 5 min bij kamertemperatuur (RT). Pipetteer herhaaldelijk op en neer om macrofagen los te maken en te oogsten.
    2. Tel cellen met een hematocytometer en storing ze opnieuw op in 80 μL van een BSA van 2%, 0,5 mM ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)-PBS-oplossing.
    3. Voeg 20 μL MACS menselijke FC-blokker toe.
    4. Incubeer op ijs gedurende 20 min en bescherm tegen licht.
    5. Voeg een passend volume van 2% BSA, 0,5 mM EDTA PBS-oplossing toe om de celconcentratie op 1 x 106 macrofagen/mL te brengen.
    6. Vlek 1 x 105 cellen in 100 μL van 2% BSA, 0,5 mM EDTA PBS-oplossing met overeenkomstige antilichaam (zie NOOT hieronder) en incubeer gedurende 15 min bij RT beschermd tegen licht.
    7. Was 1x met ten minste 100 μL van 2% BSA, 0,5 mM EDTA PBS.
    8. De cellen opnieuw opschorten in 200 μL van 2% BSA, 0,5 mM EDTA PBS.
    9. Voeg 4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI, verdund 1:1.000) toe als een levende dode kleurstof. Incubeer 3 min.
    10. Voor stroomcytometrie analyses, poort op de belangrijkste populatie, dan enkele cellen, en vervolgens levende cellen. Op de levende celpopulatie is macrofaaggerelateerde markerexpressie zichtbaar (figuur 3A).
      LET OP: Antilichamen moeten zorgvuldig worden getitreerd voor elke cellijn die wordt gebruikt om macrofagen af te leiden. Antilichamen die in de resultatensectie worden gepresenteerd, staan in de Materiaaltafel. De verdunningsfactor voor SFCi55-afgeleide macrofagen stromen cytometrietesten is ook opgenomen.

5. Hoge doorvoer Phagocytose Assay

  1. Oogst iPSC-afgeleide macrofagen (iPSC-DMs) door de media te aspiiseren, ijskoude enzymvrije celdissociatiebuffer toe te voegen en gedurende 5 min uit te broeden. Verzamel macrofagen door herhaaldelijk te pipetteren.
  2. Plaat 8 x 104 iPSC-DM's in een put van een beeldweefselkweek graad 96 goed platen (bijvoorbeeld Cellcarrier Ultra, Perkin Elmer) ten minste 2 dagen voor hoge doorvoer beeldvorming in 200 μL van Fase 3 media.
  3. Bereid pHrodoGreen Zymosan-A Bioparticles voor door één flesje in 2 mL PBS ("Oplossing 1") opnieuw op te schorten. Vortex oplossing voor 10 s.
  4. Verdun de 2 mL PBS kraalvering 1:5 met meer PBS ("Oplossing 2").
  5. Sonicate Solution 2 voor 8 s en vortex oplossing voor 10 s. Houd het op 4 °C. Deze oplossing zal worden gebruikt in stap 5.11.
  6. Verwijder de media op vergulde iPSC-DM's en was met PBS.
  7. Vlek iPSC-DMs met een PBS-oplossing met Hoechst 33342 verdund 1:20. Incubatie gedurende 20 min bij 37 °C.
  8. Was cellen met PBS.
  9. Vlek met een PBS-oplossing met dieprode plasmamembraanvlek verdund 1:1.000 (zie Tabel van materialen). Incubatie gedurende 30 min bij 37 °C.
  10. Was cellen met PBS.
  11. Voeg 100 μL kraaloplossing op 4 °C toe aan elke put van iPSC-DM's. De platen zijn nu klaar voor beeldvorming.
  12. Beeld de plaat met behulp van een hoog gehalte imaging systeem en verwerven van drie of meer velden in de put om een goede weergave van de put te verkrijgen.
  13. Kwantificeren phagocytose met behulp van Columbus software (High-Content Imaging analysis system software). Een specifiek algoritme kan worden ontwikkeld voor eenduidige beeldbatchanalyse:
    1. Meet de blauwe intensiteit en definieer in de software dat blauw signaal de kernen aangeeft.
    2. Meet de rode intensiteit en definieer in de software dat rood signaal het cytoplasma aangeeft.
    3. Definieer dat kern en cytoplasma samen overeenkomt met een cel.
    4. Meet de groene intensiteit in de cellen en stel een strikte cut-off/drempelwaarde vast om een cel als fagocytisch te beschouwen.
    5. Kwantificeer de fagocytische celfractie en de gemiddelde fagocytische index per cel. Omdat de kleurintensiteit van de kraal evenredig is met het aantal kralen, kan de ftagocytische activiteit worden gemeten aan de slag met het aantal kralen.
    6. Pas het algoritme/de pijplijn toe op alle afbeeldingen binnen elk veld en op alle verworven tijdspunten, waardoor een robuuste en onbevooroordeelde batchbenadering mogelijk is om de fagocytische mogelijkheden van cellen te bepalen.
      LET OP: Columbus is een high-content analyse software, die celsegmentatie analyse biedt voor cel fenotypering en functionele testen.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Differentiatieprogressie, macrofaaggetal en morfologie
De gepresenteerde resultaten zijn afkomstig van de differentiatie van de SFCi55 human iPSC-lijn die is beschreven en gebruikt in een aantal studies8,9,10,26. Het proces van IPSC-differentiatie naar macrofagen kan worden gevolgd door optische microscopie. iPSC-kolonies, embryoïnde lichamen (EB's), hematopoïetische suspensiecellen en volwassen macrofagen waren morfologisch verschillend (figuur 2A). Volwassen macrofaagmorfologie kan verder worden gevalideerd door kleuring van gecentrifugeerde cytospinpreparaten. IPSC-afgeleide macrofagen waren groot, en had enkele kleine ovale kernen en overvloedige cytoplasma met veel blaasjes (Figuur 2B).

De eerste 2 weken van hematopoietische suspensiecellen oogsten (dagen 16-28) van een volledige 6 putplaat van EB's bevatte, gemiddeld, 2,59 x 106 ± 0,54 cellen. Na dag 28 werden gemiddeld 4,64 x 106 ± 0,94 van de suspensiecellen per 6 putplaat van EB's geproduceerd. Vanaf dag 80 begon het aantal suspensiecellen te dalen naarmate de E's uitgeput raken(figuur 2C). Het wordt aanbevolen om het differentiatieprotocol te stoppen nadat de getallen onder de 3 x 106 precursoren per oogst per 6 putplaat van EB's zijn gedaald.

Ipsc-afgeleide macrofaagceloppervlaktemarkeringenexpressie
Flow cytometrie blijft de meest gebruikte methode om het fenotype van menselijke macrofagen te beoordelen. De gating strategie om celoppervlak marker expressie te beoordelen bestaat uit gating de belangrijkste populatie van cellen met behulp van fysieke parameters zoals grootte en granulariteit, gevolgd door gating enkele cellen en vervolgens levende cellen (Figuur 3A). Volwassen iPSC-afgeleide macrofagen moeten de afstammingsmarkering CD45 en macrofaagrijpingsmarker 25F9 uitdrukken en negatief zijn voor monocyten/onrijpe macrofaagmarker CD93. Dit komt overeen met onze opmerkingen(figuur 3A). IPSC-afgeleide macrofagen waren ook positief voor lineage myeloïde markers CD11b, CD14, CD43, CD64, CD115, CD163 en CD169 (Figuur 3B). Ze waren positief voor immuunmodulatie marker CD86, en een klein deel van hen uitgedrukt chemokine receptoren CX3CR1, CCR2, CCR5, en CCR8 op de naïeve toestand (Figuur 3B). De percelen zijn verkregen uit gegevens die eerder door ons laboratorium8 zijngepubliceerd.

iPSC-afgeleide macrofagen faagocytose en polarisatie
Een van de belangrijkste kenmerken van macrofagen in host verdediging en weefsel homeostase is hun vermogen om pathogenen, apoptotische cellen, en puin27. Het tarief van phagocytose is nauw verbonden met specifieke fenotypische toestanden28. Om iPSC-DM fagocytische vermogen te evalueren, gebruikten we een hoog gehalte imaging systeem aanpak8,9,11 dat gebruik maakt van de PerkinElmer Operette Microscoop en pHrodo Zymosan bioparticles (pH-gevoelige kleurstof conjugaten). Biodeeltjes waren niet fluorescerend wanneer toegevoegd aan de culturen (Figuur 4A), maar gefluoreerd helder groen in de intracellulaire zure pH (Figuur 4B). De live-imaging Operette microscoop werd ingesteld op beeld om de 5 min na de toevoeging van kralen voor een totale tijd van 175 min. Een hoge doorvoer en onpartijdige beeldanalyse pijplijn werd vervolgens gebruikt in de Columbus platform om activiteit te kwantificeren in termen van de fagocytische fractie die het aandeel van de cellen die phagocytosed kralen en de phagocytische index dat is een maat van het aantal kralen die elke cel ingenomen vertegenwoordigt vertegenwoordigt.

Macrofagen kunnen reageren en veranderen hun fenotype, afhankelijk van milieusignalen. Om hun vermogen om te reageren en te veranderen op omgevingsstimuli te beoordelen, kunnen iPSC-DM's worden behandeld met LPS en IFNg, IL4 of IL10. Na 48 uur behandeling veranderden ze het fenotype, hierin aangeduid als M (LPS + IFNg), M (IL4) en M (IL10), respectievelijk29. Genexpressieanalyse is een nuttig hulpmiddel om de polarisatiestatus van macrofagen te testen. Bij LPS en IFNg stimulatie, macrofagen upregulated mRNA expressie van genen CD40, VCAM1, en TNFA (Figuur 5A). Bij IL4 stimulatie, cellen upregulated mRNA expressie van genen CD68, CD84, en MRC1 (Figuur 5B). Na IL10 stimulatie, iPSC-DMs upregulated expressie van MRC1 (Figuur 5B). In termen van fagocytose, macrofagen behandeld met LPS + IFNg of IL4 toonde een aanzienlijk lager percentage van phagocytische cellen in vergelijking met naïeve macrofagen. iPSC-DM's behandeld met IL10 vertoonden een verhoogd percentage fagocytische cellen en fagocytische index (Figuur 5C–E).

figure-results-1
Figuur 1: Grafische samenvatting van iPSC-differentiatie tot volwassen functionele macrofagen. Diagram getekend met Biorender. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

figure-results-2
Figuur 2: iPSC-differentiatie naar macrofagen en iPSC-DM-getal en morfologie. (A) Bright Field-beelden verkregen van (van links naar rechts): een IPSC-kolonie, embryoïde lichamen (EB's), geoogste suspensiecellen en volwassen macrofagen. Schaalbalk = 100 μm. (B) Afbeelding van macrofaag cytospins gekleurd met Kwik-diff kit. Schaalbalk = 25 μm. (C) Aantal opspenen per oogst per 1 6 putplaat van DE B. Plotshows betekenen + SEM; (n = 6 biologisch onafhankelijke experimenten). Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

figure-results-3
Figuur 3: Macrofaagceloppervlakmarker fenotype. (A) Gating strategie voor de analyse van volwassen iPSC-afgeleide macrofagen. Enkele, levende cellen werden omheind en vervolgens geanalyseerd op de expressie van celoppervlaktemarkers CD45, CD93 en 25F9. Poorten voor de celoppervlak markeringen werden getrokken met behulp van fluorescentie minus een (FMO) controles. (B) Representatieve stroomcytometrie histogrammen voor enkele vlekken van iPSC-DMs (blauw) en isotype controles (grijs) voor afstamming en myeloïde markers, immuunmodulatie markers, rijping markers, en chemokine receptoren. Percelen zijn representatief voor n = 5 biologisch onafhankelijke experimenten voor alle afstammings- en myeloïde markers, met uitzondering van CD105 en CD206 (n = 3); rijpingsmarkeringen (n = 5); immuunmodulatiemarkers (n = 3); en chemokinereceptoren (n = 3). Plots gebruiken eerder gepubliceerde gegevens8. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

figure-results-4
Figuur 4: IPSC-DM polarisatie en phagocytose testen. Representatieve afbeeldingen van iPSC-DM's (A) onmiddellijk na de toevoeging van Zymosan pHrodo groene kralen en (B) 175 min na de toevoeging van kralen. Blauw vertegenwoordigt de kernen van de cellen; rood staat voor het cytoplasma van de cellen. Groen staat voor ingenomen kralen (Schaalbalk = 20 μm). (C) Fractie van fagocytische macrofagen en (D) phagocytische index/groene intensiteit per fagocytische macrofaag in de naïeve toestand (n = 6 biologisch onafhankelijke experimenten). Plots tonen de gemiddelde waarde en de balken vertegenwoordigen de SEM. Plots gebruiken eerder gepubliceerde gegevens8. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

figure-results-5
Figuur 5: Evaluatie van iPSC-DM polarisatiestaten. Relatieve kwantificering van RT-PCR-analyses van naïeve en gepolariseerde iPSC-DM's om de expressie van (A) M(LPS+IFNΥ) te beoordelen; b) M(IL4) en M (IL10)-geassocieerde genen (n = 6 biologisch onafhankelijke experimenten; One-way ANOVA en Holm-Sidak's meerdere vergelijkingen na de test. Gepolariseerde groepen werden statistisch vergeleken met alleen de naïeve groep). In plots wordt de gemiddelde waarde weergegeven en de foutbalken de standaarddeviatie. ND in plots = transcript niet gedetecteerd. Gegevens voor deze percelen werden eerder gepubliceerd8. (C) Representatieve afbeeldingen van iPSC-DM's 175 min na de toevoeging van pHrodo-kralen van iPSC-DM's behandeld met (van links naar rechts): geen cytokines, LPS+IFN-Y, IL-4 en IL-10 (Schaalbalk = 20 μm). dD) Fractie van fagocytische macrofagen en (E) fagocytische index/groene intensiteit per fagocytische macrofaag in naïeve en gepolariseerde macrofaagbehandelingen 175 min na toevoeging van kralen (n = 12 biologisch onafhankelijke experimenten, eenrichtingsANOVA en Holm-Sidak's meervoudige vergelijkingen na de test. Gepolariseerde groepen werden statistisch vergeleken met alleen de naïeve groep). Plots geven de gemiddelde waarde weer en de foutbalken vertegenwoordigen de standaarddeviatie (*p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001, ****p < 0,0001). Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Het protocol voor de productie van hier beschreven iPSC-DM's is robuust en maakt de productie van een groot aantal homogene cellen uit een relatief klein aantal iPSC's mogelijk. Na de eerste differentiatie van ongeveer 1 x 106 iPSCs, kunnen de volgende culturen om de 4 dagen gedurende maximaal 2-3 maanden worden geoogst, wat resulteert in de productie van ten minste 6,5 x 107 macrofagen over die tijd. Deze in vitro gegenereerde menselijke macrofagen zijn morfologisch vergelijkbaar met primaire menselijke macrofagen, drukken de belangrijkste macrofaagceloppervlaktemarkers uit en vertonen faagocytische activiteit. Het protocol voor macrofaagdifferentiatie is reproduceerbaar en kan worden toegepast op andere hiPSC- en hESC-cellijnen, maar de precieze timing van de eerste oogst van de macrofaagprecursoren en de absolute aantallen cellen die kunnen worden gegenereerd, varieert tussen iPSC-lijnen.

Het is aangetoond dat macrofagen kunnen worden gegenereerd uit iPSC's die genetisch gemanipuleerd zijn. Zo werd een transgene cassette bestaande uit de fluorescerende reporter ZsGreen onder de controle van de constitutieve CAG promotor ingevoegd in de AAVS1 locus van de SFCi55 iPSC lijn, en vervolgens werd aangetoond dat deze iPSC lijn kan worden gedifferentieerd in ZsGreen-expressing macrofagen8. Deze fluorescerende macrofagen zouden in de toekomst kunnen worden gebruikt om de migratie en stabiliteit van therapeutische macrofagen in ziektemodellen bij te houden. In een andere studie, macrofagen werden gegenereerd uit een iPSC lijn die genetisch was gemanipuleerd om een tamoxifen-geïnduceerde transcriptie factor, KLF1 uit te drukken. Activering van KLF1 in iPSC-afgeleide macrofagen resulteerde in de productie van macrofagen met een fenotype vergelijkbaar met macrofagen van het erythroid-eiland9. Potentieel, deze strategie kan worden gebruikt om genetisch programma iPSC-afgeleide macrofagen in fenotypes geassocieerd met andere weefsel-specifieke macrofaag populaties zoals Kupffer cellen van de lever of Langerhans cellen van de huid. Dit zou mogelijk zijn zodra de belangrijkste transcriptiefactoren die deze celtypen definiëren, zijn geïdentificeerd.

In termen van het protocol, is het zeer belangrijk op te merken dat de toestand van de startende bevolking van iPSCs is van cruciaal belang voor een succesvolle differentiatie. Menselijke iPSC culturen kunnen worden overspoeld met karyotypicals abnormale subpopulaties over verschillende passages, dus robuuste curatie van iPSC voorraden en grote batch master voorraden onderworpen aan genoom kwaliteitscontrole wordt aanbevolen. In onze handen kunnen de hier beschreven onderhoudsprotocollen karyotypicalnormal icps voor maximaal 2 maanden in continue cultuur handhaven, maar dit kan variëren voor verschillende cellijnen en in verschillende laboratoria. Als er problemen worden ondervonden, is het raadzaam om voor elk differentiatie-experiment een vers flesje ongedifferentieerde iPSC's te gebruiken. Bovendien mag de startcultuur van ongedifferentieerde iPSC's niet meer dan 80% confluent zijn. In de EB-beplatingsfase mogen slechts 10-15 EB's per put van een 6-putweefselkweekplaat worden verguld, en het is van cruciaal belang dat deze EB's gelijkmatig over de put worden verspreid. Een hoger aantal B's en/of klonteren van B's in het midden van de put had een negatief effect op het aantal gegenereerde macrofagen. Er moet voor worden gezorgd dat de media worden aangevuld en monocytenachtige suspensiecellen uit de EB-culturen worden geoogst om te voorkomen dat de hechting van DEB's aan het oppervlak van de gecoate kweekplaten wordt verstoord. Het aantal geproduceerde hematopoïetische suspensiecellen neemt geleidelijk toe bij elke oogst, met een optimale productie tussen dag 40-72 van differentiatie (figuur 2). De productie daalt geleidelijk na dag 68 en platen hebben de neiging om na 2,5 maanden uit te putten, hoewel de precieze timing kan variëren afhankelijk van de iPSC-lijn.

Een beperking van ons protocol is dat het niet mogelijk is geweest om de hematopoietische suspensiecellen die aan het einde van fase 2 zijn gegenereerd, cryopreserve. Protocollen die vertrouwen op de exogene activering van WNT rapport over een 40% herstel tarief na cryopreservatie, maar deze protocollen verslag slechts een cel oogst, dus het absolute aantal macrofagen gegenereerd is laag30. Het hier beschreven protocol, dat endogene signalering via de vorming van B's induceert, kan tweewekelijks worden geoogst, wat een veel hogere totale macrofaagopbrengst oplevert.

Samengevat presenteren we een gedetailleerd protocol voor de productie van functionele iPSC-afgeleide macrofagen. Het opzetten van in vitro experimenten met iPSC-afgeleide macrofagen om macrofaagbiologie in gezondheid en ziekte te bestuderen heeft vele voordelen ten opzichte van experimenten met monocyten afgeleide macrofagen (MDM's). Deze voordelen omvatten het gemak van toegankelijkheid van het materiaal (bijvoorbeeld geen donoren zijn vereist), zeer grote hoeveelheden macrofagen kunnen worden geproduceerd, en het is haalbaar en relatief eenvoudig om genetisch gemodificeerde macrofagen te produceren. Bovendien, iPSC-afgeleide macrofagen zou kunnen worden betere bron voor de studie van weefsel-resident macrofaag biologie.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs hebben geen belangenconflicten te verklaren.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wij danken Fiona Rossi en Claire Cryer voor hulp bij flow cytometrie, Eoghan O'Duibhir en Bertrand Vernay met microscopie. Dit werk werd gefinancierd door CONACYT (M.L.-Y.), Wellcome Trust (102610) en Innovate UK (L.M.F), Wellcome Trust PhD studentship (A.M),MRC Precision Medicine Studentship (T.V). L.C. en J.W.P. werden ondersteund door Wellcome Trust (101067/Z/13/Z), Medical Research Council (MR/N022556/1) en COST Action BM1404 Mye-EUNITER (http://www.mye-euniter.eu).

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
2-Mercaptoethanol (50 mM)Invitrogen31350010
Abtibody CD64-APC -CY7Biolegend305026Verdunningsfactor: 1:100
Antibody 25F9-EFLUOR 660Ebioscience15599866Verdunningsfactor: 1:20
Antibody CCR2-PE-Cy7Biolegend357212Verdunningsfactor: 1:100
Antibody CCR5 PEBiolegend313707Verdunningsfactor: 1:100
Antibody CCR8 PEBiolegend360603Verdunningsfactor: 1:100
Antibody CD11b-PEBiolegend301305Verdunningsfactor: 1:50
Antibody CD14-APCEbioscience10669167Verdunningsfactor: 1:20
Antibody CD163-PE-CY7BIolegend333614Verdunningsfactor: 1:25
Antibody CD169-APCBiolegend346007Verdunningsfactor: 1:25
Antibody CD206-PEBiolegend321106Verdunningsfactor: 1:100
Antibody CD209-PE-CY7Biolegend3310114Verdunningsfactor: 1:100
Antibody CD274-PE-CY7Biolegend329718Verdunningsfactor: 1:100
Antibody CD43-PEEbioscience10854419Verdunningsfactor: 1:100
Antibody CD45-APCEbioscience15577936Verdunningsfactor: 1:20
Antibody CD86-APCBiolegend305412Verdunningsfactor: 1:100
Antibody CD93-PEEbioscience10804637Verdunningsfactor: 1:100
Antibody CX3CR1-PEBiolegend307650Verdunningsfactor: 1:100
Antibody HLA-DR-BV650Biolegend307650Verdunningsfactor: 1:100
Antiboy CD115-PEBiolegend347308Verdunningsfactor: 1:40
Cell Dissociation Buffer, enzyme freeThermofisher13151014
Cell Dissociation Buffer, enzyme-free, PBSGibco13151014
CellCarrier-96 Ultra Microplates, tissue culture treated, black, 96-wellPerkinElmer6055302
CellMask Deep Red Plasma Membrane StainThermofisherC10046Cryopreserveringsmedium
Cryostor CS10SigmaC2874
CTS CELLstart SubstrateInvitrogenA1014201Stamceldachtige
DAPIMerckD9542-1MGEindconcentratie 1 μg/mL
DPBS, calcium, magnesium (500 mL)Thermofisher14040091
FcR Blocking Reagent, humanMACS Miltenyi Biotec130-059-901
FGF-Basic (AA 10-155) Recombinant Human ProteinThermofisherPHG0021
GlutaMAX SupplementThermofisher35050061
Human Recombinant IFNYThermofisher14-8319-80
Human Serum AlbuminumIrvine Scientific9988
Lipopolysaccharide (LPS) from E. ColiSigmaL2630
NucBlue (Hoechst33342)ThermofisherR37605
pHrodo Green Zymosan Bioparticles Conjugate for PhagocytosisThermofisherP35365
Porcine Skin GelatinSigmaG9136
Recombinant Human BMP4 ProteinR&D314-BP-010
Recombinant Human IL10Preprotech200-10
Recombinant Human IL3Preprotech200-03-10
Recombinant Human IL4Preprotech200-04
Recombinant Human MCSF (carrier-free) 100 μgBiolegend574806
Recombinant Human VEGF ProteinR&D293-VE-010
Rock Inhibitor Y-27632MerckSCM075
SCF (C-Kit Ligand) Recombinant Human ProteinThermofisherPHC2111
StemPro hESC SFMThermofisherA1000701
StemPro EZPassage Disposable Stem Cell Passaging ToolThermofisher23181010
Ultralow attachment plates: Cell culture multi-well plate, 6 well, cell star cell repellent surfaceGreiner657970
UltraPure 0.5 M EDTA, pH 8.0Invitrogen15575020
X-Vivo 15 500 mL bottleLonzaBE02-060F

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Takahashi, K., et al. Induction of Pluripotent Stem Cells from Adult Human Fibroblasts by Defined Factors. Cell. 131 (5), 861-872 (2007).
  2. Shi, Y., Inoue, H., Wu, J. C., Yamanaka, S. Induced pluripotent stem cell technology: a decade of progress. Nature Reviews Drug Discovery. 16 (2), 115-130 (2017).
  3. Focosi, D., Amabile, G. Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Red Blood Cells and Platelet Concentrates: From Bench to Bedside. Cells. 7 (1), (2017).
  4. Inoue, H., Nagata, N., Kurokawa, H., Yamanaka, S. IPS cells: A game changer for future medicine. EMBO Journal. 33 (5), 409-417 (2014).
  5. Lachmann, N., et al. Large-Scale Hematopoietic Differentiation of Human Induced Pluripotent Stem Cells Provides Granulocytes or Macrophages for Cell Replacement Therapies. Stem Cell Reports. 4 (2), 282-296 (2015).
  6. Kuhn, A., et al. TALEN-mediated functional correction of human iPSC-derived macrophages in context of hereditary pulmonary alveolar proteinosis. Scientific Reports. 7 (1), 1-11 (2017).
  7. Ackermann, M., et al. Ex vivo Generation of Genetically Modified Macrophages from Human Induced Pluripotent Stem Cells. Transfusion Medicine and Hemotherapy. 44 (3), 135-142 (2017).
  8. Lopez-Yrigoyen, M., et al. A human iPSC line capable of differentiating into functional macrophages expressing ZsGreen: A tool for the study and in vivo tracking of therapeutic cells. Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 373 (1750), (2018).
  9. Lopez-Yrigoyen, M., et al. Genetic programming of macrophages generates an in vitro model for the human erythroid island niche. Nature Communications. 10 (1), 881(2019).
  10. Cassetta, L., et al. Human Tumor-Associated Macrophage and Monocyte Transcriptional Landscapes Reveal Cancer-Specific Reprogramming, Biomarkers, and Therapeutic Targets. Cancer Cell. 35 (4), 588-602 (2019).
  11. Haideri, S. S., et al. Injection of embryonic stem cell derived macrophages ameliorates fibrosis in a murine model of liver injury. NPJ Regenerative Medicine. 2, 1-10 (2017).
  12. van Wilgenburg, B., Browne, C., Vowles, J., Cowley, S. A. Efficient, long term production of monocyte-derived macrophages from human pluripotent stem cells under partly-defined and fully-defined conditions. PLoS One. 8 (8), 71098(2013).
  13. Pandya, H., et al. Differentiation of human and murine induced pluripotent stem cells to microglia-like cells. Nature Neuroscience. 20 (5), 753-759 (2017).
  14. Douvaras, P., et al. Directed Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells to Microglia. Stem Cell Reports. 8 (6), 1516-1524 (2017).
  15. Heideveld, E., et al. Methods for macrophage differentiation and in vitro generation of human tumor associated-like macrophages. Methods in Enzymology. , 1-18 (2019).
  16. Leary, A. G., et al. Synergism between interleukin-6 and interleukin-3 in supporting proliferation of human hematopoietic stem cells: comparison with interleukin-1 alpha. Blood. 71 (6), 1759-1763 (1988).
  17. Robin, C., et al. An Unexpected Role for IL-3 in the Embryonic Development of Hematopoietic Stem Cells. Developmental Cell. 11 (2), 171-180 (2006).
  18. Moldenhauer, A. Hematopoietic progenitor cells and interleukin-stimulated endothelium: Expansion and differentiation of myeloid precursors. BMC Immunology. 9, 56(2008).
  19. Kodama, H., Nose, M., Shumpei Niida, S., Yarnasakit, A. Essential Role of Macrophage Colony-Stimulating Factor in the Osteoclast Differentiation Supported by Stromal Cells. Brief Definitive Report. , 1291-1294 (1991).
  20. Bender, A. T., Ostenson, C. L., Giordano, D., Beavo, J. A. Differentiation of human monocytes in vitro with granulocyte-macrophage colony-stimulating factor and macrophage colony-stimulating factor produces distinct changes in cGMP phosphodiesterase expression. Cellular Signalling. 16 (3), 365-374 (2004).
  21. Klimchenko, O., et al. Monocytic cells derived from human embryonic stem cells and fetal liver share common differentiation pathways and homeostatic functions. Blood. 117 (11), 3065-3075 (2011).
  22. Alasoo, K., et al. Transcriptional profiling of macrophages derived from monocytes and iPS cells identifies a conserved response to LPS and novel alternative transcription. Scientific Reports. , August 1-15 (2015).
  23. Buchrieser, J., et al. Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Macrophages Share Ontogeny with MYB-Independent Tissue-Resident Macrophages. Stem Cell Reports. 8 (2), 334-345 (2017).
  24. Vanhee, S., et al. In vitro human embryonic stem cell hematopoiesis mimics MYB-independent yolk sac hematopoiesis. Haematologica. 100 (2), 157-166 (2015).
  25. Abud, E. M., et al. iPSC-Derived Human Microglia-like Cells to Study Neurological Diseases. Neuron. 94 (2), 278-293 (2017).
  26. Yang, C. -T., et al. Activation of KLF1 Enhances the Differentiation and Maturation of Red Blood Cells from Human Pluripotent Stem Cells. Stem Cells. 35 (4), 886-897 (2017).
  27. Karavitis, J., Kovacs, E. J. Macrophage phagocytosis: effects of environmental pollutants, alcohol, cigarette smoke, and other external factors. Journal of Leukocyte Biology. 90 (6), 1065-1078 (2011).
  28. Sica, A., Mantovani, A. Macrophage plasticity and polarization: in vivo veritas. The Journal of Clinical Investigation. 122 (3), 787-795 (2012).
  29. Murray, P. J., et al. Macrophage Activation and Polarization: Nomenclature and Experimental Guidelines. Immunity. 41 (1), 14-20 (2014).
  30. Cao, X., et al. Differentiation and Functional Comparison of Monocytes and Macrophages from hiPSCs with Peripheral Blood Derivatives. Stem Cell Reports. 12, 1282-1297 (2019).

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

iPSC afgeleide macrofagenflowcytometriefagocytische activiteitceldifferentiatiegenetische manipulatieCD45 marker25F9 markerhigh content imaging

Gerelateerde artikelen